全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
蛋白改造提高苏云金杆菌杀虫活力的研究进展
王发祥 1, 2 刘永乐 1 丁学知 2 夏立秋 2
(1长沙理工大学化学与生物工程学院 ,长沙 410008; 2湖南师范大学生命科学学院 微生物分子生物学湖南省重点实验室 ,长沙 410081)
　　摘 　要 : 　苏云金杆菌 (B t)已被广泛应用于农林害虫防治 ,但传统制剂仍然存在很大局限性 ,利用蛋白质工程对其改造
能有效的克服这些缺点。主要概述了近年来利用结构域转换和定点突变技术改造 B t Cry蛋白并增强其杀虫活性的研究
进展。
关键词 : 　苏云金杆菌 晶体蛋白 结构域转换 定点突变 杀虫活力
Advances in Enhancing the Toxic ity of B acillus thu ringiensis
with Prote in M odif ication
W ang Faxiang1, 2 　L iu Yongle1 D ing Xuezhi2 Xia L iqiu2
(1 College of Chem istry and B ioengineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410008;
2 Key Laboratory forM olecular B iology of M icroorganism of Hunan Province, College of L ife Science,
Hunan N orm al University, Changsha 410081)
　　Abs trac t: 　B acillus thuring iensis (B t) has been widely used as a biopesticide in agriculture, forestry and mosquito control, but
wild B t strains still have many disadvantages, which can be resolved by p rotein engineering of the B tδ2endotoxins. In this review, the
recent p rogress in enhancing the toxicity or broadening insecticidal spectrum of B acillus thuring iensis by technologies such as swapp ing
domains and site2directed mutagenesis, were summarized.
Key wo rds: 　B acillus thuringiensis Crystal p roteins　Swapp ing domains　Site2directed mutagenesis　Toxicity
收稿日期 : 2009208211
基金项目 :国家“863”计划 (2008AA100801, 2006AA02Z187) ,国家自然科学基金 (30670052)
作者简介 :王发祥 (19782) ,男 ,湖南张家界人 ,博士 ,主要从事蛋白质工程 ,微生物分子生物学方面的研究 ; E2Mail: wfaxiang@163. com
通讯作者 :夏立秋 ,男 ,教授 ,博导 ; E2mail: xialq@ hunnu. edu. cn　　苏云金杆菌 (B acillus thuring iensis,简称 B t)是一种需氧的革兰氏阳性芽孢杆菌 ,它在细胞生长的稳定期产生伴孢晶体 ,包含一种或多种杀虫晶体蛋白 ( ICPs) ,即δ2内毒素 ,对 7大类昆虫和其它几类无脊椎动物具有选择性致病能力 [ 1～3 ]。自 1961年起 , B t已被生产成生物杀虫剂有效替代 (或补充 )化学杀虫剂 ,广泛应用于农业生产、森林管理、蚊虫控制及水生态系统中。然而 ,目前大多数 B t产品还是使用传统的未改造的自然菌株 ,宿主范围窄、耐性差、易产生抗性等局限性 [ 2 ] ,因此通过蛋白改造提高 B t制剂的杀虫谱、毒力及耐受性 ,不仅能使 B t制剂在替代化学杀虫剂中更有吸引力 ,而且更方便昆虫的抗性管理。