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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 9期
牡丹 CTR1基因家族基因片段及其 cDNA 3


末端的克隆与序列分析
高娟 董丽
(北京林业大学园林学院 国家花卉工程技术研究中心,北京 100083)


摘
要:
以牡丹品种
洛阳红
(Paeonia suffru ticosa
Luo Yang H ong
)花瓣为材料, 用 CTAB法提取总 RNA, 根据已报
道的 CTR1( Constitutive T r iple Response 1)蛋白的保守氨基酸序列设计简并引物 , 通过 RT
PCR扩增得到 3条牡丹 CTR1基
因同源片段。利用其已知中间序列, 通过 3
快速扩增 cDNA末端技术 ( 3
RACE)及序列拼接 ,最终得到了这 3个基因片段除
5
末端外的全部 cDNA序列, 分别命名为 PsCTR1、PsCTR2和 PsCTR3。分析结果表明, 由 PsCTR1、PsCTR2和 PsCTR3基因
翻译的氨基酸片段与拟南芥和番茄的 CTR1蛋白氨基酸序列的同源性均较高, 分别为 88% 和 85% ; 61%和 61% 以及 70%
和 69%。
关键词:
牡丹 CTR1 RT
PCR RACE 序列分析
Cloning and Sequence Analysis of CTR1Gene Fam ily Sequences and
Its 3
cDNA Ends from Tree Peony
Gao Juan Dong L i
(College of Landscap eA rchitecture of Beijing Forestry University, N ational F lower Eng ineering Technology Research Center, B eijing 100083)


Abstrac:t
To tal RNA w as ex tracted from peta ls of
LuoyangH ong
tree peony(P aeonia suffruticosa) w ith CTAB m ethod, and two
pa irs of degenera ted pr ime rs w ere designed based on the repo rted conserved am ino ac id sequence of Constitutiv e T rip le Response 1
( CTR1) . Three cDNA fragm ents were am plified by RT
PCR, and then the ir sequences except the 5
cDNA end w ere obta ined by 3

RACE and sequence sp liced. They are nam ed PsCTR1, P sCTR2 and PsCTR3. Sequence analysis ind ica ted that the pred icated am ino
acid residues wh ich encodes shared m ore than 60% hom o logy w ith CTR1 ofA rabidops is, toma to and so on.
Key words:
T ree peony
CTR1
RT
PCR
RACE
Sequence ana lysis
收稿日期: 2010
01
28
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30972030) ,教育部博士点基金项目 ( 20060022008)
作者简介:高娟,女,在读硕士,研究方向:切花采后; E
ma i:l gaojuan15@ sohu
com
通讯作者:董丽,女,教授,长期从事园林植物与观赏园艺方面的教学和研究; E
m ai:l dongleah@ yahoo
com
cn
牡丹 (Paeonia suff ruticosa )是中国的特产名花,
初为药用,至隋代始做观赏用途。牡丹在古代即有
作为切花瓶插的记载,瓶插牡丹还有着
平安富贵

的美誉,但是牡丹短暂集中的自然花期严重制约了
其切花的产业化发展。前人研究表明, 牡丹切花乙
烯的大量产生是促使其衰老的重要生理原因之一,
其切花开花衰老与乙烯的关系也非常复杂 [ 1- 3 ]。因
此,研究从生物合成途径和信号转导途径对乙烯生
成的调控是揭示牡丹切花衰老机理的重要内容。
M a等 [ 4]的研究表明, 对于延长切花月季的花期来
说, 阻断乙烯信号的转导途径比阻断乙烯的生物合
成途径更加有效, 说明乙烯信号的转导途径更加关
键。而 CTR1蛋白就是乙烯信号转导途径的关键调
控因子,是乙烯响应的负调控因子 [ 5- 7]。自从拟南
芥 ( Arab idop sis thaliana )的乙烯信号转导途径被揭
示以来,番茄 (Ly cop ersicum esculentum ) [ 8]、月季 (Ro

sa hybrida )
[ 9 ]、西洋梨 ( Py rus commun is ) [ 10]、李
(P runus salicina)
[ 11]、猕猴桃 (Actinidia chinensis ) [ 12]
等多种植物的 CTR1基因相继被克隆。本研究以牡
丹乙烯跃变型品种
洛阳红
为试材, 利用 RT
PCR
2010年第 9期



