全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 1期
农杆菌介导法在橡胶树遗传转化中的应用与展望
邹智 杨礼富
(中国热带农业科学院橡胶研究所 农业部橡胶树生物学重点开放实验室,儋州 571737 )
摘 要: 综述农杆菌介导法在巴西橡胶树遗传转化中的应用进展,分析影响农杆菌转化的关键因素,如植物基因型与
外植体、菌株与载体类型、菌液浓度与侵染时间、v ir诱导物、筛选剂与抑菌剂、培养基的组成和附加成分等, 并对提高巴西橡胶
树转化效率的策略进行探讨。
关键词: 巴西橡胶树 根癌农杆菌 遗传转化 农杆菌介导法
Applications and Prospects ofAgrobacterium tumefaciens-
mediated Transformation inHevea brasiliensis
Zou Zhi Yang L ifu
(K ey Laboratory of RubberB io logy, RubberR esearch Institute,M inistry of A griculture,
Chinese A cademy of T rop icalAgricultural Sciences, D anzhou 571737)
Abstrac:t Focusing on the progress in Agrobacterium tum efaciens-m ediated transfo rm ation o fH evea brasiliensis, this rev iew ana-
lyzed m a in facts influenc ing transfo rm ation e fficiency, such as plant geno type and exp lant types, Agrobacter ium strains and p lasm id vec-
tors, Agrobacterium density and inoculation tim e, virulence( v ir) gene, induc ing compounds, antibiotic and se lectab lem arker, basicm ed-i
um and add itives. F ina lly, stra teg ies to improve the effic iency a re a lso propo sed.
Key words: H evea brasiliensis Agrobacter ium tum efaciens Gene tic transfo rm ation Agrobacterium-m ed iated transform ation
收稿日期: 2010-08-24
基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项 ( YWFZX2010-9 ) ,公益性行业科技专项经费 ( nyhyzx07-033-1)
作者简介:邹智,男,研究方向:植物基因工程和橡胶树抗逆生物学; E-m ai:l zouzh i2008@ 126. com
巴西橡胶树 (H evea brasiliensisMue l.l A rg. )起源
于南美亚马逊河流域,是一种典型的热带雨林乔木,
其乳汁是天然橡胶的主要来源。随着我国经济的高
速发展,国内对天然橡胶的需求量也与日俱增。然
而,我国地处热带北缘,为非传统植胶区, 虽然经过
科研工作者的努力,橡胶树已在海南、云南、广东、广
西和福建等地移植成功, 但适宜橡胶树生长的土地
资源比较有限,最大限度地提高单产将是缓解我国
天然橡胶严重短缺、促进天然橡胶产业可持续发展
的主要出路。由于存在遗传背景狭窄、高度杂合化、
雌雄花期不同步、非生产期长、育种周期长等特点,
橡胶树遗传育种进展较缓慢。转基因技术的出现为
拓展橡胶树的遗传背景、加速育种进程提供了契机。
在众多转化方法中,农杆菌介导法以机理明确、
操作简单、费用低廉、整合拷贝数低等优点成为植物
(特别是双子叶植物 )遗传转化的主要方法。其在
橡胶树方面也不例外, 自 1991年 Arokiaraj等 [ 1]发
现野生型农杆菌可成功侵染离体橡胶树幼苗的茎以
来, 农杆菌介导法已在橡胶树遗传转化中取得了重
大的进展。
1 农杆菌介导植物转化的分子机理
农杆菌隶属根瘤菌科 ( Rh izob ium )农杆菌属
(Agrobacterium ), 是一种宿主极其广泛的革兰氏阴
性土壤杆菌,用于遗传转化的有根癌农杆菌和发根
农杆菌 ( Agrobacterium rh izogenes )。自然条件下, 农
杆菌通过 T i或 R i质粒上的 T-DNA转化植物基因
组, T-DNA区生长素和细胞分裂素合成相关基因的
过量表达造成宿主激素水平失调, 从而诱发冠瘿瘤
或毛状根。
转化过程起始于农杆菌对宿主的感应。在植物
2011年第 1期 邹智等: 农杆菌介导法在橡胶树遗传转化中的应用与展望
细胞所释放的酚类化合物、糖类物质等信号分子的
诱导下,农杆菌一方面在 T-菌毛和染色体毒性蛋白
的引导下以极性方式向宿主进行趋化运动, 并通过
