全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 5期
朝天椒 Tm 2nv Like基因的同源克隆及其表达验证
于曙光 何忠诚 王恒 姜国勇
(青岛农业大学植物基因工程研究所,青岛 266109 )
摘 要: 番茄的 Tm2nv基因是一个 NBSLRR类型的病毒抗性基因。本研究以该基因的保守序列作为扩增引物, 对辣椒栽培
种朝天椒的基因组 DNA进行电子分析、同源扩增和表达验证,首次获得了具有 70%相似性的同源基因。生物信息学分析显示,朝天
椒 Tm2nvlike基因的 N端 289~ 300 nt处和 316~ 333 nt处分别含有 12和 18个碱基的插入,并且含有一个 ATP /GTP结合位点的基序
A( Ploop),以及 3个依赖于 cAMP和 cGMP的蛋白激酶磷酸化位点。这一结果对于辣椒抗病基因功能的研究具有重要意义。
关键词: 朝天椒 Tm2nvlike基因 同源克隆
Homologous Cloning and Expressing Verification ofTm 2nv like
Gene from Cannuum varconoids(M ill) Irish
Yu Shuguang H e Zhongcheng W ang H eng J iang Guoyong
( Institute of P lant Genetic Eng ineering, Q ingdaoAgricultural University, Q ingdao 266109)
Abstrac:t Tom atoTm2nv is aNBS LRR type an tiv ira l gene In this stud ies, w e obta ined a Tm2nvlike gene from Cannuum
varconoid es (M ill ) Ir ish w ith 70% identity bym eans of e lec tron ic ana ly sis, hom ologous amp lification and expressing ve rifica tion used
a design ing pr im er o f Tm 2nv DNA conserved sequence The b io inform atics ana lys is show ed that the Tm2nvlike gene conta ined an
ATP /GTP binding sitem otif A ( Ploop), three o f cAMP and cGM Pdependent pro tein kinase phosphory lation sites, and two insertions
in 289~ 300 n t and 316~ 333 nt of Nterm inals d iffered from Tom atoTm2nv gene Th is result played important ro le fo r the researches
o f resistancegene functions in pepper (Cannuum )
Key words: Cannuum varconoid es (M ill ) Ir ish Tm2nv like gene Hom ologous cloning
收稿日期: 20090216
基金项目:国家自然科学基金 ( 30771440 ),山东省科技攻关计划和青岛市科技攻关计划
作者简介:于曙光 ( 1978) ,女,讲师,从事生物化学和药物化学研究
通讯作者:姜国勇 ( 1960) ,教授, jianggu oyong99@ yahoo com cn
利用 G enB ank中已知 EST进行同科植物功能
基因的同源克隆或电子克隆,已经成为获取功能基
因的有效方法和途径。同源克隆的方法以速度快、
成本低、针对性强等优点, 对于分析等位基因的功能
极为方便。受基因组数据库和 EST数据库数量和
质量的限制,同源克隆技术多应用于人类、小鼠、拟
南芥和水稻基因等已经获得全基因组序列的近缘物
种或 BAC [ 1~ 3]。对于茄科作物、葫芦科、菊科等尚未
获得全基因组序列的物种来说,这一技术能够极大
地丰富已建立的基因库。
通过对番茄、马铃薯、辣椒等茄科作物基因进行
比对分析发现,一些功能基因在亲缘关系较近的科、
属、种间具有高度的一致性。为此,本研究以番茄病
毒抗性基因 Tm 2nv的 DNA序列设计扩增引物 [ 4] , 对
辣椒种的朝天椒 ( Cannuum varconoides (M ill ) I
rish)基因组 DNA进行扩增, 获得了一个抗病相关基
