全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
琯溪蜜柚汁胞 RNA提取方法的比较
钟凤林1 郭志雄1 马传营 1, 2 潘东明 1, 2
( 1福建农林大学园艺学院,福州 350002; 2福建农林大学园艺产品贮藏保鲜研究所,福州 350002)
摘 要: 比较了 3种从琯溪蜜柚汁胞中提取 RNA的方法, 通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测 ,对提取所得
RNA的完整性、纯度及浓度进行分析。试验结果表明, T rizo l法适合琯溪蜜柚汁胞 RNA的提取 ,能有效获得纯度高、完整性
好的 RNA样品 ,而且 T r izo l法步骤简单, RNA得率与质量均较高。通过 RTPCR检验表明该 RNA适于后续分子生物学
操作。
关键词: 琯溪蜜柚 汁胞 RNA Tr izo l法
TheM ethod of Total RNA Isolation from Pummelo Juice Sac
Zhong Feng lin
1 Guo Zhixiong1 M a Chuany ing1, 2 Pan Dongm ing1, 2
(
1
College of H orticulture, Fuj ian Agricultural and Forestry University, Fuzhou 350002;
2
Institute of Storage Science and T echnology of H orticultural Products, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002)
Abstrac:t Threem e thods, mod ified SDS, mod ified CTAB and T rizo l extraction w ere app lied to isolate to tal RNA from the juice sac
o f pumme lo(Citrus max ima ( L. ) O sbeck). The tota lRNA iso la ted by these threem ethodsw as detected us ing agarose ge l e lectropho resis
and ultrav io let spectropho tom etry fo r analysis o f its integr ity, pur ity and concentra tion. The resu lts showed that the T r izo l ex traction
m ethod is effective and can produce ju ice sac RNA w ith integ ra lity and high purity. RTPCR resu lts ind icated that the ex tracted RNA
could be used for the fo llow ing m o lecular biology operations.
Key words: Pumm e lo Juice sac RNA Tr izo l ex traction me thod
收稿日期: 20091105
基金项目:国家科技支撑计划项目 ( 2007BAD07B01 )
作者简介:钟凤林,男,博士,从事果树生理生化与分子生物学研究; Em ai:l zf l10305@ 126. com
通讯作者:潘东明,教授,博士生导师,从事园艺产品采后贮运保鲜研究; Em ai:l pdm 666@ 126. com
琯溪蜜柚 (C itrus max ima ( L. ) Osbeck)原产福
建省平和县琯溪河畔, 是我国蜜柚优良品种之一。
该品种有 400多年的栽培历史。柑橘果实粒化是成
熟期和采后贮藏期的生理病害。其主要表现为汁胞
异常膨大, 变硬,汁胞木质化, 风味变淡。一般情况
下为囊瓣近蒂端汁胞先发生粒化,后渐向果心发展,
果心处长形汁胞最为严重。采后贮藏期表现为汁胞
枯水、干瘪, 并与采前粒化病并存于一果中, 严重时
汁胞颜色变为土黄色; 果皮的海绵层变得疏松、绵
烂,外果皮与正常果无明显区别 [ 1]。 20世纪 80年
代以来,琯溪蜜柚汁胞粒化问题严重影响果实品质。
而之前的研究多集中在生理及显微结构方面 [ 2 - 4 ] ,
对于粒化过程的分子生物学方面的研究报道较少。