表面的乙酰化酸性荚膜多糖附着到植物细胞壁上,
进而形成囊状结构;另一方面,通过 V irA /V irG双组
分调控系统介导 v ir基因表达, v ir基因的表达最终
导致未成熟 T-复合体和 IV型分泌系统的形成。在
宿主特异性蛋白的刺激下, 由 V irB /D4组成的转运
通道开放,未成熟 T-复合体及一些 V ir蛋白被独立
转运进宿主细胞质中。未成熟 T-复合体一进入宿
主细胞质,就被单链结合蛋白 V irE2包装成成熟 T-
复合体,该复合体在 V irD2、V irE2、V irE3及一些宿
主核输入因子 A tKAP、V IP1等的协助下进入细胞
核。核内, T-复合体在宿主因子如 V IP1、CAK2M和
TBP等的介导下向整合位点运动, 并在 V irF的作用
下通过泛素化途径降解包装蛋白和组蛋白, 最后以
单链侵入或双链断裂模型整合进宿主基因组, 继而
表达 [ 2]。
2 农杆菌介导法在橡胶树遗传转化中应用
1991年,马来西亚橡胶研究所 ( RR IM )的研究
人员用注射器将野生型根癌农杆菌 541 /71注入 2
周龄离体橡胶树 PB 5 /51幼苗的茎部, 3周后接种
部位形成肿瘤, 8周后肿瘤直径达 2 cm;切取的肿瘤
可在不含激素的 MS基本培养基上自主生长, TLC
检测表明,肿瘤组织合成了章鱼碱 [ 1]。肿瘤的形成
和章鱼碱的合成表明, 农杆菌中致病质粒已转移和
质粒上控制某些代谢物 (如冠瘿碱、植物激素合成 )
的基因在肿瘤细胞中得到表达。 1996年, A rokiaraj
等 [ 3]以花药愈伤为转化受体,利用农杆菌介导法将
GUS和 npt II基因成功导入橡胶树系 GL 1, 且转入
的基因在第 3代无性系中仍正常表达, 表现出高度
的稳定性。 1998年, A rok iara j等 [ 4]用农杆菌介导法
将 p35SGUS int导入花药愈伤, 组织化学染色表明
GUS基因在转化植株的叶片和胶乳 ( C-乳清 )中都
有表达,且该基因可通过无性系稳定遗传。为了增
加胶乳的附加值, 该研究组又将 ScFv4715基因 (一
小鼠抗体基因 )和人血清白蛋白基因 ( human serum-
al bum in, HAS)导入橡胶树 [ 5, 6]。转化的基本程序:
未成熟花药在添加 100 mmo l/L 硫酸腺嘌呤和
620mmo l /L赖氨酸的起始培养基上诱导愈伤; 4周
龄的花药愈伤在过夜培养的农杆菌菌液中浸泡 1
m in; 吸干多余菌液后转入起始培养基, 25 黑暗共
培 2 d; 然后外植体转入添加 250 mg /L 头孢霉素
( cefo tax ime, Cef)和 500 mg /L替卡西林 ( ticarcillin,
ticar)的延迟筛选培养基进行脱菌培养; 1周后转入
添加 50mg /L卡那霉素 ( kanamyc in, K an)、250mg /L
C ef和 500mg /L ticar的选择培养基上进行筛选, 每
周继代 1次,期间 Cef浓度梯度降至 100 mg /L、ticar
降至 200mg /L; 抗性愈伤转入添加 100 mg /L Kan、
100mg /L Cef和 100mg /L ticar的分化培养基进行胚
胎诱导; 约 2个月后抗性胚状体转入添加 100mg /L
Kan的培养基进一步发育和再生。
在高效胚性愈伤再生体系的基础上, 法国国际
农业研究发展中心 ( C IRAD )的研究人员以系 PB
260长期继代的内珠被脱分化愈伤为受体,建立了一
套高效的农杆菌介导转化体系。转化程序:未成熟种
子的内珠被在添加 30 mo l/L AgNO3、45 mo l/L激
动素 ( k inetin, K in)、45 mo l/L 3, 4-二氯苯氧乙酸
( 3, 4-d ichlorophenoxyacetic acid, 3, 4-D)和 12 mmo l/
L CaC l2的培养基上进行愈伤诱导;以后每隔 15 d转
入添加 9mmol /L C aC l2、134 mol/L 6-苄基腺嘌呤
( 6-benzy lam inopurine, BAP )、134 mo l/L 3, 4-D、
05 mo l/L脱落酸 ( absc isic ac id, ABA )的培养基上
继代;转化前在添加 45 mo l/L BAP和 45 mo l/L
3, 4-D的培养基上预培养 15 d, 然后在含 1 mmo l/L
C aC l2的愈伤继代培养基上进行 1- 2次为期 2周的
低温处理;用 107 cells/mL的菌液侵染 1 s, 20 条件
下共培 7 d;转入添加 500 mg /L ticar的延迟筛选培
养基上脱菌,每 3周继代 1次; 6周左右将 t icar浓度
减半,并在继代 2- 5次后加入 50- 100 mg /L巴龙
霉素 ( paromomycin, par ); 转化愈伤在添加 044
mo l/L BAP、20 g /L蔗糖、60 g /L麦芽糖、250 mg /L
ticar、3 g /L Phytagel的供胚胎诱导 ( expressionm ed-i
um, EXP)培养基上诱导再生,期间每半个月在供胚
胎发育 ( deve lopmentm edium, DEV )液体培养基中短