高娟等 :牡丹 CTR1基因家族基因片段及其 cDNA 3

末端的克隆与序列分析
及 3
RACE技术拟克隆牡丹 CTR1基因家族的 3个
成员 PsCTR1、PsCTR2和 PsCTR3的基因片段, 并对
其进行了序列分析, 为揭示乙烯在牡丹采后开花和
衰老进程中的作用模式和调控机制奠定了基础。
1
材料与方法
1
1
供试材料
牡丹品种
洛阳红
的切花取自于河南省洛阳
市卫坡村的大田中。采收级别为开花指数为 1级的
切花 [ 1] , 24 h内运回实验室。只取切花中层花瓣
(即从花瓣由外至内数的第 3层开始取 ) , 每 2 g用
锡箔纸包好后液氮速冻,存于 - 80
冰箱。
试验所用的大肠杆菌菌株为 E. coli DH5
(购
自北京全式金生物技术有限公司 ) , 克隆载体
pGEM
T easy, M
MLV反转录酶和 T4 DNA连接酶均
购自 Prom ega生物公司。引物合成由北京奥科生物
技术有限责任公司完成, DNA序列测定委托上海生
工生物工程技术服务有限公司北京分公司完成。
1
2
试验方法
1
2
1
总 RNA的提取 花瓣总 RNA的提取采用
CTAB法 [ 13]。
1
2
2
简并引物的设计 根据 G enB ank中已经报
道的拟南芥、番茄、月季等植物的 CTR1基因的 mR

NA保守区序列设计 3对简并引物 P1、P2和 P3( P1

F: 5

GTTGCTGTGAA ( AG ) AT ( AT ) CT ( ATC )
ATGG
3
, P1
R: 5

CC ( ATC ) ACAGCTGA ( TGC ) AC
(AT )ACC
3
; P2
F: 5

T(AT ) GT (GCT) CT( GCT ) TT
( TC ) ATGGGTGC
3
, P2
R: 5

G ( TC ) TCATCACG
(AGC) AG( AG) ACTT
3
; P3
F: 5

GCTA( TGC ) GCA
( TGC) AAG( A ) GGA ( TGC) ATGAAC ( T ) TA
3
, P3

R: 5

CCTCA ( TGC ) GGA ( TGC ) GCCATCCAC ( T )
TC
3
) ,其中 P1和 P2为巢氏引物。
1
2
3
RT
PCR基因克隆 以 RNA反转录产物
cDNA第 1链为模板, 进行 RT
PCR。 PCR反应体系
(总体积 25
L)如下: 上下游引物 ( 10 U /
L )各
1
L, dNTP( 2
5 mmol /
L ) 2
L, 模板 cDNA 1
L,
Taq DNA 聚合酶 ( 5 U /
L ) 0
5
L, 10
buffer
2
5
L, M gC l2 ( 25mmo l/
L) 1
5
L, ddH2O 15
5
L。
用引物 P1和引物 P2进行巢氏 PCR扩增: 第一
次扩增的 PCR产物稀释 50倍后取 1
L进行第二
次 PCR扩增。引物 P1按以下 PCR程序扩增: 94

预变性 5m in; 94
50 s, 49
30 s, 72
50 s, 32个循
环; 72
10 m in。引物 P2按以下 PCR程序扩增:
94
预变性 5m in; 94
50 s, 46
30 s, 72
50 s, 30
个循环; 72
10m in。引物 P3单独按照以下 PCR程
序扩增: 94
预变性 5 m in; 94
50 s, 54
30 s, 72

50 s, 30个循环; 72
10m in。
凝胶回收与预期片段大小一致的泳带,连接克
隆载体并转化感受态细胞, 通过蓝白斑筛选及质粒
酶切鉴定后,进行序列测定。
1
2
4
3
RACE扩增 参照试剂盒 SMARTTM RACE
cDNA Amp lification K it的说明书进行 3
RACE扩增。
设计 3
接头引物 AP: 5

GGCCACGCGTCGACTAG

TAC( T) 16
3
以及 3
通用引物UAP: 5

GGCCACGC

GTCGACTAGTAC
3
。
3
cDNA的合成: 取 1
g的总 RNA加入 2
L
AP( 100U /
L) ,加 DEPC ddH2O至 9
5
L, 70
水
浴 5 m in, 然后立即冰浴 2 m in, 再依次加入以下成
分: M
MLV 5
bu ffer 5
L, dNTP ( 2
5 mmo l/L ) 5

L, R ibonuclease inh ib itor 0
5
L, M
MLV RT 1
L,
加入 DEPC ddH 2O补足体积至 25
L, 42
反应 90
m in, 反应终止后存于 - 80
冰箱。
3
RACE扩增体系及程序:根据 RT
PCR克隆出
来的 CTR1同源片段 G1、G2、G3分别设计其 3

