全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLO GY　BULL ETIN 2009年第 9期
落叶松体细胞胚胎发生诱导多倍体的研究
张清国 1, 2 　韩素英 2 　梁国鲁 1 　齐力旺 2
(1 西南大学园艺园林学院 ,重庆 400716; 2 中国林科院林业研究所细胞生物学实验室 ,北京 100091)
　　摘 　要 : 　通过检测细胞系增值率及细胞分裂指数确定细胞系分裂最旺盛时期 ,利用秋水仙素和氨磺灵诱导落叶松多倍
体体细胞胚胎的发生 ,揭示了两种抗微管物质对落叶松体细胞胚胎发生的影响。秋水仙素在浓度为 500 mg·L - 1 ,浸泡处理
36 h时能使多倍体体细胞胚胎发生的比例达到 85. 2% ,体细胞胚发生率达到 351. 1个 / g;氨磺灵在 1～5 mg·L - 1的浓度下处
理后的细胞系几乎失去体细胞胚分化能力 ,无法大量获得多倍体体细胞胚。通过细胞压片及去壁 2低渗涂片对比观察发现氨
磺灵诱导后的细胞系除了染色体数目加倍外还有部分细胞发生程序性死亡。该研究初步证明了秋水仙素较适合落叶松多倍
体体细胞胚的诱导 ,氨磺灵对落叶松毒害明显 ,不适合其多倍体的诱导。
关键词 : 　秋水仙素 　落叶松 　氨磺灵 　多倍体 　体细胞胚胎发生
Study of Polyploid Induction by Somatic Embryogenesis of L a rix ssp.
Zhang Q ingguo1, 2 　Han Suying2 　L iang Guolu1 　Q i L iwang2
(1 College of Horticulture and Landscape, Southw est University, Chongqing 400716; 2 Laboratory of
Cell B iology, Research Institu te of Forestry, Chinese Academ y of Forestry, B eijing 100091)
　　Abs trac t: 　V igorous growth period of L a rix cell lines were investigated by cell m itotic index, and two antim icrotubule agents col2
chicine and oryzalin were evaluated for their ability on inducing polyp loidy of L a rix by somatic embryogenesis. Colchicine was found
to be the most effective on inducing polyp loidy embryos at the concentration of 500 mg·L - 1 for 36 h, the inductive frequency was
85. 2% and somatic embryogenic ratio was 351. 1 /g. However, the oryzaline could not induce polyp loidy of L arix in normal somatic
embryos under the concentration from 1 mg·L - 1 to 5 mg·L - 1. U sing the squash method, wall degradation and hypotonic treatment,
both chromosomes and cytological characters change of the cell lines were induced. The results showed that the chromosome number
