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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
牡丹 PsCS基因的克隆及序列分析
任磊 王雁 周琳 彭镇华
(中国林业科学研究院林业研究所 国家林业局林木培育重点实验室，北京 100091)
摘 要: 以牡丹品种‘赵粉’(Paeonia suffruticosa L． cv．‘Zhao Fen’)为试材，采用 RT-PCR和 RACE方法从雄蕊中获得了
一个牡丹柠檬酸合成酶(citrate synthase，CS)基因 cDNA 全长，命名为 PsCS，GenBank 登录号为 HQ449568。其 cDNA 全长
1 564 bp，包含 75 bp的 5非编码区、73 bp的 3非编码区和一个长度为 1 416 bp编码 471 个氨基酸的开放阅读框。序列比对
和系统进化分析表明，PsCS与葡萄的亲缘关系最近，相似性达 89． 4%以上。
关键词: 牡丹 柠檬酸合成酶基因克隆 生物信息学分析
Cloning and Sequence Analysis of PsCS Gene in Tree Peony
Ren Lei Wang Yan Zhou Lin Peng Zhenhua
(Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation，State Forestry Administration，Research Institute of Forestry，CAF，Beijing 100091)
Abstract: In this work，a full-length cDNA sequence of CS gene was obtained from petals of tree peony(Paeonia suffruticosa L．
cv． ‘Zhao Fen’)using RT-PCR and RACE，named PsCS(GenBank accession No． HQ449568)． The full length of PsCS cDNA is 1 564
bp，containing a 5 untranslated region(5 UTR)of 75 bp，a 3 UTR of 73 bp，and an opening reading frame(ORF)of 1 416 bp enco-
ding a 471 predicted amino acids． Subsequently，sequence comparison and phylogenetic analysis revealed that PsAP1 shared more than
89． 4% homology with Vitis vinefera．
Key words: Tree peony Cloning of citrate synthase Bioinformatics analysis
收稿日期:2011-03-15
基金项目:国家“863”项目(2006AA100109)
作者简介:任磊，男，博士研究生，研究方向:花卉品种改良;E-mail:yuanlinrenlei@ yahoo． com． cn
通讯作者:王雁，女，研究员，研究方向:花卉品种改良;E-mail:wangyan@ caf． ac． cn
柠檬酸普遍存在于各种生物细胞三羧酸循环
中，是三羧酸循环中重要的中间产物，也是进一步合
成谷氨酸、脂肪酸的重要碳源。对生物体内的糖代
谢、脂肪代谢和蛋白质代谢具有重要的生理作用。
柠檬酸合成酶(citrate synthase，CS)是三羧酸循环中
合成柠檬酸的一个关键酶，植物体内柠檬酸的合成
是由柠檬酸合成酶(CS)催化完成的。增强柠檬酸
合成酶的活性，可以增加柠檬酸生成量，可能会促进
柠檬酸的分泌作用，对植物的生长具有重要
意义［1］。
到目前为止，研究人员已经从水稻(Oryza sati-
va)、桃(Prunus persica)、烟草(Nicotiana tabacum)、
香橙(Citrus junos)、葡萄(Vitis vinifera)、甜橙(Citrus
sinensis)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等多种植物
中分离克隆了 CS 同源基因全长 cDNA［2，3］。但是，
关于牡丹的 CS基因尚未见报道。
牡丹(Paeonia suffruticosa L．)是我国的十大名
花之一，也是我国的候选国花，具有较高的观赏价值
和丰富的象征意义［4］。本研究在此基础上，选取著
名的牡丹品种‘赵粉’，通过 RT-PCR 和 RACE 技术
获得基因全长，为后续转基因工作的开展，特别是为
创造抗性更强的牡丹新品种创新提供理论依据和基
因资源。
1 材料与方法
1． 1 材料
试验材料为种植在中国林业科学研究院北京良
乡牡丹基地的 4 年生牡丹品种‘赵粉’(Paeonia suf-
fruticosa L． cv． ‘Zhao Fen’) ，于盛花期［5］采收雄