目前 Cry1Aa、Cry2Aa、Cry3A、Cry4Aa、Cry4Ba等 B t毒蛋白的三维结构已被解析 ,根据其整体结构相似性和序列的保守性 ,认为多数 Cry晶体蛋白都具有 3个结构域 ,每个结构域都在杀虫活性中单独或协同作用 ,其作用模式和分子机制一直是此前研究的热点 ,并逐渐形成了比较统一的理论 [ 1, 4, 5 ]。在此基础上 ,加之生物信息学的迅速发展 ,利用蛋白质工程按照人类意愿改造或创造具有更大杀虫谱或增强毒力的 B t毒素蛋白 ,已越来越具有诱人的前景并已取得了巨大的成就 ,简单综述了近年来这方面的研究进展。1　结构域转换提高苏云金杆菌毒力研究表明 ,单独表达 Cry蛋白的某一独立结构域也具有毒力作用 ,表明 B t晶体蛋白单独结构域在杀虫活性中的重要性 [ 6 ]。过去的 10多年来 ,人们致
2009年第 11期 王发祥等 :蛋白改造提高苏云金杆菌杀虫活力的研究进展
力于通过结构域交换构建假想的 C ry杂合基因 ,希
望获得扩大杀虫谱和增强活力的 B t毒蛋白 ,这一努
力已取得一定成功 (表 1)。
de Maagd等 [ 7 ]分析了 Cry蛋白 3个结构域的进
化树 ,推测结构域转换应该是 B t在自然界进化的一
种机制 ,而这种转换主要集中在结构域 Ⅲ上。这个
推测在随后通过 Cry蛋白间结构域 Ⅲ的交换提高 B t
毒力的试验 [ 8～13 ]中得到了证实。
实际上 ,结构域转换很多情况下是通过改变
Cry毒素的特异性而提高其对目标昆虫的杀虫能
力 ,引入其它 Cry类基因片段的同时也有可能引入
新的杀虫谱。于是 ,一种情况下表现出对原本无特
异性的昆虫有毒性 (如表 1中 RK6、RK12等 ) ;另一
种情况 ,如果引入的 C ry基因同时也对其原本特异
的昆虫有毒性 ,则可能由于两种毒力的协同作用而
表现出增强毒力 ,例如 ,融合表达 C ry1A a和 C ry1A c
的基因片段能同时具有这两种毒素的毒力 [ 2 ]。不
同 C ry基因序列间结构域的转换是构建新的高效毒
素的一种有效手段 ,目前 ,很多研究者利用这种技术
成功获得了扩大杀虫谱或提高毒力的新 B t杀虫
蛋白。
表 1 结构域转换提高 Cry晶体蛋白毒力的实例
蛋白 结构域构成 a 相对毒力 (倍 ) b 靶昆虫 文献
4105 AaⅠ /AcⅡ /AcⅢ 5 (Cry1Aa) T. n i [ 8 ]
4105 AaⅠ /AcⅡ /AcⅢ 8 (Cry1Aa) H. virescens [ 8 ]
4109 AaⅠ /AaⅡ /AcⅢ 268 (Cry1Aa) H. virescens [ 8 ]
4110 AaⅠ /AcⅡ /AaⅢ 4. 4 (Cry1Aa) T. n i [ 8 ]
H04 AbⅠ /AbⅡ /CⅢ 223 (Cry1Aa)
19 (Cry1C) P. xykistella [ 9 ]
FFC1 FaⅠ /FaⅡ /CⅢ 5. 5 (Cry1Fa) S. exigua [ 9 ]
H130 AcⅠ /AcⅡ /CⅢ 25 (Cry1Ac) S. exigua [ 9 ]
SN15 IaⅠ / IaⅡ /BaⅢ 7. 5 (Cry1Ba)
2. 5 (Cry1 Ia) L. decem lineata [ 10 ]
SN19 IaⅠ /BaⅡ /BaⅢ 21 (Cry1Ba)
7 (Cry1 Ia) L. decem lineata [ 11 ]
RK6 BaⅠ /BaⅡ /AcⅢ > 20 (Cry1Ba) H. virescens [ 12 ]
RK12 FbⅠ /FbⅡ /AcⅢ > 60 (Cry1Fb) H. virescens [ 13 ]
G27 EⅠ /EⅡ /CⅢ 1. 5 (Cry1C) S. exigua [ 13 ]
　a均为 Cry1类晶体蛋白 , AaⅠ /AcⅡ /AcⅢ表示 Cry1Aa的结构域 Ⅰ + Cry1Ac的结构域 Ⅱ + Cry1Ac的结构域 Ⅲ,其它亦然 ; b表示亲本 LC50
与杂蛋白 LC50的比值 ,括号中为对应的参照亲本
2　定点突变提高苏云金杆菌毒力
目前 ,利用定点突变技术改造 Cry蛋白已获得
部分具有更高杀虫活性的晶体蛋白 (表 2)。
2. 1　结构域 Ⅰ的突变
结构域 Ⅰ位于 N端 ,主要对膜的插入和孔道的
