全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（7）：1359–1368 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–01–10；修回日期：2013–06–19
基金项目：国家自然科学基金项目（30871761）；广东省科技计划项目（2010B020305014）；国家级大学生创新训练项目（201211078020）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：wxl1972@gzhu.edu.cn；Tel：15360413690）
琯溪蜜柚及其早熟红肉突变体成熟果实 SSH 文
库的构建及初步分析
刘顺枝，黄 忠，胡位荣，江月玲，王小兰*
（广州大学生命科学学院，广州 510006）
摘 要：分别以琯溪蜜柚及其突变体红肉蜜柚（成熟期早 20 ~ 25 d）的成熟果肉 cDNA 作驱赶子和
检测子，利用结合分子镜像选择技术的 SSH 技术，构建了红肉蜜柚和琯溪蜜柚的正向差减 cDNA 文库。
通过 PCR 检测 cDNA 克隆外源插入片段，其大小介于 100 ~ 1 000 bp。通过点杂交差异筛选文库，得到
102 个表达增强 2 倍或以上的克隆并测序，结果表明这 102 个克隆代表 44 个 Unigenes，通过序列同源性
比对分析，发现获得的 Unigenes 在功能上主要涉及信号传导、蛋白质合成、应激反应、转运等代谢反应。
关键词：琯溪蜜柚；突变体；抑制差减杂交；差异表达基因
中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）07-1359-10

Construction and Analysis of Suppression Subtractive Hybridization
Library of Red-fleshed Sweet Pomelo
LIU Shun-zhi，HUANG Zhong，HU Wei-rong，JIANG Yue-ling，and WANG Xiao-lan*
（School of Life Sciences，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China）
Abstract：A forward subtractive cDNA library was constructed through suppression subtractive
hybridization（SSH） method with mirror orientation selection，which was performed using the cDNA from
wild type‘Guanxi’pomelo（Citrus grandis）as driver，those from its red-flesh mutant as tester. PCR
analysis showed that most of the clones with insertions ranged from 100 bp to 1 000 bp. After differential
screening through dot hybridization，a total of 102 transcripts represented 44 Unigenes with signal ratios
stronger than two times were selected for 2 additional screenings. Homology analysis showed that they
were found to be involved in diverse biological processes，such as signal transduction，protein synthesis，
stress response as well as transport metabolism.
Key words：Citrus grandis（L.）Osbeck；mutant strain；suppression subtractive hybridization（SSH）；
differentially expressed sequence

红肉蜜柚是从琯溪蜜柚上发现的果实汁胞呈红色的一个芽变新品种，成熟期比琯溪蜜柚提早
20 ~ 25 d（黄新忠 等，2007）。红肉蜜柚以优异红肉品相及其良好的口感，受到消费者的欢迎，已
在福建、广东、江西等地大面积推广栽种，取得了良好的经济效益。