时间浸泡 1次培养基。该体系的关键是去除预培培
养基中的 CaC l2 [ 7- 9 ]、转化前愈伤组织的低温处理和
将共培温度降至 20 [ 10 ]。
印度橡胶研究所 ( RR II)也建立了一套以花药
愈伤为受体的高效农杆菌介导转化体系,转化程序
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
为:两个月左右的花药愈伤在 5 108 cells /mL的菌
液中侵染 10m in,然后在 25 条件下共培 3 d共培培
养基含 20 mo l/L乙酰丁香酮 ( acetosyringone, AS )、
15mmo l/L甜菜碱 ( betaine HC l)、1155mmo l/L脯氨
酸 ( pro line)、20mg /L 2, 4-D ( 2, 4-dich lorophnoxyace-
t ic ac id, 2, 4-二氯苯氧乙酸 )和 05mg /L K in,共培后
采用 500 mg /L Cef抑菌, 300 mg /L Kan进行筛选,
胚胎诱导培养基中添加 20 mg /L精胺 ( sperm ine)、
200 mg /L 干酪素水解物 ( case in hydro lysate)、150
mg /L香蕉粉 ( banana powder)、10%椰子水 ( coconut
w ater)、01 mg /L ABA、02 mg /L BAP和 05 mg /L
赤霉酸 ( g ibbere llic acid, GA3 ), 胚胎成熟培养基中添
加 20 mg /L精胺、300 mg /L干酪素水解物、150
mg /L 香 蕉粉、10% 椰 子 水、01 mg /L ABA、
03mg /L BAP、03 mg /L GA 3和 01 mg /L IAA, 胚
胎萌发培养基中添加 400 mg /L干酪素水解物、200
mg /L香蕉粉、5%椰子水、02mg /L K in和 02 mg /
L GA 3。目前该研究组已成功将 GUS和 HbSOD基
因 (缓减死皮和增强抗胁迫能力 )导入橡胶树系
RR II 105中 [ 11- 15]。
及至当前, 我国还没有一篇关于获得转基因橡
胶树的正式的文献报道。从事相关研究的有中国热
带农业科学院生物技术研究所的陈雄庭实验室、鲍
时翔实验室和彭明实验室, 以及中国热带农业科学
院橡胶研究所的橡胶育种研究室 [ 16]。
3 影响农杆菌介导橡胶树遗传转化的因素
和提高转化效率的策略
3. 1 橡胶树基因型与外植体
研究表明,不同植物种、同一物种的不同品种或
基因型、甚至同一植物的不同外植体在再生能力和
对农杆菌的敏感性方面往往存在显著差异。橡胶树
也不例外,不同基因型的外植体愈伤诱导率、胚状体
发生率和植株再生率存在较大的差别。
一直以来, 胚胎发生途径是橡胶树再生的主要
途径。然而,到目前为止, 只有少数无性系通过体细
胞胚再生途径获得小植株, 国外有 PB 260、PB 235、
PB 254、PB 310、PR 107、PR 300、PRH 105、RRIM
600、RR IM 703、IRCA 109、BPM 24和 GT 1等品种,
国内有海垦 1、海垦 2、大丰 95、热研 7-33-97、热研
88-13、文昌 217、云研 77-2、云研 73-477、云研 74-
647、云研 74-1007、云研 34-4和五星 1-3等品种 [ 17] ,
且多数因再生率太低而不能满足实用的需求。基因
型对外植体的影响主要表明在如下两个方面: 一是
不同基因型的外植体自身再生频率不同;二是不同
基因型的外植体对外界环境的刺激反应不同。一般
认为,基因型的特异性与细胞的生理状态有关。据
报道,胚状体诱导率高、质量好的橡胶品种有 PB
260、PR II 105、云研 73-477、热研 88-13、热研 7-33-
97和海垦 2等。
虽然高效的离体再生体系是高效转化的前提条
件, 但是遗传转化并不同于纯粹的组织培养,转化效
果并非愈伤和胚状体的诱导率愈高愈好。例如, 热
研 8-79和海垦 2花药愈伤诱导率较高, 但愈伤组织
长得太快、较疏松, 农杆菌浸染后褐化严重, 以致不
能再生;而热研 7-33-97的愈伤组织诱导相对较慢、
较致密,农杆菌浸染后褐化程度较低,出现畸形胚相
对较少,有利于获得转基因植株 [ 17]。
另外,来源于同一植物的不同外植体、同一外植
体的不同发育阶段对农杆菌的敏感性和再生能力等
有明显的差异。良好的外植体必须同时具备再生频
率高、易为农杆菌侵染等特点。不同发育阶段的外
植体具有不同细胞类型组成和生理状态,而这决定
着细胞的代谢水平如酚类化合物的合成 (影响 v ir
基因的诱导表达 )、细胞内源激素水平 (影响细胞的
生长、分化 )及细胞壁的结构 (影响细菌的附着 )。
研究表明, G0和 S期的细胞更有利于外源基因的整
合。目前成功用于橡胶树遗传转化的有花药愈伤和
内珠被愈伤。在花药培养中, 一般选取发育阶段处
于单核期、少数处于双核期的花药作外植体。而在
内珠被 (内种皮 )培养中, 一般选取自然授粉 2月后
的幼果,去掉果壳、外种皮和种胚, 切取幼嫩的内种
皮薄片作外植体。
3. 2 农杆菌菌株与载体
