全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第4期
收稿日期:2008-02-21
基金项目:河南省科技攻关项目(0624420016)
作者简介:竺俊鑫(1979-),男,硕士研究生
通讯作者:孟丽(1959-),女,汉族,河南睢县人,教授,硕士生导师,主要从事植物资源及利用的研究,E-mail:histml@163.com
前言
紫杉醇的国际通用名为 Paclitaxel,商品名 Taxol[1],是 1971年美国学者 Wanietal[2]从短叶红豆杉(Taxus
brevifoliaNnt.)的树皮中提取的一种四环二萜类化合物。作为一种天然的次生代谢产物,经临床验证,具有
良好的抗肿瘤作用,特别是对癌症发病率较高的卵巢癌、子宫癌和乳腺癌等有特效[3~5]。紫杉醇是近年来在
抗癌领域的最重大发现之一,已于 1992年被美国食品和药物管理局(FDA)批准为治疗转移性卵巢癌的新
药并已上市。
红豆杉中产紫杉醇内生真菌分离部位的比较研究
竺俊鑫 1 李勇超 2 孟丽 2
(1河南师范大学生命科学学院,新乡 453007;2河南科技学院生物技术系,新乡 453003)
摘 要: 目的 探讨红豆杉不同部位在内生真菌分离效率以及产紫杉醇菌株筛选率方面的规律性,为红豆杉产紫
杉醇内生菌菌株的分离与筛选提供一定的理论依据。方法 从根、茎、叶3个器官取大小和表面积相同的太行山野生红豆
杉(Taxouschinensis)材料,用组织块法分离红豆杉内生真菌,计算各部位内生真菌的分离效率;用高效液相法对分离到的
内生真菌发酵液提取物进行紫杉醇含量分析,计算各部位产紫杉醇内生真菌的筛选率。结果 共分离到109株红豆杉内
生真菌,根部、茎部和叶部分离效率指数分别为 0.90、0.63和0.28;其中有28株产紫杉醇,紫杉醇菌株筛选率分别为
31.48%、21.05%和17.65%。结论 在内生真菌的分离效率及其产紫杉醇内生真菌的筛选率上,均为根部﹥茎部﹥叶部,
即根部在内生真菌分离效率和筛选产紫杉醇内生真菌效率上均具有明显的优势。
关键词: 内生真菌 紫杉醇 高效液相色谱 分离部位
ComparativeStudyonDiferentPartsofTaxol-producing
EndophyticFungifrom T.chinesisinTaihangMountain
ZhuJunxin1 LiYongchao2 MengLi2
(1SchoolofLifeScience,HenanNormalUniversity,Xinxiang453007;2DepartmentofBio-technology,InsituationScienceand
Technology,Xinxiang453007)
Abstract: ObjectiveTostudytheregularityonisolationeficiencyofTaxusendophyticfungiandscreeningrate
oftaxol-producingstrainsfrom diferentpartsofTaxouschinensis.andprovidecertaintheoreticalbasisofisolationand
screeningontaxol-producingendophyticfungi.MethodsThematerialwiththesamesizefrom root、stem andleaf.
Endophyticfungiwereisolatedandisolationeficiencyofeachpartwascalculated.Thetaxolcontentsfrom isolated
strainsliquidfermentationweredeterminedbyHPLC.AndScreeningpercentageof3diferentpartswerecalculated.
Results109stainsofendophyticfungiwereisolatedfrom 3diferentpartsofT.chinesisgrowinginTaiHangmountain,
theirisolatedeficiencyindexeswere0.90,0.63and0.28respectiveig,and28endophyticfungistrainscanproducetaxol.
Screeningrateoftaxol-producingstainswere31.48%,21.05% and17.65%.ConclusionTheregularityfolowedlikethis
root>stem>leaf,whichshownthatroothassignificantlyadvantageonisolatedeficiencyoftaxousendophyticfungi,and
alsoonscreeningeficiencyofTaxol-producingendophyticfungi.