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根据果实在不同时期的生长特点，一般将柚类果实的生长发育分为 4 个时期：第Ⅰ期细胞分裂
期、第Ⅱ期细胞增大期、第Ⅲ期汁胞充实期、第Ⅳ期肉质转变期（何天富，1999）。柚类果实成熟过
程中，伴随着与成熟相关基因的表达和酶活性的变化（Goulao & Oliveira，2008）。目前番茄（Yu et
al.，2012）、甜橙（Liu et al.，2009）和香蕉（Mbéguié-A-Mbéguié et al.，2007）等果实发育与成熟
的分子机制研究比较透彻。有关红肉蜜柚的研究主要集中在栽培特性和生理生化等方面（陆修闽 等，
2006），而关于红肉蜜柚果实发育与成熟阶段的分子生物学的研究还未见报道。
本研究中采用抑制差减杂交技术（suppression subtractive hybridization，SSH）（Diatchenko et al.，
1996），选取红肉蜜柚及其野生型——琯溪蜜柚的成熟果肉为研究材料，构建了抑制差减杂交正向文
库，以期能够分离得到红肉蜜柚与琯溪蜜柚之间果实成熟时期的差异表达基因，为阐明红肉蜜柚的
成熟机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料、试剂及主要仪器
红肉蜜柚（果实成熟期 9 月中下旬至 10 月初）和琯溪蜜柚（果实成熟期 10 月上旬至中旬）果
实于 2010 年 9 月 20 日采自广东省梅州市农业科学研究所果园，为 6 年生正常挂果果树。选择果形
正、大小一致的果实带回实验室，迅速将有色层、白皮层、囊衣和汁胞分离，用锡纸包好，放入液
氮中迅速冷冻后，于–80 ℃低温冰箱保存备用。
E. coli DH5α 菌株由本实验室保存。
果肉总 RNA 提取试剂购自 TaKaRa 公司；SMARTerTM PCR cDNA Synthesis Kit、PCR-SelectTM
cDNA Subtraction Kit 购自 Clontech 公司；DIG High Prime DNA Labeling and detection starter kit Ⅱ
（for chemiluminescent detection with CSPD）购自 Roche 公司；随机引物标记试剂盒购自 Gibco 公司；
LATaq DNA 聚合酶、SuperScript Ⅱ反转录酶和 pGEM-T Easy Vecter 载体购自 Promega 公司。PCR
扩增仪为 PTC-100 PCR 仪（MJ 公司），凝胶成像仪为 OMEGA12iC 型化学发光分析系统
（ULTRA.LUM 公司）。
1.2 总 RNA 的提取、SMART cDNA 合成
采用 TaKaRa 公司的 RNAiso Plus 按说明书提取红肉蜜柚和琯溪蜜柚果肉总 RNA，用琼脂糖凝
胶电泳检测总 RNA 完整性，用紫外分光光度计检测总 RNA 浓度及纯度；用 Clontech 公司的
SMARTerTM PCR cDNA Synthesis Kit 将总 RNA 逆转录为 cDNA。剩下的 RNA 于–80 ℃下保存备
用。
1.3 抑制差减杂交
参照 Clontech PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit 使用手册，以红肉蜜柚果肉的 cDNA 作为检测
子，以琯溪蜜柚果肉的 cDNA 作为驱赶子，进行连续两次的消减杂交和两次 PCR，将富含差异表达序
列的第 2 次 PCR 产物克隆到 pGEM-T Easy Vector 上，建立正向差异 cDNA 文库，代表突变体的特异
表达 cDNA。
1.4 镜像选择
采用 DNA 分子的镜像选择技术（MOS）进一步去除背景克隆（Rebrikov et al.，2000）。分别取
200 ng 第 2 次杂交之后的 PCR 产物，用 XmaⅠ酶切，酶切产物经 MOS 杂交之后，以杂交产物为模
7 期 刘顺枝等：琯溪蜜柚及其早熟红肉突变体成熟果实 SSH 文库的构建及初步分析 1361