研究表明, 不同农杆菌对同一受体材料的侵染
能力不同。野生型农杆菌中, 不同菌株的宿主范围
相差悬殊,广宿主的菌株可感染大多数的双子叶植
物、少数的单子叶植物和裸子植物,而窄宿主的菌株
则局限于少数几个物种或品种。菌株对宿主范围的
影响由农杆菌的染色体基因、所含质粒基因以及植
物因子共同决定的。同一质粒置于不同染色体背景
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2011年第 1期 邹智等: 农杆菌介导法在橡胶树遗传转化中的应用与展望
的农杆菌菌株时, 转化效率明显不同。由于不同质
粒 v ir基因的表达水平不同,同一质粒于不同染色体
背景的菌株中表达水平也不一样, 每种质粒都有最
优染色体背景的菌株。
研究表明,不同类型的野生型根癌农杆菌菌株如
胭脂型 ( nopa line type)菌株 C58和 T37、章鱼碱型 ( octo-
pine type)菌株 A348和 541/71和农杆碱型 ( agropine
type)菌株 A281都可诱导产生冠瘿瘤 ( crown galls),其
中,以 C58诱导的冠瘿瘤生长最快, T37和 A348次之。
目前, 在橡胶树成功应用的菌株有 C58pGV2260、
C58pGV3850、EHA101、EHA105等。1996年, A rokiaraj
等利用 GV2260( pT iB6 /pCAMB IA2301)对橡胶树系
GL 1进行转化, 首次获得转化植株。Montoro等
( 2003)以橡胶树无性系 PB 260的脆性内珠被愈伤
为材料, 比较了 3种菌系的 C58pMP90 ( pMP90)、
C58pGV2260 ( pT iB6 )、AGL1 ( pBo542 )、LBA4404
( pAL4404)和 EHA105(修饰的 pBo542)等 5种菌株
的转化能力, 其中 EHA 105和 C58pGV2260获得转
化愈伤,且 EHA105的转化效率比 C58pGV2260明
显要 高。另外, 有 研究 表明, C58pGV2260 和
C58pGV3850与超毒质粒 pToK47 组合时效果
更好 [ 18]。
3. 3 农杆菌的培养、浸染及与外植体的共培养
农杆菌介导的遗传转化是农杆菌与转化受体
相互作用的结果, 转化中, 首先, 要保证高侵染活
力的农杆菌对受体的充分侵染; 其次,要求侵染后
的外植体保持较高的再生能力。一般来说, 处于
对数生长期 ( OD 600约为 03- 10)的农杆菌侵染
活性较强。
3. 3. 1 菌液浓度与浸染时间 菌液浓度、浸染时间
和共培时间是影响转化效率的关键因素。提高菌液
浓度或延长侵染时间和共培时间, 虽然可提高瞬间
表达率,但很难控制后续培养中农杆菌的过度生长,
易导致外植体褐化、死亡,从而降低稳定转化率;反
之,则未被侵染。
不同转化试验中,菌液浓度差别较大,一般采用
对数期或在此基础上稀释一定倍数的农杆菌。由于
目前橡胶树中用于遗传转化的主要是愈伤组织,而
愈伤对环境胁迫非常敏感,随着浸染时间的延长,褐
化程度逐渐加剧, 且易导致农杆菌过度生长 [ 7, 8 ]。
同时,由于不同农杆菌菌株的生长速度不同,侵染时
间可根据菌株特性及菌液浓度作相应的调整, 菌液
浓度高时可相应地减少侵染时间。A rokiara j等 [ 4 ]在
转化中采用的是过夜培养菌液浸染 1 m in, M ontoro
等 [ 9]发现菌液浓度为 107 ce lls/mL时,浸染 1 m in的
GU S活性最大, 浸染 3 m in时, GUS活性迅速降低,
且愈伤褐化率达到 100%。如果有必要采取高浓度
的菌液,可结合缩短共培时间, 共培后冲洗外植体,
或在共培培养基中添加硝酸银等抑菌剂。
农杆菌与外植体在合适条件下进行一定时间的共
培养对于高效转化是必需的。研究表明, 农杆菌的附
着是转化的前提,而附着分为接触和成囊两个阶段,接
触不稳定,农杆菌只有在创伤部位生存了 8- 16 h之后
即完成了成囊才能诱发肿瘤。 Jayashree等 [ 13]发现不
进行共培养不能获得转化愈伤,随着共培时间的延长,
转化效率增加,共培 3 d时达到最大 ( 4% ),此后抗性愈
伤的生长因为农杆菌的过度繁殖而被抑制。
3. 3. 2 预活化与共培条件 v ir基因的诱导表达是
农杆菌介导转化的前提。研究表明,酚类化合物、糖
类物质、磷酸饥饿、酸性 pH值 ( 48- 55)、低磷酸、
肌醇、甜菜碱和脯氨酸等信号分子都可诱导或促进
v ir基因的表达。自然条件下,植物释放的酚类化合
物可诱导 v ir基因的表达,但不同植物不同外植体所
释放此类物质的种类及数量不同。一般来说,双子
叶植物所释放的种类和数量都比较多,而单子叶植物
则相对较少。因此, 在植物 (特别是单子叶植物 )转
化中通常采用 AS对农杆菌进行诱导。信号分子如
AS可直接添加到共培培养基中,也可加入农杆菌培
养液中, 或两者都加。 Jayashree等 [ 13]发现 20 mol/L
AS、15mmo l/L甜菜碱和 1155 mmo l/L脯氨酸可提高
转化效率。Montoro等 [ 7]研究了 C58pMP90( pM P90)、
C58pGV2260 ( pT iB6 )、AGL1 ( pBo542 )、 LBA4404
