全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
重构胚中线粒体命运的研究进展
鞠光伟 杜卫华 郝海生 赵学明 王栋 朱化彬
(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100193 )
摘 要: 线粒体是哺乳动物细胞中最为重要的细胞器之一, 是除细胞核外惟一含有功能性基因组的细胞器,通过氧化
磷酸化产生维持细胞正常生理功能的 ATP。重构胚中线粒体的命运及线粒体与供体核间的互作关系已越来越成为研究的焦
点, 综述了同种、异种核移植, ICSI,卵胞质移植及异源线粒体注射后, 重构胚中线粒体的命运。
关键词: 哺乳动物 重构胚 线粒体 线粒体命运
The Progress of Study on the Fate ofM itochondrion
in Reconstructed Embryo
Ju Guangw ei DuW eihua H aoH a isheng Zhao Xuem ing W ang Dong Zhu Huabin
( Institute of A nimal Science, Chinese A cademy of Agricultural Sciences, B eijing 100193)
Abstrac:t M itochondr ion is one of them ost important organe lles in m amm als, wh ich is the exclus ive org anelle that conta ins func
tional genom e except nucleus, produc ing ATP to ma intain ce llsn orm a l function through ox ida tive phosphorylation. The fate o f the m ito
chondrion of the reconstruc ted em bryo and the inte raction between m itochondrion and the dono r nucle is becom ing the focus o f the re
search. Th is artic le summ ar izes the fate o f the m ito chondrion in the reconstruc ted em bryo a fter nuclear transp lantation betw een homoge
neous and the heterogeneous an ima ls, ICSI, oop lasm ic transfer and the injection of heterogeneous m itochondrion.
Key words: M amm al Reconstruc ted em bryo M itochondr ion Fate of m ito chondrion
收稿日期: 20091012
基金项目:农业科技跨越计划 ( 2007024 ),科技支撑课题 ( 2008BADB2B09) ,中国农业科学院创新团队 (家畜基因资源与种质创新 0902) ,基本
科研业务费项目 ( 2009qn7)
作者简介:鞠光伟,男,硕士研究生,研究方向:胚胎工程; Em ai:l jgw ei0307@ 163. com
通讯作者:朱化彬, Em ai:l hu ab inzhu@ yahoo. com. cn
自 1997年克隆羊 Do lly! [ 1]出生后, 相继有小
鼠、牛、山羊、猪、家兔、猫、鹿和狗等多种体细胞克隆
哺乳动物出世; 另外, 在异种克隆中, 异种克隆野
牛 [ 2]和盘羊 [ 3]以及克隆灰狼 [ 4]也都取得成功。不
管是在同种或异种重构胚中都包括两种来源的线粒
体,即供体线粒体与受体线粒体,这两种来源的线粒
体在重构胚发育的各阶段如何变化, 以及与细胞核
之间的互作关系越来越受到重视。重组胚中两种不
同来源线粒体的命运主要有以下 3种变化规律:供
体线粒体随卵裂而减少,受体线粒体处于主导地位;
供体线粒体随胚胎发育而增加最终占主导地位;供
体和受体线粒体共存。以下将对各类型重构胚中线
粒体的命运进行综述, 揭示线粒体在重构胚中的
作用。
1 线粒体的生物学特点
1. 1 线粒体 DNA ( m tDNA)的结构特点和功能
线粒体是哺乳动物细胞中最为重要的细胞器之
一, 它通过氧化磷酸化提供细胞正常生理需求的
ATP。线粒体是动物细胞中除细胞核外唯一的含有
功能性基因组的细胞器。m tDNA呈双链环状, 分为
重链 (H链 )和轻链 ( L链 ) ,双链密度不同。m tDNA
全长约 16. 5 kb,包括编码 13种多肽的 mRNA, 22种
tRNA和 2种 rRNA ( 12S RNA和 16S RNA ), DLoop