were double in some cells after induced by colchicines solution, and apop totic bodies were found in most of the cells induced
by oryzalin.
Key wo rds: 　Colchicine　L arix　O ryzalin　Polyp loidy　Somatic embryogenic
收稿日期 : 2009204214
基金项目 :国家“863”项目 (2006AA100109, 2008AA10Z126) ,国家自然科学基金重点项目 ( 30830086) ,国家“973”项目 ( 2009CB119100) ,国家
林业局“948”创新项目
作者简介 :张清国 (19852) ,男 ,硕士研究生 ,研究方向 :细胞遗传及生物技术 ; Tel: 010262888881, E2mail: zhangqg2005@126. com
通讯作者 :齐力旺 (19622) ,男 ,研究员 ,博导 ,研究方向 :树木遗传学 ; Tel: 010262888445, E2mail: lwqi@caf. ac. cn　　落叶松 (L arix)作为垂直分布达到森林分布的最上限的乔木 ,是北半球温寒带的重要造林树种和经济用材树木 ,具有生长快、抗逆性强、天然分布广以及材质坚韧、结构细致、抗腐性强等特点 ,在建筑、桥梁、家具等方面的用途与需求较大 ,在商品材生产中的优先地位推进了其遗传改良育种快速发展 [ 1 ]。多倍化及多倍体育种研究已成为一个热点 [ 2～4 ] ,在林业中 ,多倍体桑树和杨树等速生、高产品种选育已经给生产带来了极大效益 [ 5～7 ]。而针叶树多倍体研 究不足 ,目前 ,仅有多倍体日本柳杉选育成功并应用于遗传改良 [ 8 ]。获得多倍体途径包括 2n配子诱导 ,体细胞离体化学物理诱导染色体加倍等 ,近年来化学药剂诱导结合组织培养技术的快速发展使化学诱变成为获得人工多倍体主要的快捷途径。在离体培养中 ,松科植物共同存在生根难 ,生长缓慢两个瓶颈 ,体外诱导变异再生植株更是不易 ,可喜的是自上个世纪末 Klimaszewska等 [ 9 ]报道了成功建立落叶松体细胞胚胎发生途径获得落叶松植株的体系以及
2009年第 9期 张清国等 :落叶松体细胞胚胎发生诱导多倍体的研究
Lelu、齐力旺等 [ 10～12 ]对落叶松体细胞胚胎发生的进
一步优化及遗传转化体系建立的探索 ,使得通过生
物技术手段诱导多倍体落叶松成为可能。目前通过
体细胞胚胎发生途径诱导多倍体的研究甚少 ,未见
针叶树相关报道 ,我们试图建立一个多倍体发生的
新体系。
本研究以高效稳定的落叶松体细胞胚胎发生细
胞系为材料 ,以秋水仙素 ( colchicine)和除草剂氨磺
灵 (oryzalin)为诱导剂 ,通过细胞分裂指数确定诱导
时机 ,就落叶松体细胞胚胎发生率和多倍体获得率的
实际诱导效果进行了研究 ,建立落叶松多倍体体细胞
胚胎发生体系 ,为获得落叶松多倍体建立一个技术平
台乃至为针叶树多倍化的研究、优良多倍体针叶树选
育以及多倍体体细胞发育、多倍化对针叶树基因组变
异的作用等相关研究建立一个技术体系。
1　材料与方法
111　试验材料
中国林科院林业研究所细胞生物学实验室诱导保
存的高效稳定落叶松胚性细胞系 a214 (Larix kaem pferi)
和 n1 (Larix kaem pferi ×Larix olgensis)。
112　培养条件
继代培养基和体细胞胚分化培养基采用齐力旺
等 (2000, 2004)的配方 , 22～25℃暗培养 [ 12, 13 ]。
113　胚性细胞系生长率测定
在继代培养基中为分别接种继代培养 13 d的
落叶松细胞系约 30 g·L - 1、45 g·L - 1、60 g·L - 1。从
培养 24 h后开始每间隔 3 d取样一次样称细胞系重
量 ,培养 31 d为一周期 ,重复 3次。
细胞系增殖量 =细胞实时重量 -接种细胞重量
细胞系增殖率 =细胞系增殖量 /接种重量 ×100%
114　细胞有丝分裂指数的测定
以继代培养 13 d的稳定高效胚性细胞系为材
料 ,接种量约为 45 g·L - 1进行继代培养 ,每隔 24 h