RNA提取是分子生物学的研究中一个重要的基础
工作。RNA提取质量受到多糖、酚类物质和 RN ase
等的影响 [ 5, 6]。而琯溪蜜柚汁胞含有大量的多糖和
蛋白质, 多糖的许多理化性质和 RNA相似, 会与
RNA共沉,形成难溶的胶状物多酚类化合物被氧化
后会与 RNA不可逆结合, 导致 RNA产量减少。用
一些传统方法进行 RNA提取时都不能有效去除这
些杂质的干扰,从而造成不仅提取 RNA产量低, 而
且降解严重, 无法用于进一步的分子生物学研究。
而分子生物学的研究中 RNA提取是其中重要的一
个基础工作, 但是琯溪蜜柚这一方面的报道较少。
本研究比较了 SDS法、改良 CTAB法和 Trizo l法提
取琯溪蜜柚汁胞 RNA, 建立一个高效、稳定的 T rizo l
法提取 RNA体系,以满足琯溪蜜柚相关的分子生物
学研究需要。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
1 材料和方法
11 材料
琯溪蜜柚 ( C itrus grand is cv. Guanx im iyou) 2007
年采自福建省平和县小溪村大坑果园,以 30年树龄
的易发生粒化、挂果量大的老龄树为材料,选择大小
均匀, 色泽一致、无病虫、无损伤的果实。当日从平
和寄回福州,液氮处理、- 40 保存备用。
Tris, EDTA, DEPC, SDS, CTAB, PVPP, NaC ,l ME
等为 Amresco分装试剂; T rizol试剂盒、SuperScript
F irstStrand Synthesis System试剂盒购自 Invitrogen公
司; Taq酶, dNTP, pMD18T载体, E. coli DH5, PCR产
物胶回收试剂盒,质粒回收试剂盒, M arker DL2000,等
购自大连宝生物有限公司 ( TaKaRa);质粒提取试剂盒
E. Z. N. A.为 OMEGA公司产品; XGal、IPTG、琼脂糖、
氨苄青霉素、卡那霉素、胰蛋白胨、酵母提取物和琼脂
等购自厦门泰京生物技术有限公司;其它常规试剂均
为国产分析纯和超纯试剂。
紫外分光光度计 TU1901;高速台式冷冻离心
机 Beckm anAvanti 30;水平电泳槽 DYCP31BM, DY
CP31D以及电泳仪 DYY6C为北京市六一仪器厂
生产。
12 方法
121 SDS法 参照夏兰芹等 [ 7]方法。
122 CTAB法 参照张智俊等 [ 8]方法, 略做改
动。65 预热提取缓冲液 ( 2% CTAB, 01 M Tris
HC l pH 80, 25 mM EDTA, 20M NaC ,l 4% ME ), 2
g样品 + 12 mL 缓冲液研磨, 65 温浴 30 m in。
15 000 ! g室温离心 15m in,取上清。加入等体积氯
仿,混匀 (不断用力振荡 )。 15 000 ! g室温离心 15
m in,取上清。加入 10M L iC l至终浓度 3M, 混匀,
20 放置 5 h。 4 , 17 000 ! g离心 25m in。把沉淀
用 600 L RN asefree ddH2O溶解,加入等体积的苯
酚 /氯仿 /异戊醇 ( 25 ∀ 24 ∀1 ) , 用力振荡, 4 ,
15 000 ! g离心 15 m in。取上相, 加入等体积氯仿,
混匀 (不断用力振荡 ) 4 , 15 000 ! g离心 15 m in。
取上相,加入 1 /30的 3M NaA c pH52, 混匀, 加入
1 /10的无水乙醇, 冰浴 30 m in。 4 , 17 000 ! g离
心 25m in。取上清加入 3M NaA c pH52至 03 M,
25倍的无水乙醇, 20 沉淀过夜。 4 , 17 000 ! g
离心 25 m in。去上清, 70% 乙醇漂洗。晾干, 用
50 L RNasefree ddH 2O溶解。
123 T rizo l法提取 RNA 取 02 g汁胞直接放
入研钵中,加入少量液氮, 迅速研磨, 加入 2 mL Tr
izo,l转入离心管。室温放置 5 m in, 使其充分裂解。
12 000 ! g离心 5 m in, 弃沉淀。加入 400 L氯仿,
振荡混匀后室温放置 15 m in。 4 12 000 ! g离心
15m in。吸取上层水相, 至另一离心管中。加入 1
mL异丙醇混匀,室温放置 5- 10m in。 4 12 000 !
g离心 10 m in, 弃上清, RNA沉于管底。加入 2 mL
75%乙醇,温和振荡离心管,悬浮沉淀。 4 8 000 !