板采用巢式引物 NP2Rs（5′-GGTCGCGGCCGAGGT-3′）进行 PCR 扩增。
1.5 差减文库的构建
回收 MOS 杂交后的 PCR 产物，用 DNA 快速纯化试剂盒纯化后，参照 pGEM-T Easy Vector 说
明书，取 8 μL（20 μL 的体系）连接到 pGEM-T Easy Vecter 载体上，16 ℃过夜。第 2 天取 5 μL 连
接产物转化 E. coli DH5α 感受态受体菌，涂板后 37 ℃培养过夜。基于蓝白斑筛选法，初步分离阳性
克隆。从 LB 平板挑取白色阳性克隆菌落接种到 300 μL 含 Amp（100 mg · mL-1）的 LB 液体培养基中，
37 ℃摇床培养过夜，对差异 cDNA 文库的克隆，提取质粒 DNA，形成抑制差减 cDNA 的质粒文库。
1.6 重组克隆的 PCR 筛选
取构建的抑制差减 cDNA 文库的重组子 1 μL 质粒 DNA，加入 T7 引物（5′-TAATACGACTCAC
TATAGGG-3′）和 Sp6 引物（5′-ATTTAGGTGA-CACTATAGAA-3′）。采用程序：94 ℃ 5 min；94 ℃
1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min；30 个循环）进行 PCR 扩增（20 μL 的体系），1.2%琼脂糖凝胶
电泳检测。
1.7 斑点杂交
将上一步扩增的 PCR 产物收集并编号。分别取 0.5 μL PCR 产物点在 5 mm × 5 mm 大小方格的
尼龙膜上，并以正向差减产物作为阳性对照，以去离子水作为阴性对照。将点好的尼龙膜置于浸有
0.4 mol · L-1 的 NaOH 的滤纸上变性 5 min，之后置于 2× SSC 中清洗 2 min，晾干后置于紫外交联仪
交联，用于杂交。每种 PCR 产物均需要点 2 张膜用于不同的探针。
依据 Roche 公司 DIG High Prime DNA Labeling and detection starter kit Ⅱ的说明，利用随机引物
标记进行标记，共标记 2 个探针：正向差减产物探针；未差减的产物探针。将制备好的膜与探针进
行杂交（Rebrikov et al.，2000）。
1.8 DNA 测序和 BLAST 分析
选取与正向差减探针有信号及与正向差减探针杂交信号明显强于反向差减探针的克隆(信号强
度在 2 ~ 3 倍以上)，送上海美吉公司用 T7 或 M13r 引物单向测序。所获序列去除载体和接头序列，
获得 EST。采用 NCBI（http：//www.ncbi.nih.gov）的 BLASTx 在线序列比对工具进行同源性检索分
析和功能注释分析。
1.9 差异表达基因的 RT-PCR 鉴定
根据序列同源性分析结果，选取 8 个基因：RSP 5F1、RSP 5D1、RSP 7D9、RSP 7B1、RSP 8B6、
RSP 2G1、RSP 7H2、RSP 5B10，以红肉蜜柚和琯溪蜜柚果肉的 RNA 为模板，以甜橙组成型表达的
β-actin（登录号 GU911361，F：ATCTGCTGGAAGGTGCTGAG，R：CCAAGCAGCATGAAGATCAA，
扩增片段长度 100 bp）基因为内参，进行 RT-PCR 分析。经预备试验，优化的最佳 PCR 扩增条件为：
50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min。30 个循环。引物
序列见表 1。
另选取基因 RSP 5D1 和 RSP 8B6，以红肉蜜柚和琯溪蜜柚果实发育的细胞分裂期（4 月 20 日）、
细胞增大期（5 月 20 日）、汁胞充实期（7 月 20 日）、成熟期（9 月 20 日）的 RNA 为模板，PCR 扩
增条件为：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，25 个
循环。

1362 园 艺 学 报 40 卷
图 1 SMART 合成 cDNA 循环数的确定
M：DNA marker DL2000；15、18、21、24：循环数。
Fig. 1 Analysis for optimizing PCR parameters
M：DNA marker DL2000；
15，18，21，24：Cycle numbers.
表 1 RT-PCR 使用的引物序列
Table 1 Primer sequences used for semi-quantitative RT-PCR
克隆号
Clone No.
引物序列（5→3）
Sequence of primers
片段大小/bp
Size of the fragments
F：TGTCCGCCGTCTTGTCCTAAATGA RSP 5F1
R：GGATAAAGCCGAACCCGAACCAA
382
F：GACACAACACGCACATCAC RSP 5D1
R：GAGCCCTCTATTTCCAGTTT
416
F：CACAACGCTGAATGAAAT RSP 7D9
R：ACTGGATGGCAAGCAATGTC
410
F：GTGCGCGATGGGTTTACTTG RSP 7B1
R：CTGGCTGCACATCTCTTCATTTTT
421
F：TCTCACCGCAGGCGTCAAATC RSP 8B6
R：ACATGGGGCCTCACAAGCACA
318
F：GAAGAGCTACGACCGGATTGATT RSP 2G1
R：TCTAACGCCATGAAAAGGACGAT
238
F：TGCGCAAACCAGCCCACATCT RSP 7H2
R：GGCCCCATTCAAGGAGCACCAT
490
RSP 5B10 F：CCGCCCACAGCTTAGCAATCCTCA 526
R：AGTCGTCGTCGGGCAAGTTCCAGA
2 结果与分析
2.1 总 RNA 的提取、SMART 方法进行 cDNA 的合成
总 RNA 经琼脂糖凝胶电泳法检测显示完整性良好，完全符合进行下游工程的要求。用 Clontech
公司的 SMARTerTM PCR cDNA Synthesis Kit 将总 RNA 逆转录为 cDNA（Rebrikov et al.，2000），根
据试剂盒的操作说明，为了得到能够代表原有样
品中的 mRNA 丰度的 cDNA 样品，先对循环数进
行了检测。即分别在 Advantage PCR 扩增的 15、
18、21、24 个循环处各取 5 μL 的 PCR 产物进行
电泳检测，结果表明红肉蜜柚和琯溪蜜柚均以进
行 18 个 PCR 循环为佳（图 1），这时的 cDNA 产
量较高，且片段大小集中在 500 ~2 000 bp 之间。
2.2 抑制差减杂交文库的构建
2.2.1 cDNA 的差减效率
以甜橙看家基因 β-actin 做消减效率分析，以差减和未差减的 cDNA 为模板，连续进行两次 PCR
扩增，将其扩增产物进行凝胶电泳（图 2）。