因的同源序列。生物信息学分析显示该序列与番茄
的 Tm2nv基因表达的氨基酸序列具有高度的同源
性, 并且具有抗病基因 NBSLRR的结构特点。这项
研究表明,利用茄科作物种间同源基因的保守特性,
采用现代生物信息学与实验验证相结合的技术是快
速筛选辣椒重要功能基因的一种有效方法。
1 材料和方法
11 引物设计
以番茄 Tm2nv基因 (AY742887)的 DNA序列作为
基础扩增引物,参阅它的等位基因 Tm22 (AF536201)、
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
Tm2(AF536200)以及 tm 2(AF536199)基因的核苷酸
序列设计长片段电子扩增引物 [ 4, 5] ,根据 PCR扩增引
物 PrRuG97C、PrRuG102C[ 6],采用 Prmi er Prem ier 50软
件设计 N对引物,由上海生工生物工程技术有限公司
合成。
12 朝天椒 DNA的提取及其同源克隆
朝天椒 DNA的提取采用 CTAB法提取的 DNA,
以引物 JP5A、JP6A实施 PCR 扩增, PCR 程序为
95 10m in; 95 30 s, 53 30 s, 72 25 m in, 42
个循环; 72 延伸 10m in。PCR产物回收后克隆至
载体 pMD18中 (上海生工 )。双向测序获得了长度
为 2 607 bp的 DNA扩增片段。
13 cDNA验证
采用 T riza l法提取朝天椒叶片的总 RNA, DN ase
I处理纯化后, 用 UNTO10柱式 mRNA抽提试剂盒
(上海生工 )获得 mRNA,随后用 MMLV第一链 cDNA
合成试剂盒 (上海生工 )获得反转录的 cDNA, 并利用
CA Adaptor建立 cDNA文库,再以引物 PrRuG97C、RA
primer引物 ( TAKARA )实施 PCR扩增, PCR产物回
收后克隆至载体 pMD18中,在 AB I3130测序仪上双
向测序, 验证已经克隆的长度为 2 607 bp的基因
产物。
14 序列分析
利用 DNAMAN 50进行番茄、辣椒已知 Tm2nv基
因同源基因的氨基酸序列比对, 并构建系统进化树。
利用 NCBI网站的 CDSearch服务 http: / /www. ncb.i
nlm. nih. gov /Structure /cdd / )来分析氨基酸序列的保守
结构域。
15 RTPCR验证
对朝天椒的根、茎、叶进行取样,提取总 RNA,利用
AMV Sing le Step RTPCR K it反转录试剂盒 (上海生工 )
实施 RTPCR验证,以总 RNA ( 5 g /l)为对照。PCR
特异性引物为 JP l5D ( 5GTTTCCATAGTTG GCATGC
CCGGT3)和 JP l6D ( 5AATTTCATGGTCCTC AGGTA
AAGGC3)。PCR程序为 94 5m in; 94 30 s, 55 30
s, 72 1m in, 35个循环; 72 延伸 10m in。取 10 l进行
1%琼脂糖凝胶电泳分析。
2 结果与分析
21 朝天椒 Tm 2nv基因的同源克隆
以番茄 Tm2nv基因的 DNA序列 ( AY742887)及等
位基因Tm22 (AF536201)、Tm2基因 (AF536200)和 tm
2基因 (AF536199)的核苷酸序列设计一长片段的电子
扩增序列,在 NCB I网站的 GenBank数据库进行 BLAST
检索,得到 N条与之高度同源的基因序列,随后进行多
次电子延伸,通过延伸序列的比较获得一个预设的核
苷酸序列。利用这个预设的核苷酸序列,采用 Prmi er
Prem ier 50软件设计多对 PCR扩增引物 JP5A、JP6A,
JP5B、JP6B、JP5C、JP6C等。分别以上述引物实施一对
一的 PCR扩增,回收 PCR长度大约为 2 600 bp的 DNA
扩增片段。克隆后测序,获得一条长度为 2 607 bp的
基因序列,该序列经过酶切验证,初步选择该 PCR扩增
产物是朝天椒 Tm2nv基因的同源序列 (图 1,图 2)。
黑体字显示 RTPCR验证序列;下划线显示朝天椒的特有序列
图 3 朝天椒 Tm2n vlike基因的 cDNA
序列 (显示 N端 1~ 1380)
22 cDNA验证
采用 T rizal法提取朝天椒叶片的总 RNA, DNase I
处理纯化后,用 UNTO10柱式 mRNA抽提试剂盒 (上
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2009年第 5期 于曙光等:朝天椒 Tm 2 nv L ike基因的同源克隆及其表达验证