蕊，锡箔纸包装后，置于 － 80℃冰箱保存。
RNA 提取所用药品均购自北京拜尔迪生物
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
公司，M-MLV 反转录酶购自 Promega 公司，Taq
DNA 聚合酶、DNA 凝胶回收试剂盒、T4 DNA 连接
酶、大肠杆菌 TOP10 感受态细胞、质粒 DNA 提取
试剂盒和 DNase I 酶等购自天根生化科技(北京)有
限公司，SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 为
Clontech公司产品，克隆载体 pMD19-T Vector 购自
TaKaRa公司。
1． 2 方法
1． 2． 1 RNA 的提取与 cDNA 第一链的合成 采
用改良的 CTAB 法［6］提取雄蕊的总 RNA。DEPC
水溶解 RNA，用分光光度计测定 OD260和 OD280数
值，根据 OD260 /OD280值判断 RNA 的质量，用琼脂
糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性。cDNA 反转录
按照 Promega 的 M-MLV Reverse Transcriptase 说
明书进行。
1． 2． 2 中间片段的扩增 根据 GenBank 核酸数据
库中已经登录的其他物种的 CS 基因序列片段设计
一对简并引物 P1(5-CTTGA(C /T)CC(A /T)GAT-
GA(A /G)GG(A /G)ATTCG-3)和 P2(5-TG(A /G)
AT(G /T)GT(A /G)ACATAAAGCCTCAT-3) ，以盛
花期牡丹品种‘赵粉’的雄蕊的 cDNA 第一链为模
板进行中间片段的扩增。扩增程序:95℃预变性
5 min;95℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，
35 个循环;72℃延伸 7 min。
1． 2． 3 两端序列 RACE扩增 根据中间片段序列，
设计 3和 5引物 P3(5-TGGACAAATCATACCATTG-
GACGACTC-3)和 P4(5-TGAATCAGGTAGAGCGT-
CAATGGTTTT-3) ，按照试剂盒 SMARTTM RACE cD-
NA Amplification Kit说明书进行 RACE 扩增。扩增
程序:94℃变性 30 s，72℃延伸 3 min，5 个循环;94℃
变性 30 s，70℃退火 30 s，72℃延伸 3 min，5 个循环;
94℃变性 30 s，68℃退火 30 s，72℃延伸 3 min，25 个
循环。
1． 2． 4 ORF 扩增 应用 DNAMAN 软件对基因的
3端和 5端序列进行拼接，并在 NCBI网站上预测其
ORF。根据 ORF序列设计两对特异引物 P5(5-AT-
GGTGTTTTTTAGAAGCTTGTCTTTGC-3)和 P6 (5-
TTAGGCCGCTTTCTTGCAGTAG-3)进行 ORF 扩增
验证。PCR扩增程序:94℃变性 5 min;94℃变性 30
s，56℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，35 个循环;72℃延
伸 7 min。
1． 2． 5 生物信息学分析 在瑞士生物信息学研
究所网站(http:/ /us． expasy． org /)上运用 Com-
pute pI /Mw 软件对目的基因编码蛋白等电点和
分子量进行预测，并运用其 ProtScale 和 ScanPros-
ite 软件对编码蛋白疏水性和作用位点进行预测
分析。采用 NCBI 数据库 BLAST 对编码蛋白结
构域进行预测。采用 PBIL LYON-GERLAND 信
息库对蛋白质序列进行二级结构预测(Secondary
structure prediction)。利用 Swiss-Model 对其三维
结构进行预测。
1 ． 2 ． 6 测序 所有 PCR 产物凝胶电泳后回收目
的片段，与 pMD19-T Vector 连接并转化 TOP10 感
受态细胞，重组质粒鉴定后委托北京华大基因公
司进行测序。
2 结果与分析
2． 1 RNA检测及 cDNA第一链的合成
本试验采用改进的 CTAB 法提取 RNA，电泳结
果如图 1 所示，其中 28S rRNA 条带的亮度大约为
18S rRNA的 2 倍，说明总 RNA 良好的完整性。经
过 NANODROP8000 的分光检测，OD260 /OD280 为
2. 0，纯度较高，可以用于后续试验。
图 1 牡丹雄蕊 RNA电泳图
2． 2 基因全长的克隆及序列分析
以‘赵粉’雄蕊 RNA逆转录的 cDNA为模板，以
特异引物 P1 和 P2 为引物，进行中间片段的 PCR扩
增，经测序其核苷酸序列为 240 bp(图 2-1)。根据
该保守区片段，设计特异引物 P3 和 P4 分别进行 3
与 5端的扩增，测序结果表明 3与 5端分别为 800
bp和 588 bp(图 2-2，图 2-3)。序列拼接后，设计 P5
和 P6 进行 ORF验证，经测序其核苷酸序列大小为