图 2 PCR 扩增 β-actin基因分析差减效率
M：DNA marker DL2000；15、18、21、24：循环数。
Fig. 2 Reduction of β-actin abundance by PCR-select subtraction
M：DNA marker DL2000；15，18，21，24：Cycles numbers.
7 期 刘顺枝等：琯溪蜜柚及其早熟红肉突变体成熟果实 SSH 文库的构建及初步分析 1363

图 4 SSH 和 MOS 后的电泳结果
M：DNA marker DL2000，1：琯溪蜜柚；2：红肉蜜柚。
Fig. 4 Gel electrophoresis of PCR products after application of
SSH and MOS technique
M：DNA marker DL2000；1：Guanxi pomelo；2：Red-fleshed pomelo.
可以看出，未差减的 cDNA，18 个循环就可有效扩增出 β-actin，而差减样品的 cDNA，21 个循
环才出现较暗的带，24 个循环才能有效扩增出 β-actin。未差减与差减的 cDNA 相差 5 个循环以上，
即可认为差减效率基本达到要求，可用于 SSH 文库构建（Diatchenko et al.，1996）。本研究结果表
明，两者差减后具有 6 个循环的差异，说明已具有很好的差减效果。因此，完全可以用于文库构建。
2.2.2 PCR 产物分析
为了验证红肉蜜柚与琯溪蜜柚 cDNA 差减杂交的效率，将差减得到的 cDNA，经过 2 次 PCR 选
择性扩增后，进行凝胶电泳分析（图 3）。结果表明，主要的 PCR 差减产物的核苷酸长度在 300 ~ 1 000
bp 之间，且有数条条带，表明差减杂交后一些共有 cDNA 片段已被扣除掉。差减杂交的对照结果也
说明差减效率较高。
图 3 抑制差减杂交后 PCR 扩增产物分析
M：DNA markers DL2000；1：正向第 1 次产物；2：反向第 1 次产物；3：正向第 2 次产物；4：反向第 2 次产物。
Fig. 3 Analysis of subtracted products after primary and secondary PCR
M：DNA markers DL2000；1：First PCR products after forward-subtracted hybridized；2：First PCR products after backward-subtracted hybridized；
3：Secondary PCR products after forward-subtracted hybridized；4：Secondary PCR products after backward-subtracted hybridized.