取样一次 ,立即用卡诺固定液固定。细胞标本制作
采用去壁低渗 2火焰干燥法 [ 14 ]并略加改进。随机取
细胞约 0. 5 g,立即用卡诺固定液 (甲醇 ∶醋酸 =
3∶1)固定 , 3%纤维素酶和果胶酶混合液酶解 2 h,
重蒸水低渗 15 m in, 1 000 r/m in离心 10 m in,收集细
胞 ,卡诺固定液再固定 30 m in,火焰干燥涂片。5%
Giem sa染色 5～10 m in,冲洗晾干。随机显微观察 3
个视野 ,每个样本计数 1 000个以上细胞 ,分别计数
分裂期和非分裂期细胞 ,计算细胞分裂指数。
细胞分裂指数 ( % ) =分裂期细胞数 /全部细胞
数 ×100%
115　药剂处理
取处于继代培养生长旺盛的落叶松胚性细胞
系 ,分别在 200、500、800和 1 000 mg·L - 1浓度的秋
水仙素水溶液和 1、2、4及 5 mg·L - 1浓度的氨磺灵
水溶液中浸泡 12、24、36、48 h。处理后的细胞用无
菌水洗去处理溶液 ,无菌纸吸干 ,接种到体细胞胚分
化培养基中培养。对照组为无菌水浸泡 24 h,吸干
无菌水 ,分化培养。
116　落叶松体细胞胚发生率及多倍体发生率的
测定
处理后的胚性细胞系在成熟培养基中分化培养
35 d时 ,随机选取 3块细胞团发育而来的体细胞胚 ,
去壁低渗法涂片 ,检测染色体变化 ,重复 3次。
体细胞胚变异率 =染色体变异体细胞胚数 /检
测体细胞胚数 ×100%
体细胞胚胎发生率 (个 / g细胞 ) =体细胞胚发
生数目 /接种细胞重量
2　结果与分析
211　细胞接种量与细胞系增殖量及增殖率的关系
不同接种量对胚性细胞系在增殖培养基上增殖
效果有较明显的影响。细胞增殖量随培养时间的变
化而变化 (图 1) ,继代培养第 10 d以后 ,细胞系进
1. 1d; 2. 4d; 3. 7d; 4. 10d; 5. 13d; 6. 16d;
7. 19d; 8. 22d; 9. 25d; 10. 28d; 11. 31d
图 1　细胞增殖量曲线
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
1. 1d; 2. 4d; 3. 7d; 4. 10d; 5. 13d; 6. 16d; 7. 19d;
8. 22d; 9. 25d; 10. 28d; 11. 31d
图 2　细胞增殖率曲线
入对数生长期 ,之后减缓直到第 31 d所有试验组的
细胞系增殖量都接近 250 g·L - 1 ,其中 50. 24 g·L - 1
接种量试验组在第 19天增殖量达到 188. 35 g·L - 1
后 ,最先进入增殖平缓期。细胞最终增殖率随接种
量的增大而减小 (图 2)。50. 24 g·L - 1接种量试验
组在第 19 d增值率高于其他两组 ,随后趋于平缓。
40. 24 g·L - 1组则一直保持较高的增殖率到第 25 d。
64. 55 g·L - 1组增殖率始终比较缓慢 ,增殖量变化与
40. 24 g·L - 1组相近。
212　继代培养周期内的细胞分裂指数变化
试验中检测到细胞系生长变化量和继代天数
有一定的联系 ,通过细胞分裂指数检测进一步说
明落叶松胚性细胞在继代周期中同步化变化规律
(图 3)。继代周期初期分裂指数较快增长从 3. 9%迅
速增长到 8. 1% ,前中期保持在 6. 2% ～8. 6%之间 ,
中后期则普遍高于 12. 9% ,最高分裂指数达到
16. 8% ,后期分裂指数迅速下降 , 从第 16 d 的
12. 9%下降为第 20 d的 5. 0%。出现升缓升降的规
律的原因是初期加入的新鲜培养基次生代谢物未积
累 ,细胞系细胞分裂指数程较快增大 ,因培养基和培
养物之间的接触以及营养吸收转化需要一个适应
期 ,随后分裂指数趋于平稳后再次快速上升达到一
个较高的平缓期 ,之后因营养消耗细胞生长养分需
求不足以及次生代谢积累导致分裂指数骤降。
1. 1d; 2. 3d; 3. 5d; 4. 7d; 5. 9d; 6. 11d; 7. 13d; 8. 15d; 9. 17d; 10. 19d