形成有重要作用 [ 1～4 ]。Angsuthanasombat等 [ 15 ]根据
对 Cry4B和 Cry3A进行同源性分析 ,推测 Cry4B结
构域 Ⅰα4、α5螺旋间的环上存在一个蛋白酶裂解位
点 ,并定位在 203位精氨酸 ,于是用丙氨酸替换构建
突变子 R203 A,旨在删除该蛋白酶裂解位点 ,却意外
地发现 R203 A对埃及伊蚊 (A. aegypti)的毒性比野生
型增加了 3倍 ,可能是因为精氨酸是一个不稳定的
蛋白酶裂解位点 ,由于结构域 Ⅰ的螺旋束在作用过
程中发生构象的变化 ,它的删除反而暴露了更多其
它裂解位点。Chandra等 [ 16 ]发现 Cry1Ac的α7螺旋
和白喉毒素 (DT)的 B片段有 8个氨基酸序列有很
高的相似性 ,于是用后者 ( I311 SSDSIGVL319 )替换前
者α7上的 T239 VLD IVALF247 ,获得的突变子对棉铃
虫 ( H. arm igera)的毒力比野生型 Cry1Ac提高了 8
倍。Manoj Kumar等 [ 17 ]在研究 Cry1Ac结构域 Ⅰ在
形成孔道过程中的作用时 ,以随机突变的方法获得
9
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
一个在α4螺旋的突变子 F134 L,毒力比其野生型提
高了 3倍。但是由于突变的随机性 , F134 L的特征和
增强毒力的原因以及其它氨基酸在该位点的突变会
产生怎样的效果尚需要进一步的研究。
2. 2　结构域 Ⅱ的突变
结构域 Ⅱ主要与毒素的特异性和受体的结合有
关 ,它的顶点有 3个暴露在表面的环 ( loop ) ,是δ2内
毒素主要的超变区 [ 1～4 ]。Lee等 [ 18 ]从自然突变株与
母株仅两个氨基酸差别 ,但对舞毒蛾 (L. d ispar)的
毒力强 10倍的现象中获得启示 ,通过定点突变将母
株 Cry1Ab蛋白上位于 α8螺旋和 β2片层之间的
A282 L283替换成 GS,生测的毒力提高了 7倍。
目前 ,对结构域 Ⅱ的突变主要集中在 3个顶环。
W u等 [ 19 ]对 Cry3A loopⅠ上 350～354位氨基酸进
行突变 ,构建的多突变子 A1 (R345 A, Y350 F, Y351 F)、
对黄粉虫 ( T. m olitor)、棉白杨叶甲虫 (C. scripta)、马
铃薯甲虫 (L. decem linea ta)的毒性分别提高了 11. 4、
2. 56、1. 91倍 ;而另一删除 350～351位酪氨酸的多
突变子 A2 ( R345 A, △Y350 , △Y351 )的毒力也相应增
强了 2. 7、1. 73、2. 2倍。
表 2 定点突变提高 Cry晶体蛋白毒力的实例
Cry 结构域 位点 突变前序列
突变后
序列
相对毒
力 (倍 ) 靶昆虫 参考文献
Cry1Ac Ⅰ 168 H R 3～5 M. sexta [ 14 ]
Cry4B Ⅰ 203 R A 2 A. aegypti [ 15 ]
Cry1Ac Ⅰ 239～247 TVLD IVALF ISSDSIGVL 8 H. arm igera [ 16 ]
Cry1Ac Ⅰ 134 F L 3 M. sexta [ 17 ]
Cry1Aa Ⅰ 178 F S 2 C. fum iferana [ 26 ]
Cry1Ab Ⅱ 282～283 AL GS 7 L. d ispar [ 18 ]
Cry3A Ⅱ 354 D E 1. 6 T. m olitor [ 19 ]
Cry3A Ⅱ 345, 350～351 R、YY A、FF 11. 4 T. m olitor [ 19 ]
Cry3A Ⅱ 345, 350～351 R、YY A、ΔΔ 2. 7 T. m olitor [ 19 ]
Cry3A Ⅱ 345, 350～351 R、YY A、FF 2. 6 C. scripta [ 19 ]
Cry3A Ⅱ 345, 350～351 R、YY A、ΔΔ 2. 2 L. decem lineata [ 19 ]
Cry1Ab Ⅱ 371 F A 1. 6 H. virescens [ 20 ]
Cry1Ab Ⅱ 372 N A 8. 5 L. d ispar [ 21 ]
Cry1Ab Ⅱ 372 N G 8. 3 L. d ispar [ 21 ]