2.2.3 MOS 杂交鉴定
为了进一步富集差异表达的基因片段，采
用了DNA分子的MOS技术来进一步去除假阳
性。如图 4 所示，MOS 杂交之后，采用巢式引
物 NP2Rs 单引物进行扩增。凝胶电泳检测表
明，PCR 产物中出现了明显的特异性条带的富
集，表明差异表达的 cDNA 得到了有效地富集
和扩增。
2.2.4 阳性克隆的 PCR 筛选
应用 T/A 克隆法，将正向差减 PCR 产物连
接到 pGEM-T easy vector 上，并将连接产物转化大肠杆菌，通过 X-Gal/IPTG 蓝白斑筛选，构建了抑
制差减杂交 cDNA 文库。随机挑选差减文库的重组子进行 PCR 扩增，扩增条带即为插入的 cDNA
片段。从图 5 可以看出，每条泳道只有 1 条扩增条带，且大多集中于 500 ~ 1 000 bp，说明酶切、连
接、转化效果较好。
图 5 SSH 文库部分 cDNA 克隆外源插入片段的 PCR 检测
M：DNA markers DL2 000；1 ~ 24：cDNA 插入片段。
Fig. 5 PCR analysis of cDNA inserts which were randomly chosen from the SSH library
M：DNA markers DL2 000；Lane 1–24：cDNA inserts.
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2.2.5 点杂交鉴定阳性克隆
为了去除假阳性，采用点杂交进一步筛选。采用随机引物法标记正向差减探针和正向未差减
cDNA 探针，再分别与 2 套 cDNA 拷贝膜杂交（图 6）。正向差减探针即用于构建正向差减文库的
MOS 杂交后的 cDNA。杂交结果中，一般认为与正向差减探针杂交的是 tester 中特异表达的片段
（Diatchenko et al.，1996）。作为对照，未差减探针的杂交结果可以当做差减效率的鉴定和阳性克隆
的进一步的试验验证。杂交结果表明，有些克隆与正向差减的探针杂交信号强，这些克隆可能是琯
溪蜜柚突变后上调表达的基因；还有一些克隆与正向差减探针杂交强度没有明显区别，这些克隆是
非差异表达的基因。对杂交结果用 optiquant 软件进行扫描分析，杂交信号强度 tester 比 driver 高 2
倍或 2 倍以上的克隆为阳性表达克隆。最终从正向 SSH 文库中共得到 102 个阳性克隆。











图 6 差减文库的差异筛选
a. 与正向差减 cDNA 探针斑点杂交；b. 与正向未差减 cDNA 探针斑点杂交。A ~ H：克隆在膜上的横向排列顺序；
1 ~ 12：克隆在膜上的纵向排列顺序；箭头所指为同一个克隆在与不同的探针杂交时，表达有差异的克隆。
Fig. 6 Differential screening for the subtracted library
a. Dot blots hybridized with forward- subtracted cDNA probe；b. Dot blots hybridized with forward- unsubtracted cDNA probe.
A–H：The lateral order of the clones on the membrane；1–12：The vertical order of the clones on the membrane；
Arrows means there are expression differences when the same clone
hybridizing with different probes.

2.2.6 EST 序列 BLAST 分析和功能归类
对红肉蜜柚差减文库中的 102 个表达增强 2 倍或 2 倍以上的克隆进行测序，去除载体、引物、
污染、重复、低质量（< 100 bp）的序列后，得到 44 个有效 Unigenes。
将处理后的无重复的 44 个单一序列利用 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）上的 BLASTx
程序与 GenBank 的非冗余蛋白质数据库 nr 进行同源性检索分析与功能注释。结果发现，29 个
Unigenes 与其它物种已知基因具有较高的同源性（部分结果如表 2 所示），还有一些没有找到相似
性序列或者同源性很低，认为可能是新的基因片段。参照 Bevan 等（1998）在拟南芥基因上建立的
分类方法，对所获得的 Unigenes 进行 BLASTx 蛋白同源性比对输出注释信息结果进行 EST 物种来
源、功能注释及功能分类。
同源性比较预测结果显示，这些 ESTs 主要涉及以下几方面：①与信号转导和表达调控相关，
如生长素抑制蛋白（PsARP），膨胀素（expansin，也称作扩张素或扩张蛋白），多蛋白桥梁因子
（MBF1），富亮氨酸重复蛋白质（LRR）等。②与蛋白质结构与合成相关，如 RNase E、MADS-Box
蛋白等。③与新陈代谢相关，如甲硫氨酸、核苷二磷酸激酶（NDPKs）、丝氨酸羧肽酶等。甲硫氨
酸是人体内多种代谢反应的重要前体。NDPKs 的基本功能就是通过磷酸化和脱磷酸化反应维持细胞
7 期 刘顺枝等：琯溪蜜柚及其早熟红肉突变体成熟果实 SSH 文库的构建及初步分析 1365