RACE巢氏特异引物 T1、T2; T3、T4; T5、T6( T1: 5


CGCAATCCTCCTGTCGTTCATCG
3
; T2: 5

CAGTA

AAGGTTTGTGATTTTGGTC
3
; T3: 5

CATTGTTACG

GAGTTCCTGCCACG
3
; T4: 5

TAGATTGGAGACG

GCGTATTCACAT
3
; T5: 5

ACGGCGAATGAGAAT

GGCACTTGA
3
; T 6: 5

CTACTGCTGGAACGCCT

GAATGGAT
3
)。 3
RACE扩增体系 (总体积 25
L):
3
通用引物 UAP和 3
RACE特异引物 ( 10 U /
L)各
1
L, dNTP( 2
5 mmo l/
L) 2
L, 3
cDNA模板 (原
始浓度稀释 50倍 ) 1
L, Taq DNA聚合酶 ( 5 U /
L)
0
5
L, 10
buffer 2
5
L, M gC l2 ( 25 mmo l/
L) 1
5

L, ddH2O 15
5
L。 3
RACE扩增程序如下: 94

预变性 5 m in; 94
40 s, 退火 ( T1为 60
, T2为
59
, T3和 T4为 61
, T5和 T6为 62
) 30 s, 72

1m in 30 s, 30个循环; 72
10 m in。凝胶回收与预
期片段大小一致的泳带, 连接克隆载体并转化感受
态细胞,通过蓝白斑筛选及质粒酶切鉴定后,进行序
101
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 9期
列测定。
2
结果与分析
2
1
牡丹 CTR1基因同源片段的克隆
利用简并引物 P3进行 PCR扩增后得到 195 bp
的预期片段 (图 1
A ),将测序后的基因片段命名为
G1。用 P1和 P2进行巢氏 PCR扩增后得到约 350
bp的预期片段 (图 1
B ) ,经过测序后得到两个不同
的基因片段,分别命名为 G2( 351 bp)和 G3( 346 bp)。
A: M. m ark er; 1. 195 bp的预期片段; B: M. m arker; 1- 4.约 350 bp的预期片段
图 1 牡丹 CTR1基因片段 RT
PCR扩增电泳图
经 B last同源性分析发现,由片段 G1翻译的氨
基酸序列与李、桃 ( Prunus p ersica )、欧洲李 (P runus
domestica)、番茄、猕猴桃、月季、拟南芥的 CTR1蛋
白的氨基酸同源性都较高, 分别达到了 87%, 87% ,
87%, 86%, 86%, 84%和 81% ;由片段 G2翻译的氨
基酸序列与月季 CTR1和 CTR2蛋白的氨基酸同源
性分别为 68%和 67%, 与猕猴桃的 CTR1蛋白的氨
基酸同源性为 67% ; 由片段 G3翻译的氨基酸序列
与月季 CTR1和 CTR2蛋白的氨基酸同源性分别为
79%和 81% , 与水稻 ( Oryza Sativa )和猕猴桃 CTR1
蛋白的氨基酸同源性分别 83%和 76%, 与番茄 TC

TR2蛋白的氨基酸同源性为 79%。由此确定试验
所克隆到的 3个基因片段 G1、G2、G3均为 CTR1基
因, 是牡丹 CTR1基因家族成员,并分别命名为 PsC

TR1、PsCTR2和 PsCTR3。
2
2
PsCTR1、PsCTR2和 PsCTR3基因 3

末端序列
的克隆及其拼接序列分析
凝胶电泳分析 PsCTR1、PsCTR2和 PsCTR3基
因的 3
RACE产物 (图 2
A, B, C) , 其测序的结果表
明, 克隆到的 PsCTR1、PsCTR2和 PsCTR3基因的 3


末端片段长度分别为 851 bp、668 bp、562 bp, 经
B last同源性检索后推断所得片段即为目的基因 3


末端序列。
A: M. m arker; 1- 3. PsCTR1的 3
RACE基因片段; B: M. m arker; 1- 2. PsCTR2的 3
RACE基因片段;
C: M . m arker; 1 - 2. PsCTR3的 3
RACE基因片段
图 2
牡丹 PsCTR1、PsCTR2和 PsCTR3基因 3
RACE基因片段扩增电泳图
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2010年第 9期



高娟等 :牡丹 CTR1基因家族基因片段及其 cDNA 3

末端的克隆与序列分析
将 RT
PCR及 3
RACE的扩增片段拼接后得到
PsCTR1、PsCTR2和 PsCTR3除 5

末端外的全部基
因序列,其长度分别为 947 bp、800 bp和 887 bp。利
用 NCB I提供的 ORF Finder进行分析发现,克隆到
的 PsCTR1基因片段包含一个 495 bp的开放阅读框
和一个 po ly( A )尾巴, 3