1 416 bp(图 2-4)。
2． 3 PsCS基因生物信息学分析
对牡丹 CS基因的全长 cDNA序列进行分析表
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2011 年第 9 期 任磊等:牡丹 PsCS基因的克隆及序列分析
明，该基因全长 1 564 bp，包含一个 1 416 bp 编码
242 个氨基酸的开放阅读框和一个 poly(A)结构，3
UTR和 5UTR 分别为 73 bp 和 75 bp。GenBank 登
录号为 HQ449568，命名为 PsCS。预测该蛋白的分
子量是 52． 79 kD，理论等电点为 6． 93。PsCS 编码
蛋白的疏水性分析结果(图 3-A)表明，疏水性最大
值为 2. 122，最小值为 － 2． 678，其大部分区域为亲
水区。二级结构预测表明，PsCS 蛋白由 207 个 α 螺
旋，64 个延伸链和 200 个随意卷曲构成，它们分别占
到43． 95%、13． 59%和 42． 46%(图 3-B)。Swiss-Model
对其蛋白结构进行预测，与 1cshA模型相似度最高，
达到 61． 36%(图 3-C)。PsCS 基因编码的蛋白质具
有 CS家族其特征序列(图 3-D，图 4)。
图 2 PsCS基因 RT-PCR及 RACE扩增电泳图
图 3 PsCS基因生物信息学分析
2. 4 同源性比较与系统进化分析
牡丹 PsCS氨基酸序列提交 NCBI 在线比对(ht-
tp:/ /blast. ncbi. nlm. nih. gov /Blast. cgi) ，选择与其同
源性较高的 7个物种的 CS氨基酸，水稻(Oryza sativa
ACG70964. 1)、桃(Prunus persica AAL11504. 1)、烟草
(Nicotiana tabacum CAA59008. 1)、香橙(Citrus junos
AAR88248. 1)、葡萄(Vitis vinifera XP002271451. 1)、
甜橙(Citrus sinensis ACU42176. 1)、拟南芥(Arabidop-
sis thaliana AAM62868. 1)。使用 DNAMAN软件将这
些序列进行比对(图 5)发现，不同植物的氨基酸序列
同源性较高，其中牡丹与葡萄的同源性最高，达
到 89. 4%。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
方框部分分别为起始密码子和终止密码子;下划线部分为特征序列
图 4 PsCS基因 cDNA全长及推导的氨基酸序列
在多重比对的基础上，为更好地了解 PsCS与其
他植物 CS基因之间的进化关系，用上述 8 个 CS 的
氨基酸序列构建系统进化树，结果(图 6)表明，牡丹
(Paeonia suffruticosa)与葡萄(Vitis vinifera)亲缘关
系较近，与水稻(Oryza sativa)较远，PsCS 的进化基
本符合 APG分类系统。例如，芸香科柑橘属的香橙
(Citrus junos)和甜橙(Citrus sinensis)聚为一束，呈现
出一定的种属特性。
3 讨论
本研究通过同源克隆的方法，运用 RT-PCR 和
RACE技术，成功克隆获得牡丹的 PsCS 基因。通过
生物信息学分析表明，其具有 CS 家族特有的特征
位点，而且与其他物种的同源性也较高，CS 基因在
进化过程中是比较保守的。
本试验是以盛花期雄蕊为模板，进行基因克隆，
说明柠檬酸合成酶广泛存在于各个器官，对于植物
生长发育具有积极作用。柠檬酸合成酶是合成柠檬
酸的关键酶，参与草酰乙酸和乙酰辅酶 A 缩合产生
柠檬酸的过程，这个生化反应在 TCA循环、脂肪酸的
β-氧化作用和光呼吸的乙醛酸循环途径中起重要作
用。酶的活性受 ATP、NADH、琥珀酰辅酶 A 和长链
脂肪酰辅酶 A等抑制［7］。Yang等［8］此外对决明的研
究发现，柠檬酸的分泌与铝浓度密切相关，随着土壤
中铝浓度不断升高，其分泌的量也随之增加;柠檬酸
合成酶的活性及柠檬酸的积累均与铝胁迫存在一定
关联。此外，柠檬酸在植物对于土壤中难溶性磷的吸
收也起着重要作用。在低磷的环境下，许多植物通过
调节有机酸代谢中酶的活性来提高有机酸的分泌量，
以提高植物对土壤中难溶性磷的利用［9，10］。
本研究已成功克隆得到牡丹的柠檬酸合成酶基
因 PsCS，载体构建工作正在进行中，下一步将通过
转基因技术探讨 PsCS的功能，进一步揭示柠檬酸合
成与积累的机理，为创造出更多抗性更强的牡丹新
品种奠定基础。
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2011 年第 9 期 任磊等:牡丹 PsCS基因的克隆及序列分析
图 5 PsCS与其他植物氨基酸序列的同源性比较
图 6 PsCS与其他物种氨基酸序列的系统进化树分析
参 考 文 献
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(责任编辑 狄艳红)
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