内核苷二磷酸与核苷三磷酸的代谢平衡（Johansson et al.，2008）。丝氨酸羧肽酶是一类真核生物蛋
白水解酶，在酸性 pH 环境下，它们同时具有酯酶和脱酰胺酶、C 末端蛋白水解酶的活性，参与多
肽和蛋白质的加工、修饰与降解等多个重要环节（叶玲飞 等，2013）。④与运输和约束相关，如金
属硫蛋白（MT）有储存金属离子和维护植物体内金属离子的平衡作用（全先庆 等，2006）。转铜伴
侣，铜是生物体不可缺少的一种元素，转铜伴侣在细胞内能够结合铜离子，保护细胞免受铜离子浓
度过高的毒害。转铜伴侣还是一种分子伴侣，把铜转运到含铜的蛋白质，并帮助其折叠成正常的结
构，是细胞正常代谢的基本要求（郭彤和许梓荣，2004）。⑤与应激反应相关，如胚胎发育晚期丰富
蛋白（LEA1）、噻唑生物合成酶基因（Thi4）。⑥功能不清楚基因，有些基因虽不知其确切功能，但
也受环境因素的胁迫诱导，可能也是芽变引起的。由此可见，筛选到的 ESTs 片段涉及到芽变的多
个方面，提示了红肉蜜柚性状的获得受一个复杂的调控网络控制，涉及蛋白质结构与合成、信号传
导、新陈代谢、运输和约束、应激反应等的变化，特别是环境因素的胁迫诱导许多具有调控或保护
性功能的基因表达。