Cry1Ab Ⅱ 372, 282～283 N、AL A、GS 36. 3 L. d ispar [ 21 ]
Cry1Ac Ⅱ 367～370 YRRP YRKP 1. 8 M. sexta [ 22 ]
Cry1Ac Ⅱ 367～370 YRRP FKRA 2. 0 M. sexta [ 22 ]
Cry3A Ⅱ 481～486 MQGSRG AAAAAA 2. 4 T. m olitor [ 23 ]
Cry3A Ⅱ 482, 484～485 Q、SR A、AA 1. 5 T. m olitor [ 23 ]
Cry4Ba Ⅱ 454 D PAT a 210 C. pipiens, [ 24 ]
Cry4Ba Ⅱ 454 D GAV 700 C. pipiens, [ 24 ]
Cry1Ac Ⅲ 506～508 NN I AAA 3. 7 H. virescens [ 25 ]
Cry1Ac Ⅲ 522～523 ST AA 2. 3 H. virescens [ 25 ]
Cry1Ac Ⅲ 524～525 ST AA 2. 5 H. virescens [ 25 ]
Cry1Ac Ⅲ 503～504 SS AA 2 H. virescens [ 25 ]
Cry1Ac Ⅲ 546 N A 1. 8 H. virescens [ 4 ]
Cry1Aa Ⅲ 576 F S 4. 4 C. fum iferana [ 26 ]
Cry1Aa Ⅲ 570 F S 2 C. fum iferana [ 26 ]
Cry1Aa Ⅲ 543 R S 2 C. fum iferana [ 26 ]
Cry1Aa Ⅲ 566 R G 2. 5 C. fum iferana [ 26 ]
Cry1Aa Ⅲ 543, 576 R、F S、C 1. 9 C. fum iferana [ 26 ]
01
2009年第 11期 王发祥等 :蛋白改造提高苏云金杆菌杀虫活力的研究进展
在对 loopⅡ的突变中 , Rajamohan等 [ 20 ]构建的
Cry1Ab的 F371 A突变子对棉铃虫 (H. a rm igera)的毒
力有轻微的提高 ,随后 ,该研究组 [ 21 ]继续对 Cry1Ab
的 372位天冬酰氨进行突变 ,获得的突变子 N372 A、
N372 G对舞毒蛾 (L. d ispar)的毒性增加了 8倍多。
更有趣的是 ,他们构建的三突变子 DF21 (N372 A,
A282 G, L283 S)对舞毒蛾的毒力比野生型 Cry1Ab竟
然增加了 36倍 ,与此前最好的 Cry1Aa毒素相比也
提高了 4倍。
LoopⅢ位于的β3片层的末端 ,可能在结构域 Ⅰ
和β3片层的相互作用中起关键作用 , W u等 [ 23 ]将
Cry3A loopⅢ上序列区段的 (M481 QGSRG486 )全部以
丙氨酸 (A )替换 ,获得的多突变子对黄粉虫的毒性
增加了 2. 4倍 ,表明丙氨酸替换可减弱结构域 Ⅰ和
β3片层的相互作用 ,使构象变化更容易发生从而易
于结构域 Ⅰ螺旋的插入。而 Abdullah等 [ 24 ]通过比
较 Cry4Ba和 Cry4Aa结构域 Ⅱ的 3个顶环 ,分别用
Cry4Aa的 3 个 loop 的序列替换 Cry4Ba 相应的
loop ,发现对 loopⅢ的替换 ,即将 454位的天冬酰胺
(D)替换为脯氨酸 ( P)并在 454位后插入丙氨酸、
苏氨酸 (AT)大大的增强了对致倦库蚊 (C. qu inque2
fascia tus)和尖音家蚊 ( C. pipiens) 的毒性 ( > 210
倍 ) ,而且相对 Cry4Aa的毒力也提高了 2～4倍。进
一步用 Cry1Aa的 loopⅢ模型替换 Cry4Ba的 loopⅢ
残基 (即 D454替换为 G并在其后插入 AV ) ,获得的
突变子对致倦库蚊、尖音家蚊的毒性分别提高了
700和 285倍以上。
2. 3　结构域 Ⅲ的突变
结构域 Ⅲ的功能尚不明确 ,目前的证据表明它
与毒素的稳定性、特异性、受体的结合及离子通道的
形成有关 [ 1～4 ]。
Lee等 [ 25 ]为了研究 Cry1Ac结构域 Ⅲ各氨基酸
残基的功能 ,将 503～525位的氨基酸以丙氨酸扫描
替换构建了一系列突变子 ,最终发现突变子 N506
N I508 2AAA、S522 T523 2AA、S524 T525 2AA对烟蚜夜蛾 ( H.
