全 文 ：2014年第10期
摘要：CBF1转录因子能调控一组抗干旱、抗低温基因的表达，更有效地提高植物抗干旱、抗低温的能力。以抗寒性
较强的长白山野生山丁子 （耐 -42℃低温） 为材料，通过 RT-PCR 扩增出山丁子 CBF1 基因，随后亚克隆到
pMD18-T载体，序列分析表明与基因数据库中山丁子CBF1对应区域相似性为100%，将该片段亚克隆到原核表达载
体pBI121中构建原核表达质粒，转化大肠杆菌E. coli DH5α，在AMP 抗性的LB 平板上挑取重组质粒，进行PCR
并测序结果与预期一致。
关键词：山丁子；CBF1基因；表达载体；克隆
中图分类号：S637 文献标志码：A doi：10.3969/jissn.1671-9646（X）.2014.10.006
ConstructionofPlantExpressionVectorofCBF1Geneof
Malus baccata（L.） Borkh.
LIUYang
（Changchun Vocational Institute of Technology，Changchun，Jilin 130033，China）
Abstract：CBF1 transcription factor can regulate the expression of a group of low temperature resistant genes for resistance to
drought the low temperature，more effectively improve the ability of plant resistance to drought，low temperature resistance.
The wildMalus baccata（L.） Borkh. coming from Changbaishan is used as material and successfully cloned the transcription
factor CBF1 gene by amplifying through method of RT-PCR，subsequently，subcloning into pMD18-T vector. Sequence
analysis shows that the gene database ofMalus baccata（L.） Borkh CBF1 corresponding regional similarity of 100%. This
fragment is subcloned into prokaryotic expression vector pBI121 to construct the prokaryotic expression plasmid，transformed
intoE.coli DH5α，and the recombinant plasmids are selected from LB medium of amp-resistant. Results PCR and double
digestion are consistent with that expected.
Keywords：Malus baccata（L.） Borkh.；CBF1 gene；expression vector；clone
收稿日期：2014-07-09
基金项目：国家自然科学基金（30400300）；吉林省杰出青年基金（20050117）。
作者简介：刘 洋（1980— ），女，硕士，讲师，研究方向为植物基因工程。
植物经过低温驯化可提高其抗寒性，近年来在
模式植物拟南芥中发现的 CBF（CRT/DRE binding
factor） 抗寒机理，使当前果树抗寒分子生物学研
究取得了重大突破。CBF 转录激活因子作为 COR
（Cold-regulated） 分子表达的开关，可与 COR 基因
启动子区域的 CRT/DRE（C-repeat/dehydration re-
sponsive element） 调控元件特异结合，诱导一系列冷
调节基因的表达，激活植物体内多种耐逆机制的发
生，比如细胞膜脂的组成、细胞内具有抗寒特性的
可溶性物质 （如蔗糖、脯氨酸等） 含量的改变等，
从而提高植物对低温的耐寒性[1-2]。本研究采用吉林
省长白山野生山丁子（耐-42℃低温） 为材料，克
隆其抗寒性较强的CBF1基因，并构建这类基因的植
物表达载体，进一步利用该基因对我国东北耐寒性
较差的园林植物及农作物的遗传转化奠定基础。
1 材料及方法
1.1 试验材料
植物材料为吉林省长白山野生山丁子 （Malus
baccata（L.） Borkh.）；大肠杆菌E. coli DH5α，表
达质粒pBI121，吉林省农业科学院提供；克隆载体
pMD18-T vector，T4DNA 连接酶、限制性内切酶、
TaqDNA 聚合酶等工具酶、Trizol Reagat，宝泰克公
司产品。
1.2 引物设计与合成
根据山丁子抗寒转录因子CBF1基因序列分析，
在其编码区设计1对含有XbaⅠ和SacⅠ酶切位点特
异引物。
上游引物：5′-CCATCTAGACGAAGCACTCGGA
GCACGAAG-3′；
山丁子CBF1基因表达载体的构建
刘 洋
（长春职业技术学院，吉林 长春 130033）
文章编号：1671-9646（2014） 10a-0019-03
第10期（总第367期） 农产品加工（学刊） No.10
2014年10月 Academic Periodical of Farm Products Processing Oct.