图 3　继代周期内细胞分裂指数
213　秋水仙素对落叶松体细胞胚发生的影响
秋水仙素溶液浸泡是对外植体最直接的处理方
式 ,结果表明 ,胚性细胞系在不同秋水仙素水溶液处
理后能分化出一定比例的多倍体体细胞胚。同时 ,
体细胞胚分化也收到不同程度的抑制 ,甚至完全不
分化 (表 1)。从表 1中可以看出 ,秋水仙素处理浓
度和处理时间以 500 mg·L - 1处理 36 h为最佳组合 ,
加倍率 ( 85. 2% )、分化率 ( 351. 1个 /g)和纯合比
(63∶6)较都高。
表 1　秋水仙素溶液浸泡对落叶松体细胞胚发生的影响
秋水仙素
(mg·L21 ) 浸泡时间 ( h) 体细胞胚发生率 (个 / g) 检测数 获得多倍体情况 (个 )4x 嵌合体 诱导率( % )
0 24 373. 0. 85 0 0 0. 0
200 12 342. 1 81 3 18 25. 9
200 24 357. 6 87 24 6 34. 5
200 36 344. 5 90 42 3 50. 0
200 48 335. 9 102 51 9 58. 8
500 12 354. 7 64 34 10 68. 8
500 24 369. 5 67 44 9 79. 1
500 36 351. 1 81 63 6 85. 2
500 48 357. 8 84 54 9 75. 0
800 12 313. 8 74 16 6 29. 7
800 24 236. 4 70 22 6 40. 0
800 36 81. 7 81 63 6 85. 2
800 48 0 0 0 0 0
1000 12 197. 8 81 30 3 40. 7
1000 24 122. 3 81 48 6 66. 7
1000 36 5. 9 36 4 0 11. 1
1000 48 0 0 0 0 0
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2009年第 9期 张清国等 :落叶松体细胞胚胎发生诱导多倍体的研究
214　氨磺灵对落叶松体细胞胚发生的影响
A. 正常分化的体细胞胚 ; B. 5 mg·L - 1氨磺灵诱导 12 h;
C. 1mg·L - 1氨磺灵诱导 12 h; D. 5mg·L - 1氨磺
灵混合 250mg·L - 1秋水仙水溶液处理 24 h
图 4　氨磺灵对体细胞胚分化的影响
A. 四倍体落叶松细胞染色体 ; B. 二倍体落叶松细胞染色体
图 5　落叶松细胞染色体观察
试验中采用了 1、2、4和 5 mg·L - 1 4个浓度的氨
磺灵水溶液浸泡落叶松胚性细胞系 12、24、36和 48
h,对照组为无菌水浸泡 24 h直接分化 (图 42A )。5
mg·L21处理组除 12 h分化极少量发育形态较好的
体细胞胚 (图 42B ) ,其余细胞完全死亡和失去分化
能力。剩余处理组均可继续生长 ,但分化能力极差
且大部分体细胞胚畸形 ,表现为胚柄去分化 (图 42
C)。畸形体细胞胚占绝大多数 ,并且正常体细胞胚
中没有发现多倍体 ,仅有的两个四倍体为畸形胚中
被检测到。通过品红压片以及去壁 2低渗涂片观察
诱导后细胞系细胞学变化 ,氨磺灵除了诱导细胞染
色体加倍 (图 5) ,同时也存在诱导细胞发生凋亡 (图
6)。
图 6　氨黄灵诱导细胞凋亡
同时 ,也在氨磺灵水溶液中混合了低浓度的秋水
仙素 (250 mg·L21 ) ,处理 24 h和 36 h,结果表明 ,所有
处理组都少量分化体细胞胚 (图 42D) ,且大量的体细
胞胚表现为畸形或者胚柄去分化 ,多倍体获得率均低
于 200 mg·L21秋水仙素单独诱导 (表 2)。
表 2　氨磺灵溶液混合 250 m g·L 21秋水仙素
浸泡 36 h对落叶松体细胞胚发生的影响
氨磺灵浓度
(mg·L21 ) 体细胞胚获得数目 (个 / g)
正常 去分化
检测数
获得多倍体
情况 (个 )
正常体
细胞胚
异常体
细胞胚
诱导率
( % )
1 60. 0 50. 8 81 11 1 14. 8