海生工 )获得 mRNA,随后用 MMLV第一链 cDNA合成
试剂盒 (上海生工 )获得反转录的 cDNA, 并利用 CA
Adaptor建立 cDNA文库,再以引物 JP5A、RA prmi er引
物 (TAKARA)实施 PCR扩增, PCR产物回收后克隆至
载体 pMD18中,在 AB I3130测序仪上双向测序,验证
已经克隆的长度为 2 607 bp的基因产物 (图 3)。
23 RTPCR验证
分别提取朝天椒的根、茎、叶总 RNA,以 AMV Sin
gle Step RTPCR K it实施 RT PCR, 扩增产物长度为
720 bp(图 4)。图 4显示,朝天椒根、茎、叶的总 RNA均
含有保守的 Tm 2nv基因的同源序列, 表明该长度为
2 607 bp的基因克隆产物是朝天椒的 Tm 2nv like基因,
该基因登陆 GenBank,登录号为 FJ605517。
1朝天椒的根; 2朝天椒的茎; 3朝天椒的叶
图 4 朝天椒 Tm2n vlike基因的 RTPCR验证
24 朝天椒 Tm 2nv like基因的序列分析
利用 DNAMAN 60进行 Tm2nv基因、Tm22基因、
tm 2基因以及朝天椒 Tm2nv like基因的氨基酸序列
比对,并构建系统进化树,进化关系如图 5所示。图 5
显示,朝天椒 Tm 2nv like基因编码蛋白的氨基酸序列
与番茄的 Tm 2nv基因同源性为 712%,与番茄的 Tm
2
2基因同源性为 713% ,与番茄的 tm2基因同源性
为 709%。序列分析还表明,朝天椒Tm2nv like基因
的 N端 289~ 300 nt和 316~ 333 nt处分别含有 12和
18个碱基的插入 (图 3)。
图 5 朝天椒 Tm2n vlike基因的氨基酸序
列与番茄 Tm2n v的同源性比较
利用 CDSearch服务来分析氨基酸序列,发现朝
天椒 Tm2nv like基因具有如下结构特点: ( 1)拥有 15
个磷酸化位点,其中蛋白激酶 C ( Protein kinase C)的磷
酸化位点 10个,酪蛋白激酶 II( Case in kinase II)的磷
酸化位点 5个; ( 2)位于 194~ 201氨基酸残基的 ATP /
GTP结合位点的基序 A ( Ploop) ,其氨基酸序列为
Gmpg lGKT; ( 3)位于 522~ 525、624~ 627、862~ 865的氨
基酸残基是依赖于 cAMP和 cGMP蛋白激酶磷酸化位
点 ( RR iT /S) ; ( 4)位于 323~ 326、736~ 739氨基酸残基
的糖基化位点 (Ng lycosy lation, NNSL /NLSF)。
3 讨论
朝天椒是辣椒栽培种的 ( Cannuum )的一个变
种,因其高产、优质和抗病性强、适应性广而在国内外
广泛种植。在实施茄科作物基因组学的研究过程中,
通过同源克隆技术获得辣椒的同源序列,可以丰富辣
椒的基因资源。朝天椒 Tm 2nv like基因 ( FJ605517)
的克隆及其与番茄 Tm 2nv进化关系的比较表明,朝天
椒 Tm 2nv like基因所表达的氨基酸序列与番茄同源
基因表达的序列具有高度的同源性,并且具有典型的
NBSLRR结构特点和膜蛋白受体激酶的特征。因
此,本研究以番茄病毒抗性基因 Tm2nv的 DNA保守
序列作为扩增引物, 对辣椒栽培种朝天椒的基因组
DNA进行电子分析、同源扩增和表达验证,首次获得
了具有 70%相似性的同源基因。生物信息学分析显
示,朝天椒 Tm2nv like基因的 N端 289~ 300 nt和
316~ 333 nt处分别含有 12和 18个碱基的插入,与番
茄的 Tm 2nv表现出明显的差异,这一特点对于辣椒编
码蛋白的抗病功能表达研究具有重要意义。目前,尚
不知道 N端两处碱基的插入是否是辣椒栽培种的特
有序列,还是朝天椒这个变种的特有序列,进一步的
分析和验证将有助于辣椒分子育种研究的深入开展。
参 考 文 献
1 骆蒙,等 生物化学与生物物理进展, 2001, 28( 4 ): 494~ 497
2 郎显宇,等 生物数学学报, 2006, 21( 4 ) : 619~ 626
3 刘媛,等.遗传, 2008, 30 ( 03) : 257~ 262.
4 姜国勇,等 园艺学报, 2007, 34( 1) : 393~ 396
5 Lan ferm eijer FC, et alPlant Scien ce, 2004, 167: 687~ 692
6 姜国勇,等 病毒学报, 2003, 19( 4 ): 365~ 370
7 姜国勇,等 病毒学报, 2004, 20( 4) : 359~ 363
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