表 2 正向 SSH 文库中部分已知基因的生物信息学分析结果
Table 2 The results of some positive clones in forward SSH library by bioinformatic analysis
克隆
Clone name
序列长度/
bp
Length
登录号
Accession
No.
同源基因
BLAST homologous gene
E-值
E-value
同源性/%
Percent
identity
克隆数
Number
of clones
RSP 5D3 316 JK998614 细胞壁松弛蛋白（甜橙）Expansin 2（Citrus sinensis） 1e-116 99 4
RSP 8B6 366 JK998618 胚胎发育晚期丰富蛋白 5（甜橙）
Late embryogenesis abundant protein Lea5（Citrus sinensis）
6e-38 99 4
RSP 5C11 471 JK998642 MADS 盒蛋白（温州蜜柑）
MADS-boxmads protein（Citrus unshiu）
1e-89 99 1
RSP 5D1 357 JK998620 金属硫蛋白（温州蜜柑）
Metallothionein-like protein（Citrus unshiu）
2e-42 97 16
RSP 1A6 380 JK998612 假定的生长素抑制/休眠相关蛋白（柑橘杂交品种）
Putative auxin-repressed/dormancy-associated protein（Citrus
hybrid cultivar）
4e-62 98 9
RSP 3E8 482 JK998640 铜伴侣蛋白 CCS（柑橘杂交品种）
Putative copper chaperone（Citrus hybrid cultivar）
6e-52 98 1
RSP 1F7 410 JK998647 温度诱导脂钙蛋白 TIL（甜橙）
Temperature -induced lipocalin（Citrus sinensis）
4e-120 99 1
RSP 3D6 376 JK998616 噻唑生物合成酶（甜橙）
Thiamine thiazole synthase（Citrus sinensis）
9e-172 99 14
RSP 5A2 419 JK998622 多蛋白桥梁因子（葡萄）
MBF1 multiprotein-bridging factor 1（Vitis vinifera）
6e-78 86 2
RSP 8C6 328 JK998631 肌动蛋白（茶树）
Actin（Camellia sinensis）
1e-145 99 6
RSP 3H7 470 JK998648 核转运因子（蓖麻）
Nuclear transport factor（Ricinus communis）
2e-78 94 1
RSP 5C10 602 JK998650 丝氨酸羧基肽酶（蓖麻）
Serine carboxypeptidase（Ricinus communis）
1e-113 82 1
RSP 2D8 410 JK998636 40S 核糖体蛋白（蓖麻）
40S ribosomal protein S3a（Ricinus communis）
5e-122 88 2
RSP 5B3 456 JK998641 同型半胱氨酸甲基转移酶（蓖麻）
5-methyltetrahydrofolate（Ricinus communis）
3e-86 85 1
RSP 5B11 410 JK998635 翻译控制肿瘤蛋白（TCTP）（橡胶树）
Translationally controlled tumor protein（Hevea brasiliensis）
1e-94 94 2
RSP 3H4 224 JK998626 冷诱导的原生质膜蛋白（麻疯树）
Cold induced plasma membrane protein（Jatropha curcas）
3e-28 91 1
RSP 3F6 410 JK998651 核苷二磷酸激酶（NDPKs）（白菜）
Nucleoside diphosphate kinase 1（Brassica rapa）
3e-84 83 1
RSP 5D11 344 JK998628 假 定 蛋 白 （ 犬 新 孢 子 虫 ） Hypothetical protein
NCLIV_068840（Neospora caninum Liverpool）
2e-98 100 4
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2.2.7 差异表达基因的半定量 RT-PCR 鉴定
为了验证 SSH 文库的可靠性，将部分差异表达基因合成特异引物后，以甜橙 β-actin 基因作为
内参，矫正红肉蜜柚和琯溪蜜柚果肉 RNA 浓度，以之作为模板，进行 RT-PCR 半定量检测分析。从
图 7 中可以看出，RSP5F1、RSP7D9、RSP2G1、RSP7H2 在红肉蜜柚成熟果肉中的表达量不同程度
地高于在琯溪蜜柚中的表达，而 RSP7B1、RSP5B10 在红肉蜜柚成熟果肉中的表达量不同程度地低
于在琯溪蜜柚中的表达，这与点杂交的结果一致。RSP5D1、RSP8B6 的表达差异不明显。
根据同源性分析结果，选取 RSP5D1、RSP8B6 这 2 个可能与果实成熟相关的基因，进行半定量
RT-PCR 分析，鉴定这 2 个基因在果实不同发育时期的表达情况。结果表明，不同发育时期，基因
表达不同（图 8）。RSP5D1 在琯溪蜜柚的细胞分裂期不表达，随着果实的发育，表达逐渐增加；RSP5D1
在红肉蜜柚的细胞分裂期和细胞增大期表达很弱，随着果实的发育，表达逐渐增加。说明 RSP5D1
与果实成熟有关。RSP8B6 在琯溪蜜柚的果实发育的细胞分裂期、汁胞充实期、肉质转变期表达较
强，在细胞增大期表达很弱；在红肉蜜柚的细胞分裂期、细胞增大期、肉质转变期表达，在汁胞充
实期表达很弱。可见，这 2 个基因在肉质转变期都有较强的表达，说明这 2 个基因与果实的成熟密
切相关。


图 7 部分差异表达基因在红肉蜜柚和琯溪蜜柚果肉中的 RT-PCR 检测
M：DNA marker DL2000；1：琯溪蜜柚；2：红肉蜜柚。
Fig. 7 RT-PCR analysis of some differentially expressed genes in pulp of
red-fleshed pomelo and Guanxi pomelo
M：DNA marker DL2000；1：Guanxi pomelo；2：Red-fleshed pomelo.