2 46. 2 53. 8 81 4 3 10. 0
4 31. 8 29. 1 81 2 6 9. 9
5 21. 2 34. 2 81 2 3 6. 2
3　讨论
311　细胞系细胞分裂指数的测定
化学试剂诱导染色体加倍是它们能抑制或妨碍
细胞的纺锤丝形成 ,使分裂的染色体停留在赤道板 ,
不向两极移动 ,而细胞质不分裂 ,导致染色体数目增
加 ,越多的细胞处于分裂期说明培养物的同步化越
18
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高 ,则处理效果越明显。前人的研究 [ 12, 13, 19 ]虽然已
经涉及到细胞系增殖量与时间的描述 ,但研究不足
以说明细胞系最佳生长状态 ,本研究通过细胞接种
量以及最佳接种量状态下细胞分裂指数的测定 ,确
定了细胞系分裂最旺盛时期。结果显示 ,每升培养
基大约可以增殖 250 g细胞 ,最适增殖接种量约为
50 g/L ,在最适增殖状态下 ,最高细胞分裂指数出现
在继代培养的第 15 d达到 16. 8% ,但随后急剧下
降。这与培养基营养成分的消耗以及部分细胞开始
老化 ,次生代谢物的积累相关 ,并且第 15 d细胞分
裂指数平均值较高但检测的个体间差异较大 ,本试
验诱导时机选为细胞分裂指数次之的第 13 d。
312　多倍体体细胞胚的获得
多倍体育种已经在杨树、桉树、桑树和杜仲等林
木中获得成功 [ 5～7, 15 ] ,并给实际生产带来了显著的
效益。针叶树天然多倍体时有发生 ,并稳定存在自
然界中 ,但数量稀少 [ 8 ] ,针叶树离体多倍体育种从
未见报道。在本试验进行的同时 ,对落叶松实生苗
根尖进行了体细胞染色体计数 ,希望获得天然多倍
体 ,在 3 000多株实生苗种没有检测到自然多倍体。
通过秋水仙素和氨磺灵处理胚性细胞系后再诱导体
细胞胚胎发生 ,从分化得到的体细胞胚中检测到大
量多倍体个体 ,并且重复性好。这将有助于多倍体
获得以及为多倍体发育的研究提供研究材料。
313　秋水仙素较适合诱导落叶松多倍体体细胞胚发生
秋水仙素诱导多倍体细胞系再分化体细胞胚胎
能力较强 ,且体细胞胚分化能力较高 ;氨磺灵对落叶
松胚性细胞系毒性较大 ,抑制胚性细胞系的生长和
体细胞胚的正常分化 ,且诱导率低 ,最高为 4. 5%。
研究发现秋水仙素诱导单一作用于微管 ,处理后细
胞发育不同步、多倍体不稳定、毒性大且价格高昂 ,
氨磺灵等除草剂同时抑制微管合成和细胞器对
Ca2 +的运输 ,在某些植物中诱导效果较为理想 ,并
且对人畜的毒性小、处理浓度低、处理成本低廉 ,有
望成为秋水仙素的替代品 [ 16 ]。但黄权军等 [ 17 ]研究
发现氨磺灵处理后的杨树花粉量比秋水仙素略高一
些 ,但最高 2n花粉得率比较低 (氨磺灵处理 ∶秋水
仙素处理 = 24∶9617)。最新研究表明 [ 18 ]氨磺灵处
理能引起小麦染色体的异常分裂和细胞凋亡。本
试验结果显示氨磺灵对落叶松胚性细胞系的加倍
效果较差 , 1 mg·L21氨磺灵水溶液处理后的细胞系
分化能力和生长受到严重抑制而多倍体诱导率为
0, 2 mg·L21氨磺灵处理 36 h才检测到加倍体细胞胚
(1 /73) ,所有的细胞系都无法得到继代细胞系。通
过诱导后细胞系品红压片和去壁 2低渗涂片观察 ,氨
磺灵处理 24 h以上除了诱导细胞染色体加倍 ,同时
也诱导细胞发生凋亡现象 ,与张竞秋等 [ 18 ]在小麦根
尖中的研究结果相似。
综上所述 ,秋水仙素较适合落叶松多倍体体细胞
胚发生的诱导 ,诱导最佳时机为接种量约为 50 g·L - 1
(培养物 /培养基 ) ,继代培养的第 13 d;最佳诱导浓度
为 500 mg·L21 ,处理时间为 36 h。氨磺灵即使在较低浓
度下也严重抑制落叶松体细胞胚胎的发生 ,并且大量
的体细胞胚表现出去分化 ,其对落叶松的毒性较大 ,诱
导落叶松细胞发生凋亡 ,这对落叶松细胞系发育及病
理研究提供一个思路 ,但作用机理仍需进一步的
研究。
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