virescens)的毒性提高了 2～4倍。笔者所在的研究
室也对 Cry1Ac5结构域 Ⅲ上独特的β182β19 loop结
构进行了丙氨酸扫描 ,发现突变子 N546A对棉铃虫
的毒力提高了约 1. 8倍 ,主要是因为该突变增加了
其与中肠 BBMV的结合能力 [ 4, 5 ]。B t原毒素的激活
需要在蛋白酶的作用下删除 C端的大半部分 ,因
此 ,位于核心毒素 C2末端结构域 Ⅲ潜在的蛋白酶解
位点可能对毒素的稳定性和活性有重要作用 [ 1, 3 ]。
Bah等 [ 26 ]的试验结果证明了这一点 ,通过突变删除
Cry1Aa晶体蛋白上部分胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的
裂解位点 ,发现虽然大部分突变并不影响杀虫晶体的
毒力 ,但仍有几个结构域Ⅲ上的突变子对云杉蚜虫
(C. fum iferana ) 的毒力有 2 倍 ( ( R543S、R566G、
F570S)到 4倍 ( ( F576S)的提高。
3　最新进展和展望
实际上 ,人工改造 Cry晶体蛋白提高 B t毒力的
效率并不高 ,近年来 ,人们开始开始寻求新的思路和
方法。笔者所在研究室注意到昆虫中肠液 pH值降
低是其产生抗性的一个重要原因 ,用定点突变减少
Cry蛋白 C端半胱氨酸的数目以利于晶体在低 pH
环境激活从而增强 B t毒力 ,并减少昆虫潜在抗性 ,
发现 Cry1Aa的突变子 C812 A、C814 A能显著改善包涵
体的溶解性。Cristopher等 [ 27 ]根据色氨酸是 Cry毒
素在田间应用中对光不稳定的主要因素 ,将 Cry1Ab
上的某些色氨酸替换 ,希望获得至少不影响毒力但
能增强抵抗光损害的毒蛋白 ,发现突变子 W 73F是
一个很好的典型。无独有偶 ,笔者构建的 Cry1Ac5
突变子 W 544F由于形成的晶体变大 ,也能明显的提
高晶体蛋白的稳定性 [ 28 ]。此外 ,通过重新设计某些
Cry蛋白上的几个重要的 loop结构为其引入了新的
杀蚊活性 [ 27, 29 ] ,这为今后通过蛋白改造加强或创造
新的杀蚊、线虫、血吸虫等方法指明了一个新发展方
向 ,并具有良好的应用前景。
到目前为止 ,已有超过 150种 Cry类毒蛋白被
克隆并对各种昆虫具有毒性 [ 3 ] ,这些毒蛋白被广泛
的应用于研究 B t的杀虫分子机制及结构与功能的
关系 ,为较好地理解和合理的设计 C ry基因提供了
依据。随着基因工程、蛋白质工程等分子生物学技
术的日益成熟和广泛的应用于对 B t的研究 ,通过基
因改造获得更广杀虫谱或更强毒性的 B t晶体蛋白
已显示出其可行性和优越性。目前 ,光散射 [ 17 ]、电
压钳 [ 16 ]、圆二色光谱 [ 23, 26 ]、人造双层脂膜 [ 16 ]、噬菌
体展示 [ 30 ]等新技术已广泛应用于对 B t的研究中 ,
进一步加速了蛋白质工程获得高效工程 B t产品的
进程。可以预见 ,随着研究的深入 ,通过结构域转
11
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
换、限制酶切片段的转换、定点突变等技术对 Cry类
晶体蛋白的改造 ,将会有越来越多毒力更强的 B t产
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