图 8 果实不同发育时期基因的表达
a：细胞分裂期；b：细胞增大期；c：汁胞充实期；d：肉质转变期。
M：DNA marker DL2000；G：琯溪蜜柚；H：红肉蜜柚。
Fig. 8 Gene expression in different development periods of fruit
a：Cell division period；b：Cell enlargement period；c：Juice sac enrichment period；d：Flesh transition period.
M：DNA marker DL2000；G：Guanxi pomelo；H：Red-fleshed pomelo.
7 期 刘顺枝等：琯溪蜜柚及其早熟红肉突变体成熟果实 SSH 文库的构建及初步分析 1367

3 讨论
果实逐步成熟的过程总是伴随着调节果实细胞壁的组成与结构发生改变的酶的变化（Li et al.，
2003；Goulao & Oliveira，2008；Castellarin et al.，2011）。在柑橘果肉膨大及后期的成熟过程均需
要细胞壁松弛蛋白起松弛细胞壁的作用（Li et al.，2009），本研究分离到多个与细胞壁发育修饰有
关的基因，如编码细胞壁松弛蛋白的 RSP5D3，编码胚胎发育晚期丰富蛋白 5 的 RSP8B6，并且同时
含有多个克隆；同时，分离得到的多个基因，如金属硫蛋白，多蛋白桥梁因子，假定的生长素抑制/
休眠相关蛋白等等，均出现在草莓、葡萄及甜橙的果实成熟期（Moriguchi et al.，1998；Pimentel et al.，
2010；Guillaumie et al.，2011；Yu et al.，2012），这表明构建的琯溪蜜柚突变体抑制差减文库确实包
含有与成熟直接相关的基因，也说明采用 SSH 结合点杂交差异筛选对于分离与目的相关基因是有效
的。
选取 RSP5D1、RSP8B6 进行半定量 RT-PCR 扩增（引物见表 1），对它们在果实发育过程中的表
达进行初步分析。结果表明，这 2 个基因在琯溪蜜柚和红肉蜜柚果实发育的不同时期表达量不同，
但在果实成熟期均有较强的表达。这些基因表达可能与红肉蜜柚果实早熟有关。不过，在本研究中，
分离得到的基因几乎是与成熟相关的基因，没有与色素形成直接相关的基因，这可能与研究材料取
样时期的选择有关，推测如果要分离与红肉形成的基因，应该选择在谢花后 70 d 左右，果肉刚刚有
红色形成时的果实作为研究对象。本研究得到的红肉蜜柚果肉相关 EST 不仅丰富了柚类果树的基因
信息，对进一步研究它们的功能以及利用它们来改良作物的抗逆性具有重要的意义，也为研究红肉
蜜柚果实色素及果肉红色形成等相关基因的克隆提供了新的思路。

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第 29 届国际园艺大会将于 2014 年在澳大利亚召开
由国际园艺学会和澳大利亚园艺学会和新西兰农业及园艺研究所共同主办的第 29 届国际园艺大会将于 2014 年
8 月 17—22 日在素有“阳光之城”之称的澳大利亚布里斯班召开（同期举办展览）。会议主题是“园艺——维持生
活、生计与园林美化”。会议议题：果树生理及生产体系、葡萄生产、本土蔬菜、高产值蔬菜作物、观赏植物、园艺
作物机械化精细化管理、创新性植物保护技术、采后技术、园艺作物育种、园艺作物分子生物学技术、组织快繁技
术，园艺作物遗传育种、园艺作物遗传资源、园林及城郊型园艺、草坪草管理，有机废物利用、新种类害虫生物安
全、检疫及治理、热带果树、热带观赏植物、香料植物等。会议主席为澳大利亚 Griffith 大学 Rod Drew 教授和新西
兰 Massey 大学 Ian Warrington 教授。论文摘要提交日期：2013 年 4 月 1 日；论文摘要提交截止日期：2013 年 11 月
1 日；论文摘要录用通知日期：2014 年 1 月 14 日；注册日期：2013 年 9 月 30 日；注册截止日期：2014 年 2 月 17
日。会议语言：英语；地点：布里斯班会议展览中心；会议网站：www.ihc2014.org。欢迎园艺界同仁踊跃参加。
中国园艺学会办公室