g离心 5m in,尽量弃上清。室温晾干或真空干燥 5
- 10 m in。用 50 L H2O溶解 RNA样品。
124 cDNA第一链的合成 按 SuperScr ipt F irst
Strand Synthesis System的说明书操作。
125 CAT保守区扩增 根据 GenBank上已登录大
豆 CAT(登录号: AB333792)、橡胶 (登录号: AF151368)、金
丝桃 (登录号: AY173073)、胶烟草 (登录号: AF006067)和
烟草 (登录号: NTU93244)的 cDNA设计简并引物 CA
TR11: 5GT ( C /T /G ) CA ( T /C ) GC (A /C /T ) ( A /C ) G
( G /A) GG ( C /T /A ) GC ( T /C /A ) AGT GC; CATR21: 5
GA (A /G)GG( G /C )AA ( G /A ) TA( G /A) T ( C /T ) ( G /
A) A( T /C ) CTC ( C /T ) TC ( A /G ) TC。引物由上海英
骏公司合成。以合成的第一链为模板,扩增反应体系
为模板 6 L, 10 !Taq bu ffer(含 Mg2+ ) 5 L, 10 mM
dNTP m ix 1 L, 10 mM CATR11 4 L, 10 mM CATR
21 4 L, Taq酶 ( 5 U / L) 03 L, 补充 ddH2O至
50 L。
反应程序: 94 预变性 5 m in, 94 变性 45 s,
517 退火 45 s, 72 延伸 45 s, 35个循环后 72
继续延伸 10m in, 4 下保存。
2 结果与分析
21 RNA的质量
通过分光光度计测得 RNA在 OD230, OD260和
OD280下的吸光值及 OD260 / OD230和 OD260 / OD280 (表
1)。 SDS法得到 RNA的质量较好, 但是 RNA的得
率低, OD260 / OD280的值在 139- 171; 改良 CTAB法
浓度高, 但是纯度较差, OD260 / OD280的值在 169 -
182; T rizo l法提取的 RNA, 浓度和质量都较好,
OD260 / OD280的值在 186- 195,说明纯度好。
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2010年第 2期 钟凤林等:琯溪蜜柚汁胞 RNA提取方法的比较
表 1 琯溪蜜柚汁胞总 RNA的紫外分析
方法 样品编号 OD 230 OD260 OD 280 OD 260 /OD230 OD 260 /OD 280
SDS法 1 0069 0150 0089 217 168
2 0063 0149 0087 236 171
3 0054 0125 0090 230 139
CTAB法 1 0101 0312 0171 312 182
2 0106 0320 0179 302 178
3 0122 0341 0201 275 169
T rizol法 1 0062 0220 0118 341 186
2 0064 0201 0103 311 195
3 0064 0215 0112 336 192
SDS法提取的 RNA电泳结果, 条带较暗 (图 1
A );改良 CTAB法得到 RNA条带亮, 浓度高,但是有
发散拖尾现象 (图 1B ),用 Trizo l法提取琯溪蜜柚粒
化汁胞总 RNA,电泳检测显示分离得到的总 RNA的
质量较好,条带完整,紫外检测和分析结果, 28S RNA
的量约为 18S RNA的 2倍, 结合 OD260 / OD230和
OD260 / OD280的结果,说明提取的琯溪蜜柚汁胞 RNA
的质量比较高,适合 PCR扩增 (图 1C)。
M. DL2000M arker; A. SDS法; B.改良 CTAB法; C. TRIZOL法
图 1 琯溪蜜柚汁胞 RNA电泳分析
图 2 CAT保守区扩增结果
22 CAT保守区扩增
以 Trizol法提取琯溪蜜柚粒化汁胞总 RNA为
模板, 合成 cDNA, 用简并引物 CATR11和 CATR21
进行 PCR扩增, 获得了大小约为 1 000 bp的特异产
物 (图 2)。胶回收纯化该片段,连接、转化、涂板、筛
选和 PCR鉴定。送菌液测序, 结果如图 3。保守区
测序结果得到一段 995 bp的序列。编码 331个氨
基酸, 其氨基酸残基序列如图 4。
经 B last比对后发现, 该保守区片段与荔枝 Li
tchi chinensis ( EF6134941 )甜樱桃 Prunus avium
( EF1655901)、桃 P runus p ersica ( A J1324441)、木
薯Manihot esculenta( AF1702721)等的 APX同源性
较高,分别是 87%、83%、82%和 81%, 说明克隆得
到的这个片段是 CAT保守区。NCB I登录号 ban
k it1273958。
总结比较 3种 RNA提取方法, 都可以获得