Keywords: EndophticfungiTaxolHPLC Isolationparts
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
目前紫杉醇主要从红豆杉中提取。红豆杉属于濒危树种,生长又极慢,大量砍伐势必造成红豆杉资源
的枯竭。因此寻找生产紫杉醇的替代原料,已成为摆在人类面前的重大课题。1991年 Stierle与 Stroble[6]首
次报道了从太平洋紫杉树中分离出一种可产紫杉醇的内生真菌 Taxomycesandreanae,其紫杉醇含量为 24～
50ng/L,为人们展示了一个可能生产紫杉醇的诱人的新途径。
目前,产紫杉醇内生真菌的分离部位茎叶研究居多,根部研究得较少;而且,分离和筛选产紫杉醇内生
菌尚缺乏系统的研究,特别是不同部位内生真菌产紫杉醇菌株的数量和紫杉醇含量方面的规律性尚未见
报道。以太行红豆杉的不同部位为材料,分离培养其内生真菌,并对其含紫杉醇菌株含量规律进行了测定,
初步探讨了红豆杉中不同部位产紫杉醇内生真菌的数量及紫杉醇含量的规律性,以期为红豆杉产紫杉醇
内生菌菌株的分离与筛选提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
分离材料来源于河南省太行山辉县八里沟的野生红豆杉,经鉴定为红豆杉 Taxuschinensis,分别采集
根、茎、叶 3个不同部位的组织为供试材料。
1.1.1 培养基 固体培养基为 PDA培养基,121℃灭菌 20min,在超净工作台内倒平板。
液体培养基也为 PDA培养基,只是不加入琼脂,分装至 250ml三角瓶中,每瓶 60ml,121℃灭菌 20min。
1.1.2 药品 紫杉醇标品购买于 SIGMA公司,HPLC流动相甲醇为色谱纯,水为三蒸水,其他试剂均为分
析纯,均购买于天津科密欧化学试剂有限公司。
1.2 方法
1.2.1 内生真菌分离 将采集到的红豆杉根皮和树皮切成与叶片大小大致相同的小段,叶片大小自然,分
别经 75%的酒精消毒 5min和 0.1%升汞消毒 8min,然后用无菌水冲洗 3遍,接种于 PDA固体培养基平皿
上,每一部位的材料接 20皿,每皿均放 3小段,共接 60皿。放置于 25℃恒温箱中培养,待长出菌落后,按无
菌操作程序挑出,在 PDA斜面培养基上纯化 3次以上,然后将纯化后保存在 PDA斜面培养基上的菌株放
入冰箱中 4℃保藏备用。
1.2.2 内生真菌的液体培养 将分离纯化后得到的内生真菌进行摇床液体培养,培养 3d后取 6ml接入
250ml三角瓶中,28℃,220r/min每瓶 60ml培养 7d。
1.2.3 紫杉醇含量的检测
1.2.3.1 样品溶液制备 用纱布过滤发酵物,将滤液部分用等体积的二氯甲烷萃取,取水相部分再用等体
积的二氯甲烷萃取 1次[8],菌丝部分经液氮研碎,超声 30min,静置过夜后用等体积的二氯甲烷萃取,重复
处理 1次,将所有的二氯甲烷萃取液合并,加入无水硫酸钠干燥,过滤后用旋转蒸发器在 35℃下减压蒸馏
至干,溶解于少量甲醇中,用 0.45μm滤膜过滤,定容至 10ml备用。
1.2.3.2 标品溶液配制 精确称取紫杉醇标准品 1.0mg,用 10ml甲醇溶解,配成 100mg/L母液备用。将母
液稀释成 4,8,16,32,64mg/L的系列标准品溶液。
1.2.3.3 色谱条件 日本岛津 HP2010C高效液相色谱仪,C18柱(150mm×46mm);流动相,甲醇:水(v/v)=
60:40;流速 0.7mlmin[9],检测波长 228nm,灵敏度,0.1AUFS,柱温 35℃,进样量 20μl。
2 结果与分析
2.1 内生真菌的分离结果
从红豆杉组织中共分离内生真菌 109株,根、茎、叶分别为 54、38、17株,所占百分比分别为 49.5%,
34.9%,15.6%,分离效率值分别为 0.90,0.63,0.28(表 1)。
由于在实验中每个部位均接 20皿,每皿放 3个小段,即各分离部位材料总数完全一致,所以各部位分