( pAL4404)和 EHA 105(修饰的 pBo542)等 5个菌株
对系 PB 260内珠被愈伤的转化,结果表明 AS对于
转化是必需的。另外,在其它几套成功的橡胶树转
化体系中大多添加 20- 100 mo l/L AS。然而, 橡
胶树组培中的一个重要问题是外植体易于褐化 (橡
胶树中含有大量的酚类物质, 酚可被多酚氧化酶氧
化成褐色的醌,醌对外植体有毒 ), 褐化的外植体不
能或很难再生, 共培培养基中添加高浓度的 AS可
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
能加剧外植体的褐化程度, 这在甘蓝型油菜和草莓
等中有相关的报道。因此, 选择在农杆菌培养液中
添加 AS可能更有利于转化受体的再生。
研究表明, 温度影响农杆菌 v ir基因的诱导表
达、T-DNA的转移与整合。农杆菌的最适生长温度
是 28 ,但最适生长温度并是最适侵染温度, v ir基因
诱导表达的最适温度是 19 ,因此,可将处于对数期
的农杆菌置于 AB或 MS等非富裕培养液 ( pH54)
中, 19 下,采用 100 mol/L AS对农杆菌预活化 3-
12 h
[ 19]。至于共培温度,众多研究表明,它是影响农
杆菌转化效率的关键因素。在常规的转化试验中,
由于 v ir基因的诱导也在共培阶段,因此共培温度既
要满足 v ir基因的诱导、又要满足 T-DNA的转移与
整合,同时也要满足受体细胞的脱分化与增殖。然
而, v ir基因诱导表达的最适温度是 19 ; 不同物种
中 T-DNA转移的最适温度在 20- 25 之间,如烟草
是 22 、大蒜愈伤 22 、小麦和玉米悬浮细胞为
23 ;而就 T-DNA整合和稳定表达而言, 烟草的最
适温度为 25 、玉米未成熟胚为 20 , 这表明不同
植物甚至同一植物的不同外植体的最适转化温度可
能不同,每一个特定物种或外植体都有自己的最佳
转化温度,因此在转化中应根据特定的外植体和菌
系来确定最佳温度。 B lanc等 [ 10]在转化橡胶树系
PB 260品系长期继代的内珠被脱分化愈伤时, 发现
将共培温度降到 20 、共培时间延长至 7 d可显著
地提高转化效率。
3. 4 筛选剂与抑菌剂
由于在植物遗传转化中,外源基因稳定的整合
频率很低,因此选择适当的筛选标记, 以准确、有效
地分离转化与非转化细胞, 而又不干扰转化细胞的
正常生长和植株的再生, 是成功转化的关键之一。
常用的筛选标记基因有 npt II、hpt、spt、pat、bar、ep-
sps和 dh fr等,目前,成功用于橡胶树遗传转化的只
有 npt II基因。 npt II基因可赋予转化细胞抗卡那
霉素、巴龙霉素、庆大霉素 ( genetic in)等抗生素。虽
然卡那霉素广泛用于双子叶植物的筛选, 且已在橡
胶树花药愈伤的转化中成功应用 [ 3, 4] , 但 Jayashree
等 [ 13]在转化 RR II 105花药愈伤时发现, Kan浓度低
于 200mg /L时非转化愈伤过度生长, 300mg /L K an
非转化愈伤完全被抑制, 获得最高的转化效率
( 4% ) ,当 K an浓度超过 350 mg /L转化效率降低,
愈伤生长明显减缓。M ontoro等 [ 9]在转化系 PB 260
内珠被愈伤时也发现 50 - 150 mg /L K an均不影响
非转化愈伤的生长和褐化, 这说明橡胶树本身就能
耐高浓度的 K an; 而 50- 100 mg /L par则能取得很
好的效果, 50、100、150 mg /L褐化率达到 100% , 150
mg /L时组织几乎停止生长。考虑到抗生素抗性基
因筛选效率低、存在潜在的风险等问题,一些除草剂
抗性基因如 pat、bar、epsps和正向筛选标记如磷酸
甘露糖异构酶编码基因也值得尝试。
为了避免农杆菌的过度繁殖而对受体材料产生
病害,有必要在培养基中加入抗生素对受体材料进行
脱菌处理。抑菌抗生素的选择以既能抑制农杆菌的
生长但又不影响外植体的再生为原则。在农杆菌介
导的植物遗传转化中常用的抗生素有 Cef、Car( car-
ben icillin,羧苄青霉素 )、t icar、tim ent in和 K an。研究
表明, 50- 250 mg /L Cef可显著抑制玉米愈伤的诱
导;在油菜等物种中 Cef抑制芽的分化,而 Car抑制生
根。橡胶树中常用 500- 100mg /L ticar和 500- 100
mg /L Cef(表 1)。
35 培养基组成及附加成分
3. 5. 1 基本培养基 植物组织培养中常用的基本
培养基有 MS、N itsch、B5、BN、BH、MB、N6、M iller、H
等,其中, M S和 MB在橡胶树组培中应用最为广泛。
有研究表明,花药愈伤诱导以 MB为基本培养基的
效果比 MS好。MB包含 MS培养基的大量元素和
铁盐、Bourg in和 N itsch的微量元素及有机物质, 而
MS培养基则是一种高盐培养基, 特别是 NH +4的含
量较高。有研究表明,高浓度 NH +4 可促进花药胚状
体的发生,低浓度 NO -3可提高其花粉胚状体的诱导
率。另外,研究表明,降低悬菌和共培培养基中的盐