RNA, 但是 SDS法的得率较低, 需要 2 d, 操作繁
琐;改良 CTAB法纯度较低, 时间需要 2 d, 操作繁
琐; T rizol法得率和纯度都较好, 并且不需超速离
心及多次沉淀, 缩短抽提和沉淀时间。采用 T rizo l
法提取的琯溪蜜柚汁胞 RNA可以满足同源克隆
需要。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
1 GTTCATGCAA GAGGTGCCAG TGCTAAGGGT TTCTTTGAGT GTACCCATGA TATTTCTCAC
61 CTTACGTGTG CTGATCTTTT TCGAGCTCCA GGGGTTCAGA CACCTGTCAT TGTTCGCTTC
121 TCCACTGTTA TCCATGAGCG TGGCAGCCCT GAGACACTCA GGGATCCTCG AGGATTTGCA
181 GTCAAGTTTT ACACCAGAGA GGGTAATTGG GATCTTCTGG GTAACAGTAT CCCTGTTTTT
241 TTCATCCGTG ATGCAATCAA ATTCCCAGAT GTGATCCATG CTTTTAAACC TAATCCAAAG
301 TCTCACATCC AAGAGTACTG GAGGATCCTC GACTTCTGCT CCCACCTTCC TGAAAGCTTG
361 TCCACATTTT CCTGGTTCTT TGATGATGTG GGTATTCCAC AAGATTACAG GCACATGGAA
421 GGCTTCGGTG TTCAAACTTT TACACTGGTC AATAAGAATG GGAAAGTGCA CTATGTGAAA
481 TTCCACTGGA AACCAACTTG TGGAGTTAAG TGTTTGACAG ATGAAGAAGC AATAAAGGTT
541 GGTGGATCTA ATCACAGCCA CGCTACTCAG GATCTCTACG ACTCAATTGC AGCTGGAAAC
601 TATCCTGAGT GGAAACTCTA CATTCAGACT ATTGATCCCG ATCACGAGGA CCAATTTGAC
661 TTTGACCCAC TGGACGTAAC CAAGTGGTGG CCTGAGGACA TCATCCCTCT GCAGCCAGTT
721 GGACGCTTGG TCTTGAACAA GAACATCGAT AATTTCTTTG CAGAAAATGA AATGCTTGCA
781 TTTAACCCTG GTATCGTGGT TCCTGGGATC TACTACTCAA ATGATAAGAT GCTCCAATGT
841 CGAATCTTTG CCTATGGTGA TACCCAGAGG CATCGCCTTG GACCCAACTA CTTGATGCTT
901 CCAGTTAATG CCCCCAAATG TCCTCATCGC AACAATCATT ATGATGGTTT CATGAATTTC
961 ATGCACAGGG ACGAGGAGAT TAATTATTTG CCCTC
图 3 菌液测序结果
1 VHARGASAKG FFECTHD ISH LTCADLFRAP GVQTPV IVRF STVIHERGSP ETLRDPRGFA
61 VKFYTREGNW DLLGNS IPVF FIRDA IKFPD V IHAFKPNPK SH IQEYWR IL DFCSHLPESL
121 STFSWFFDDV G IPQDYRHM E GFGVQTFTLV NKNGKVHYVK FHWKPTCGVK CLTDEEA IKV
181 GGSNH SHATQ DLYDSIAAGN YPEWKLYIQT IDPDHEDQFD FDPLDVTKWW PED IIPLQPV
241 GRLVLNKNID NFFAENEMLA FNPG IVVPG I YYSNDKMLQC RIFAYGDTQR HRLGPNYLML
301 PVNAPKCPHR NNHYDGFMNF MHRDEE INYL P
图 4 氨基酸残基序列
3 讨论
植物 RNA提取常用的有异硫氰酸胍法、盐酸胍
法、SDS酚法、CTAB法及酸酚法等, 大都因为试验
试剂昂贵,需要至少 5 h到 3 d的操作时间, 效果良
莠不齐。从富含多糖、多酚的植物组织中提取总
RNA,关键在于在提取过程中能有效地排除 RNase、
多糖、蛋白质及多酚的干扰 [ [ 9 ]。
在试验过程中发现快速短时操作是提取完整
RNA的关键。采用改良 CTAB法和 T rizo l法都能够
提取质量较好的 RNA,其中 T rizo l法不需超速离心
及多次沉淀就达到了去除多糖的效果, 大大提高了
RNA的得率,简便快速地提取了质量较好的琯溪蜜
柚汁胞 RNA,达到了同源克隆要求的水平。该法可
作为琯溪蜜柚 RNA提取的方法, 并为提取其它柑橘
类水果的 RNA提供参考。
参 考 文 献
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