末端非编码区为 438 bp,编
码 164个氨基酸; PsCTR2基因片段包含一个 657 bp
的开放阅读框和一个 poly( A )尾巴, 3

末端非编码
区为 133 bp, 编码 218个氨基酸; PsCTR3基因片段
包含一个 630 bp的开放阅读框和一个 poly ( A )尾
巴, 3

末端非编码区为 246 bp,编码 209个氨基酸。
由拟南芥 A tCTR1和番茄 LeCTR1等的 CTR1
蛋白分析可知,在 CTR1蛋白的 C
端含有 11个保守
的丝氨酸 /苏氨酸激酶区亚结构域,并包含 1个保守
的 ATP绑定位点和 1个丝氨酸 /苏氨酸蛋白酶位
点 [ 14]。克隆得到的 PsCTR1基因片段翻译成的氨基
酸序列包含有 11个丝氨酸 /苏氨酸激酶区亚结构域
中的 6个,并包含有保守的丝氨酸 /苏氨酸蛋白酶位
点, 但不包含 ATP绑定位点 (图 3) , 由它翻译的氨
基酸片段与拟南芥 A tCTR1、番茄 LeCTR1、枇杷 E jC

TR1 ( Eriobo trya japonica )、桃 PpCTR1、苹果 (Malus
domestica )M dCTR1的 CTR1蛋白氨基酸序列的同源
性分别为 88%、85%、90%、92%、88%。 PsCTR2和
PsCTR3基因片段则包含有 8个丝氨酸 /苏氨酸激酶
区亚结构域,并包含有保守的丝氨酸 /苏氨酸蛋白酶
位点,但不包含 ATP绑定位点 (图 4, 图 5), 由 PsC

TR2基因翻译的氨基酸片段与拟南芥 A tCTR1、番茄
LeCTR1、苹果 MdCTR1、猕猴桃 A dCTR1的 CTR1蛋
白氨基酸序列的同源性分别为 61%、61%、62%、
63% ;由 PsCTR3基因翻译的氨基酸片段与拟南芥
A tCTR1、番茄 LeCTR1、桃 PpCTR1、苹果 MdCTR1和
月季 PhCTR2的 CTR1蛋白氨基酸序列的同源性分
别为 70%、69%、66%、66%和 78%。
数字表示保守的丝氨酸 /苏氨酸激酶区亚结构域,下划线表示丝氨酸 /苏氨酸蛋白酶位点
图 3
P sCTR1基因片段翻译的蛋白与拟南芥 AtCTR1、番茄 LeCTR1、枇杷 EjCTR1、苹果MdCTR1的 CTR1蛋白氨
基酸序列的同源性比较
3
小结
乙烯在植物的发育和衰老过程中具有不可替代
的作用,它是启动植物衰老机制的一个信号。了解
乙烯信号转导途径中各调控因子的作用对于更好地
揭示乙烯的作用机制是非常必要的。目前的研究表
明, CTR1基因编码的蛋白在乙烯信号转导途径中
充当负调控因子的角色 [ 5]。本研究利用其它植物
的 CTR1基因保守区设计简并引物, 从而成功地克
隆到了牡丹 CTR1基因家族的 3个成员的基因片
段, 分别命名为 PsCTR1、PsCTR2和 PsCTR3。此前
的研究表明, 在番茄、马铃薯 ( Solanum tuberosum )、
莴苣 ( Lactuca sativa )、大豆 ( G lycine max )和水稻
( Oryza sativa)等植物中都存在一个小型的 CTR1基
因家族。本研究的成果更加证明了 CTR1是一个基
因家族。另外,本研究为下一步通过 5
RACE扩增
出基因的全长, 从而进一步研究牡丹 CTR1家族成
员及其各自在牡丹切花衰老过程中的调控机理奠定
了良好的基础。
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 9期
数字表示保守的丝氨酸 /苏氨酸激酶区亚结构域,下划线表示丝氨酸 /苏氨酸蛋白酶位点
图 4
P sCTR2基因片段翻译的蛋白与拟南芥 A tCTR1、番茄 LeCTR1、桃 PpCTR1、苹果M dCTR1、猕猴桃 AdCTR1
的 CTR1蛋白氨基酸序列的同源性比较
数字表示保守的丝氨酸 /苏氨酸激酶区亚结构域,下划线表示丝氨酸 /苏氨酸蛋白酶位点
图 5
P sCTR3基因片段翻译的蛋白与拟南芥 A tCTR1、番茄 LeCTR1、桃 PpCTR1、苹果M dCTR1、猕猴桃 AdCTR1
的 CTR1蛋白氨基酸序列的同源性比较
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2010年第 9期



高娟等 :牡丹 CTR1基因家族基因片段及其 cDNA 3

末端的克隆与序列分析
参 考 文 献
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