浓度有利于油菜、小麦、玉米的转化。Ke等 [ 20]以大
麦的未成熟胚为外植体系统研究了悬菌和共培培养
基中盐的浓度对 GUS瞬时表达的影响, 与全盐相
比, 1 /10的 MS盐浓度可使 GU S瞬时表达提高 10
倍, 此外, 每个未成熟胚中表达 GUS活性的细胞分
布发生了明显改变, 表达 GUS活性的角质层表面
( scute llar surface)的细胞显著增多。
3. 5. 2 碳源 蔗糖是植物组织培养中应用最为广
泛的碳源。在不同试验中所用蔗糖浓度差别很大
64
2011年第 1期 邹智等: 农杆菌介导法在橡胶树遗传转化中的应用与展望
表 1 农杆菌介导法在橡胶树遗传转化中应用概况
品种 外植体 农杆菌菌株 载体 选择标记 报告基因
筛选剂
(m g/L )
抑菌剂
(mg/L )
目的
基因
目标
性状 结果
转化
效率 参考文献
PB
5 /51
幼苗 F541 /71
形 成
肿 瘤
细胞
[ 1]
GL 1
花药
愈伤
C58pGV2260
( pT iB6)
pCAMB IA2301 npt II p35S-GUS int
kan
( 50- 100)
cef( 250-
100)和 t-i
car( 500-
100)
获 得
转 基
因
植株
[ 3]
GL 1
花药
愈伤
C58pGV2260
( pT iB6)
pCAMB IA2301 npt II p35S-GUS int
kan
( 50- 100)
cef( 250-
100)和 t-i
car( 500-
100)
获 得
转 基
因
植株
< 1% [ 4]
PB
260
内珠被
愈伤
EHA105(修
饰的 pBo542) pCAMB IA2301 npt II p35S-GUS int cef( 500)
转 化
愈伤 [ 7]
PB
260
内珠被
愈伤
EHA105(修
饰的 pBo542) pCAMB IA2301 npt II p35S-GUS int cef( 500)
转 化
愈伤 [ 8]
GL 1
花药
愈伤
C58pGV2260
( pToK47)
pLGMR. HSA npt II kan
( 50- 100)
cef( 250-
100)和 t-i
car( 500-
100)
HSA
生产人
血清白
蛋白
获 得
转 基
因
植株
[ 5]
GL 1
花药
愈伤
C58pGV3850
( pToK47)
pGPTV-
ScFv4715
npt II kan
( 50- 100)
cef( 250-
100)和 t-i
car( 500-
100)
ScFv4715
生产
小鼠抗体
获 得
转 基
因
植株
[ 6]
RRII
105
花药
愈伤
EHA101
( pT iEHA101)
pDU 96. 2412 npt II pUb i7-GUS kan( 300) cef( 500)
pFMV34S-
MnSOD
缓减
死皮
转 基
因 胚
性
愈伤
[ 11]
RRII
105
花药
愈伤
EHA101
( pT iEHA101)
pDU 96. 2412 npt II pUb i7-GUS kan( 300) cef( 500)
pFMV34S-
MnSOD
缓减
死皮
获 得
转 基
因
植株
6% [ 12]
PB
260
内珠被
愈伤
EHA105(修
饰的 pBo542) pCAMB IA2301 npt II p35S-GUS int
par
( 50- 100 )
ticar
( 500)
转 化愈伤 [ 9]
RRII
105
花药
愈伤
EHA101
( pT iEHA101)
pDU96. 2144 npt II p35S-GUS int kan( 300) cef( 500)
p35S-
H bSOD
缓减死皮
获 得
转 基
因
植株
4% [ 13]
PB
260
内珠被
愈伤
EHA105(修
饰的 pBo542) pCAMB IA2301 npt II p35S- GUS int
par
( 50- 100 )
ticar( 500-
250)
获 得
转 基
因
植株
[ 10]
65
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
续表
品种 外植体 农杆菌菌株 载体 选择标记 报告基因
筛选剂
(m g/L )
抑菌剂
(mg/L )
目的
基因
目标
性状 结果
转化
效率 参考文献
RRII
105
花药
愈伤
EHA101
( pT iEHA101)
npt II
获 得
转 基
因
植株
[ 14]
PB
260
内珠被
愈伤
EHA105(修
饰的 pBo542)
pCAMB IA-
( 35S- nptII)-
( PHEV2. 1-
gusA )
npt II
pHEV2. 1-
GUS int
par
( 50- 100 )
ticar( 500-
250)
获 得
转 基
因
植株
[ 15]
( 2% - 10% )。研究表明, 愈伤诱导培养基中添加
2% - 10% 蔗糖均可促进组织分化, 组织学观察表
明,与 3%蔗糖相比, 添加 10%的蔗糖接种 25 d后
小孢子存活率提高 1倍以上; 1988年陈正华报道花
药愈伤诱导的最适蔗糖浓度为 7% - 8% ; 1978年,