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离菌株数占分离到的总菌株数的百分比和分离效率
值能反映出该部位分离内生真菌的能力,进而体现
该部位在分离内生真菌数量上的优势。从表 1明显
看出,无论是所占百分比还是分离效率值,根﹥茎﹥
叶,表明在同样条件下,根在分离内生真菌的数量和
效率方面具有明显优势。
2.2 紫杉醇含量的检测结果
2.2.1 标准曲线的确定 取所配的紫杉醇标准品溶液,以峰面积
对浓度进行得出标准曲线,其回归方程为 Y=2.698714e-005)X+
0.2766129R=0.9999904。结果表明,紫杉醇在 4～64mg/L范围内呈
良好的线性关系(图 1)。
2.2.2 发酵提取物的检测结果 紫杉醇标准品和 109株内生真菌
发酵提取物的 HPLC检测结果见表 2、图 2和图 3。在相同色谱条
件下,紫杉醇标准品的保留时间为 29.141min,共有 28株内生真菌
发酵提取物在标品保留时间处,有一对应峰出现,即检测到 28株
产紫杉醇的内生真菌。
表 1 根、茎、叶内生真菌的分离结果
注:分离效率指数=分离到的菌株数量÷分离材料小段总数
图 1 紫杉醇标准曲线图
图 2 紫杉醇标准品的色谱图 图 3 含紫杉醇的内生真菌发酵提取物的色谱图
由表 2可知,产紫杉醇的菌株分别来自于根、茎、叶的数量为 17、8、3;由表 1和表 2可计算出根、茎、
叶产紫杉醇菌株筛选率分别为 31.48%、21.05%和 17.65%;紫杉醇含量平均含量分别为 235.84μg/L,
133.76μg/L,99.74μg/L,3个部位产紫杉醇菌株筛选率和紫杉醇平均含量比较见图 4。从上述数据可知,根
部分离的内生真菌产紫杉醇菌株筛选率最高,达 31.48%,且紫杉醇含量也较高。
表 2 28种内生真菌紫杉醇含量测定结果
图 4 产紫杉醇内生真菌菌株的筛选率和
紫杉醇的平均含量
竺俊鑫等:红豆杉中产紫杉醇内生真菌分离部位的比较研究 193
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3 讨论
自从 1991年 Stierle与 Stroble[6]筛选出第一株产紫杉醇内生真菌以来,国内外学者相继开展了筛选产
紫杉醇内生真菌的研究,例如,邱德有等[5]分离出一株产紫杉醇内生真菌,产率非常低;马天有等[10]分离得
到一株能产紫杉醇的内生真菌,产量为 141.20μg/L;;周东坡等[11]产紫杉醇的内生真菌,产量可达 51.06～
125.70μg/L;胡凯等[12]分离到三株紫杉醇产生菌,最高一株产量为 276.75μg/L。综观以往研究,产紫杉醇菌
株的产率较低,仍达不到真菌发酵工业化生产紫杉醇的盈亏平衡点(1mg/L)。以往研究中红豆杉材料的采
集部位几乎都集中在树皮和小枝,根部极少涉及,仅李长田等[13]较全面地从东北红豆杉根、茎、叶中分离到
78株内生真菌,经检测有 4株含有紫杉醇,但均不属于根部内生真菌。可见根部组织在筛选产紫杉醇内生
真菌菌株方面的研究工作还比较薄弱。
从试验结果可以看出,从根部分离和筛选出的含紫杉醇内生真菌在数量和紫杉醇含量上与茎、叶相比
均具有明显的优势(表 1、表 2和图 4),与李长田[13]等研究结果相比,从根部不仅分离到产紫杉醇的多个内
生真菌菌株,而且多属于高产菌株,其中一株产量高达 515.20μg/L,为迄今报道的产紫杉醇内生真菌产量
最高的野生菌株[9~13](此研究结果将另文发表)。由此可见根部的内生真菌更有研究价值。红豆杉根部产紫
杉醇内生真菌的高产性可能与其属于菌根菌有关,菌根菌作为真菌和植物根的互利共生体,能提高宿主植
物抗逆性,紫杉醇作为红豆杉抵御不良环境而产生的抗毒素,是受防御性基因调控的次生代谢产物[14]。而
根部和其他部位相比,菌根菌、土壤和植物形成一种更为复杂的生态复合体,受不良环境的影响更大,在长
期的进化过程中,其抗逆能力更强,防御性基因更多更全面,产生的次生代谢产物紫杉醇相应可能更多一
些,但详细的机理还需要进一步研究。
参考 文献
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