农产品加工（学刊） 2014年第10期
（双下划线处为XbaⅠ酶切位点）
下游引物：5′-TGAGCTCTTATTCATCAATCCAC
TAACACAAGTC-3′
（双下划线处为SacⅠ酶切位点）
所用引物由Takar（大连） 公司合成。
1.3 试验方法
1.3.1 CBF1基因的克隆
12 月份采摘吉林省长白山生长的野生山丁子
（Malus baccata（L.） Borkh.） 枝条，水培法培养待其
长出大批嫩叶后，置于4℃，1~2 h低温驯化处理，
采摘叶片，在液氮中研磨成匀浆状后快速放到离心
管中，按 Trizol 试剂盒中的说明书操作提取 RNA，
电泳检测RNA。
RNA反转录体系如下：5μL RNA，2μL dNTP
mix（10 mmol/L），4μL buffer（10×），0.5μL RNA
酶抑制剂，3.5μL DEPC水。将离心管置于75℃水
浴变性4 min，后冰浴4 min，慢慢混匀后，低速离
心后收集液滴，并于42℃温浴65 min，87℃加热
12 min 灭活反转录酶。加入 80μL DEPC 处理的
ddH2O，稀释至 100μL，混匀，稍微离心，保存于
-20℃。
以cDNA为模板进行 PCR 扩增，20μL的体系
包括 1μL cDNA，0.5μL Taq 酶 （5 U/μL），2μL
Mg2+（25 mmol/L），2μL buffer（10×），0.5μL
dNTP（10 mol/L），0.5μL 引物 1，0.5μL 引物 2，
0.5μL Taq酶（5 U/μL），13μL ddH2O。扩增程序如
下：92℃ 预变性 8 min； 92℃ 30 s，55℃ 30 s，
72℃ 1 min，35个循环，72℃延伸8 min。PCR反
应结束后，取20μL产物进行琼脂糖凝胶电泳检测是
否有适当大小的条带，电泳回收后连接到pMD18-T
载体上，转化大肠杆菌 E. coli DH5α 感受态细胞，
转化产物在含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上生
长。挑取平板上长出的单菌落，提取质粒、酶切鉴定、
测序。
1.3.2 植物表达载体 pBI121-CBF1 的构建
用 XbaⅠ和 SacⅠ酶切从 pMD18-T 载体上切下
CBF1 基因，将其克隆到植物表达载体 pBI121 的
XbaⅠ和 SacⅠ位点，转化大肠杆菌E. coli DH5α，
在Amp 抗性的LB 平板上挑取重组质粒，进行PCR
和双酶切鉴定并测序，命名为pBI121-CBF1。
2 结果与分析
2.1 山丁子CBF1基因片段扩增
以山丁子cDNA为模板，利用特异引物PCR 扩
增出1个约750 bp的特异条带。PCR 扩增产物的测
序结果显示其长度为 756 bp，编码 252 个氨基酸，
与CNKI网站上山丁子CBF1序列同源性达100%。
山丁子CBF1的RT-PCR扩增见图1。
2.2 山丁子pBI121-CBF1表达载体的构建与酶切鉴定
用 XbaⅠ和 SacⅠ将 pBI121 的 Gus 结构基因切
除，保留CaMv35S 启动子部分，将它与CBF1 基因
序列（约750 bp） 连接之后，就构成了植物表达载
体，命名为pBI121-CBF1。
山丁子pBI121表达载体的构建见图2。
2.3 植物表达载体的鉴定
用 XbaⅠ和 SacⅠ进行酶切重组质粒 pBI121-
CBF1获得了约0.7 kb及10.0 kb的2个片段，从电
泳结果来看，证明链接的正确性，所得到的pBI121-
CBF1是构建的表达载体。
pBI121-CBF1的XbaⅠ和SacⅠ双酶切电泳图谱
见图3。
3 讨论
低温是限制植物生长的重要因素，尤其在我国
的东北和西北两地冻害发生普遍，因冻害造成的损
失也十分严重，利用传统方法选育耐寒植物时，所
用周期长，耗费物资大，效果也不好。当前在拟南
M 1 2
约750bp
M-DNAMarker（DL2000）；1-双引物的RT-PCR；2-阴性对照
图1 山丁子CBF1的RT-PCR扩增
图2 山丁子pBI 121表达载体的构建
山丁子CBF1基因编码区PCR产物
XbaI与SacI酶切
产生XbaI/SacI黏性末端
T4DNA连接酶连接
XbaI与SacI酶切
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2014年第10期
比较研究，得到ARA软胶囊囊壳的最佳配方、制备
工艺，以及软胶囊的生产工艺参数，并对ARA软胶
囊的制备过程进行多次验证，证明试验工艺稳定。
3 结论
根据单因素试验，得出软胶囊制备时所需的助
悬剂为蜂蜡，用量为3%；抗氧化剂为VE，用量为
0.03%；囊壳中添加的色素为氧化铁红食用色素，添
加量为明胶用量的0.7%。利用正交试验优化出软胶
囊囊壳制备的最佳配方，即溶胶温度为 70℃，明
胶∶甘油为 2∶1，水∶甘油为 1∶2。经过极差分
析，得出各因素对囊壳成型效果感官指标影响大小
排列为溶胶温度>明胶∶甘油>水∶甘油。通过试
验，得出软胶囊冷却条件为室温下冷却3±0.2 h，软
胶囊干燥条件为35℃下烘干8 h。根据试验得到的
软胶囊最佳制备工艺进行稳定性考察，连续3批试
验误差小于5%，差异不显著，说明试验工艺稳定。
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芥中发现的以CRT/DRE为主要元件的CBF转录因子
能够促进多个冷诱导基因的表达，这些目标基因的
编码产物共同起作用，使得转基因植株的耐逆性比
其他单一功能基因的转化强得多[3-5]。研究表明，转
基因植物大量表达拟南芥CBF1基因后使其抗寒性提
高10％左右[6-7]，相信大量表达抗寒功能更强的山丁
子CBF1基因的园艺作物，一定能抵御骤然降低的低
温天气，打破一些植物地理分布的界限，具有广阔
的应用前景。
本研究采用长白山野生的山丁子（耐-42℃低
温） 为材料，通过提取RNA，反转录以cDNA为模
板扩增出了CBF1基因原核表达载体，为进一步研究
其他植物中的CBF1基因打下基础。
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图3 pBI121-CBF1的XbaⅠ和SacⅠ双酶切电泳图谱
M-DNA Marker（DL 2 000）；
1- pBI121-CBF1的XbaⅠ和SacⅠ双酶切产物
M 1
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