王泽云等报道 8% - 10%蔗糖虽然对愈伤组织的生
长有一定程度的抑制, 但此种愈伤在随后的分化培
养中具有较强的胚状体分化能力。一般认为, 蔗糖
在植物组织培养中具有两大作用:一是提供碳源;二
是维持培养基的渗透势。此外,有报道表明,提高蔗
糖浓度还能减少组培中的玻璃化现象, 而降低分化
培养基中蔗糖浓度可促进器官的分化。
3. 5. 3 固化剂 常用的固化剂有琼脂粉 ( agar)、琼
脂糖 ( agarose)、脱乙酰吉兰糖胶 ( ge lrite)、吉兰糖胶
( phy tagel)等。目前 phy tagel在橡胶树遗传转化中
应用最多。 Jayashree等 [ 13]在转化系 RRII 105花药
愈伤时发现, phytage l浓度为 02%时未能得到转化
胚, 04% 时获得转化胚的频率最高, 以后随着
phytagel浓度的提高而下降。这可能是较高浓度的
phytagel改变培养基水分的存在状态, 同时降低培
养皿中的湿度,改变了愈伤组织的小气候而使再生
频率提高, 但是, phytage l浓度过高, 则影响外植体
对营养成分的吸收。另外,有研究表明,在一定范围
内提高琼脂浓度,可减少大白菜再生过程中玻璃化
苗的形成。
3. 5. 4 常用激素 橡胶树组织培养中常用的生长调
节剂有 2, 4-D ( 05 - 20 mg /L )、3, 4-D ( 03 -
10mg /L)、IAA、NAA ( 01- 02 mg /L )、K in( 01-
10mg /L )、BAP ( 03 - 50 mg /L )、TDZ ( 033 mg /
L )、GA3 ( 04- 07mg /L )等。刘桂珍和陈正华 [ 21]发
现在悬浮培养基液加入 10mg /L 2, 4-D可促进胚胎
发生,随着浓度的增加反而产生抑制作用; 吴胡蝶
等 [ 22]发现 2- 5mg /L BAP可提高胚状体的诱导率和
植株的再生率,他们推测 BAP可促进胚胎原始细胞
的发育或是消除愈伤组织中残留 2, 4-D对胚胎原始
细胞发育的抑制作用,但是, BAP浓度不能太高,否则
胚状体发育反而受阻,不能达到提高植株诱导率的效
果; 1986年,陈正华等报道 GA3能显著地促进胚状体
体积的增长,但并不能提高胚状体的诱导率。与单一
激素的应用相比,生长素与细胞分裂素配合使用更有
利于愈伤组织诱导和分化。05- 10mg /L 2, 4-D和
05- 10mg /L K in配合使用可明显促进橡胶树花药
胚性愈伤的诱导, 01 - 02 mg /L NAA、02 -
10mg /L K in、0- 05 mg /L GA3联合使用可显著促
进胚状体增殖; 另外, 也有研究表明,低浓度的 GA3
( 01 mg /L )配合 IAA或 IBA可明显促进茎尖的分
化,且 IAA的效果比 IBA好。
3. 5. 5 ABA ABA是 20世纪 60年代发现的一种
植物激素,在植株组织培养中应用相对较少。研究
表明, ABA可提高体细胞胚发生频率和质量、抑制
畸形胚发生。吴胡蝶等 [ 22 ]发现培养基中添加 ABA
可促进橡胶树体胚发生,但不同胚胎发生和成熟试验
中所使用的浓度各不相同 ( 00264 - 264mg /L )。
L inossier等 [ 23]报道 00264- 0264mg /L ABA可加快
66
2011年第 1期 邹智等: 农杆菌介导法在橡胶树遗传转化中的应用与展望
球形胚的产生; Ca illoux等 [ 24]报道 264mg /L ABA可
促进胚胎的发生与成熟; Jayashree等 [ 13]发现当 ABA
浓度为 01 mg /L时获得转化胚的效率最高, 而当
ABA浓度超过 02 mg /L时, 胚状体发生率迅速降
低;吴胡蝶等 [ 22]报道02- 05mg /L ABA可明显提
高胚状体的数量、质量以及植株的诱导率,但当浓度
提高到 10mg /L时,则产生明显的抑制作用, 其原
因可能与 ABA降低培养基中腐胺的水平、抑制体细
胞的过早萌发、增加贮藏蛋白质的积累量等有关。
另外, 促进橡胶树胚胎发生和成熟的 ABA浓度可能
还和其他激素的配比、固化剂和糖浓度、基因型及内
源 ABA有关。据报道, 外源 ABA可提高橡胶树内
源 ABA水平 [ 23] ; 与含 58 mmo l/L蔗糖的基本培养
基相比, 234mmol /L蔗糖和 00264mg /L ABA联合
使用可使橡胶树鱼雷型胚中三磷酸甘油酯提高 5
倍 [ 24] ;同样,与单用 ABA处理相比, 采用渗透剂甘
露醇和 ABA混合处理 1周,可使橡胶树晚期子叶胚
增加 1倍,且渗透作用促进了胚前细胞团向鱼雷胚
的转化,大大地减少了次生胚的发生 [ 23]。
3. 5. 6 Ca2+ Ca2+是植物细胞壁中的主要阳离子
成分 (一般 1 - 10 mmol /L ) , 约整个细胞的 60%。
它主要参与细胞壁中大分子物质的偶联、细胞壁物
质的合成、细胞壁结构的重塑、细胞的分裂、对病原
菌的防御。1993年, M on toro等 [ 7, 9]发现 CaC l2可刺
激细胞离散 ( ce ll dissoc iation), 进而促进愈伤细胞的
分裂; 内珠被脱分化愈伤在无 CaC l2的培养基上预
培养两周后, 内源 Ca2+浓度下降了 91%, 细胞活性
增强, 瞬间转化效率显著提高, 可能的原因是随着
Ca
2+浓度的下降, 愈伤细胞壁结构发生改变, 更有
利于农杆菌的附着和 T-DNA的转移; 另外, 悬菌和
共培培养基添加 50 - 100 mo l/L AS和去除 CaC l2
也可提高转化效率, 并且 AS和 CaC l2存在拮抗
作用。
3. 5. 7 多胺 多胺 ( Po lyam ines, Pas)是生物体代谢
过程中产生的低分子量脂肪族含氮碱, 具有促进细
胞生长与分裂、胚胎产生等多种生理功能。早期研
究表明, 外源多胺有利于橡胶树体胚的发生; Ja-
yashree等 [ 13] 比较腐胺 ( putresc ine)、精胺 ( sperm-
ine)、亚精胺 ( sperm id ine)等 3种多胺对橡胶树胚胎
发育的影响,结果表明使用 2mg /L精胺的胚胎发生
最多,达到 58%; 其次是 1 mg /L 的亚精胺, 达到
40%。随着精胺、亚精胺浓度的进一步提高, 胚胎发
生率反而减少。腐胺对体细胞的发生没有明显的
影响。
3. 5. 8 有机附加物 常用的有机附加物有椰子
水、干酪素水解物、香蕉粉和麦精等。研究表明, 培
养基中添加 5% - 10%的椰子水有利于胚状体的形
成。 Jayashree等 [ 13]的研究表明,在不同浓度的干酪
素水解物 ( 100、200、300和 400 mg /L )、椰子水
( 5%、10%、15%和 20% )、香蕉粉 ( 100、150、200和
250 mg /L )和麦精 ( 50、100、150和 200 mg /L )中,
200 mg /L 干酪素水解物最有利于胚胎的诱导
( 694% ), 150 mg /L香蕉粉最有利于胚胎的成熟
( 48% ), 400mg /L干酪素水解物、50 mg /L麦精或
200 mg /L香蕉粉最有利于胚胎的的萌发 ( 7% ) ; 椰
子水对胚胎诱导、成熟和萌发的最高比例分别
45%、35%和 5%。
3. 5. 9 抗褐化剂与活性炭 褐化是橡胶树组培
中存在的一个重要问题。外植体的褐化是机械损
伤和 /或农杆菌侵染导致酚类物质的大量合成与
释放、活性氧的崩发等所造成。为克服褐化现象,
常在培养基中加入硫醇复合物 ( th io l compounds)、
硫代硫酸钠 ( sod ium thiosu lphate)、二硫苏糖醇 ( d-i
thiothreito,l DTT )、L-半胱氨酸 ( L-cysteine)、维生素
C ( ascorb ic acid, V c)、聚乙烯吡咯烷酮 ( po lyv iny-
po lypyrro lidone, PVP)和 AgNO3等抗褐化剂。通过
降低褐化率和减轻褐化程度, 抗褐化剂可显著提
高 T-DNA的转移、瞬间和稳定表达率及外植体的
再生。
另外,花药培养中, 普遍认为活性炭可提高出苗
率。在橡胶树花药培养中,添加适量的活性炭, 可以
降低组织培养物产生的有害代谢物质 (包括酚类物质
氧化所产生的醌 )的浓度,从而有利于细胞生长和胚
状体的形成。王泽云等 [ 25]发现在脱分化培养基中添
加 005% - 01%活性炭,可成倍提高 RRIM 600等品
种的愈伤诱导率;在胚胎分化和出苗培养基中各添加
67
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
01%活性炭,胚状体分化率可提高数倍,而植株出苗
率提高近 1倍 [ 25] ; 此外, 也有研究表明, 在培养基中
加入活性碳可促进嫩茎腋芽的分化。
4 小结与展望
经过科研人员多年的努力, 农杆菌介导的橡胶
树遗传转化已取得了很大的进展, 然而, 到目前为
止,获得转化植株的橡胶树品种还是比较有限 (表
1) ,并且总体转化效率比较低。主要原因包括: 不
同橡胶树品种和外植体再生能力差异很大; 再生途
径单一,主要通过体细胞胚胎再生途径;胚胎再生途
径过程复杂,要经历愈伤诱导、胚胎诱导、胚状体分
化与再生等多个步骤, 再生周期过长 (一般都超过
半年 ); 即使是再生能力较强的品种, 愈伤诱导率、
胚胎诱导率、胚状体分化与再生率都很低;组培中外
植体很容易褐化,而褐化的外植体不能或很难再生;
农杆菌转化受体来源比较单一,主要为花药愈伤和
内珠被愈伤,而愈伤组织对环境胁迫非常敏感,农杆
菌侵染后很难再生; 不同品种来源的外植体对农杆
菌的敏感性差异较大。
农杆菌介导的遗传转化是农杆菌、植物受体及
环境条件共同作用的结果,是一个极其复杂的过程。
高效转化的前提是: 植物受体对转化菌株要比较敏
感,可分泌足够的 v ir诱导物 (即信号分子 ), 且不至
于产生超敏反应;具有转化细胞高效增殖的筛选体
系;转化细胞可高效地再生。由于影响农杆菌转化
效率的因素很多,转化体系的优化势必是一个很耗
时费力的过程,但其最终目标无外乎是保证高侵染
活力的农杆菌对受体材料的充分侵染;其次,要求侵
染后的外植体 (转化细胞 )保持较高的再生能力。
相信, 更多借鉴其它物种中成功的经验,将有助于进
一步提高农杆菌介导的橡胶树遗传转化效率。
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