区和轻链复制起始区。作为一种半自主性细胞器,
线粒体编码的基因有限,多于 90%的蛋白包括一些
线粒体呼吸链传递的功能性蛋白都是由细胞核编码
的, 通过特有的机制转运到线粒体中。因此,线粒体
功能的发挥依赖于细胞核与线粒体基因组精密的协
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
调互作。
线粒体涉及体内的三羧酸循环、脂肪酸循环、氨
基酸分解等基础生命代谢过程,因此线粒体的疾病
与衰老是一个令人担忧的问题。衰老的一个重要特
征是线粒体功能的衰减, 在人类中线粒体病均表现
为退行性发病过程, 随着年龄的增长, 患者病情加
重,线粒体形态异常, 呼吸链氧化磷酸化功能下降,
老年人中常见的 Park inson综合症、A lzheim er(初老
期痴呆症 )、Hun ting ton综合症以及心肌扩张等病症
都是由于 mtDNA的缺失造成的 [ 5, 6]。
此外,线粒体异常还会阻碍纺锤体的正常形成。
细胞内的线粒体数量、结构和分布不是一成不变的,
它会随着卵母细胞对能量的需求变化而变化。比如
在减数分裂中期,线粒体集中分布于纺锤体周围,为
微管活动,包括纺锤体组装、染色体分离提供大量的
能量。如果因数量少或 m tDNA变异而影响线粒体
的功能,将会直接引起纺锤体形成障碍、减数分裂停
滞或延迟,以及染色体提前分离或不分离,直接影响
卵母细胞的质量和随后的胚胎发育。
1. 2 线粒体的遗传特点
在自然交配的情况下,精子中的 m tDNA在胚胎
的早期发育中被逐步降解 [ 7 ] ,因此通常认为线粒体
DNA呈现母系单性遗传, 在世代传递中不发生重
组,后代 m tDNA几乎都来自母本。但近年来,随着
胚胎生物技术的逐渐发展和在畜牧生产中的大量应
用,越来越多的试验结果否定了线粒体 DNA呈现母
系单性遗传的结论。
1. 2. 1 母性遗传 m tDNA的遗传不遵循孟德尔遗
传定律,主要为母系遗传。卵母细胞中 m tDNA都含
有相同的核苷酸序列, 即所谓的同质性 ( ho
mop lasmy)。而当生殖细胞中的 m tDNA发生非致死
性突变时, 受影响的个体就可能含有两种以上的
m tDNA分子, 这种情况被称为异质性 ( hetarap las
my)。异质性可以在发生几代之内迅速转变为同质
性。引起这种快速遗传漂移的机制目前尚不清楚,但
多数的研究认为是线粒体在生殖细胞遗传过程中的
瓶颈效应引起的,通过瓶颈效应来阻止那些带有突
变 m tDNA的卵母细胞产生后代。
1. 2. 2 父性遗传 m tDNA母性遗传并非由于父性
m tDNA被稀释到检测手段无法检测出来, 而是在卵
母细胞内存在一种普遍的机制, 即随着胚胎的发育
父性 m tDNA被蛋白水解酶水解了 [ 8, 9 ] ,父性 m tDNA
的消失和 遗传瓶颈!使得只有单一的母性 m tDNA
保留下来。但是越来越多的研究否定了这种单性遗
传的结论。例如,一位由于两个 bp缺失而患有线粒
体疾病的患者遗传了他父亲的线粒体 [ 10] , 这种父性
mtDNA遗传也可见于种间杂交的果蝇、小鼠、蜜蜂、
鸟类、绵羊和除人以外的灵长类以及种内杂交的河
蚌、果蝇等,这说明那种普遍存在的父性 mtDNA破
坏机制似乎无效了。父性 mtDNA能够遗传下来, 一
种可能的解释就是两种 m tDNA基因组发生了融合,
而使得父性 mtDNA逃脱了蛋白水解酶的水解。
2 重构胚中线粒体的命运
无论是用胞质内注射法还是电融合法获得的重
构胚,都会不可避免的将部分或全部的供体细胞质
带入到受体细胞中,所以重构胚中就会含有两种来
源的线粒体,即供体线粒体和受体线粒体,那么在各
种重构胚中不同来源的线粒体的命运是怎样的呢?
2. 1 同种核移植重构胚中的线粒体命运
同种核移植重构胚目前主要有两种: 同种胚胎
细胞核移植重构胚和同种体细胞核移植重构胚。
Ste inborn等 [ 11]通过基因特异性 PCR ( allelespec ific
PCR, ASPCR)对同种胚胎细胞克隆牛的线粒体进
行了检测,发现克隆牛个体中,可检测到供体线粒体
和受体线粒体。Takeda等 [ 12]采用 PCR片段单链构
象多态性 ( sing lestrand conformat ion po lymorphism o f
PCR fragments, PCRSSCP) 分析法检测了来源于卵
裂球的核移植胚胎和个体的线粒体, 结果显示供体
来源的线粒体在早期分裂中逐渐减少,至囊胚阶段
已经几乎检测不到其存在, 21头核移植个体中有 20
头只存在受体卵胞质来源的线粒体, 1头存在供体
和受体来源的线粒体。
Ste inborn等 [ 13]采用 ASPCR分析对来源于胎
儿和成年体细胞克隆牛的线粒体进行了检测, 结果
证明线粒体呈异质性,供体和受体来源的线粒体共
存。Takeda等 [ 12]也采用 ASPCR分析法, 研究了以
冻融的卵丘细胞作为供体的体细胞克隆牛胚胎中的
mtDNA,结果发现从细胞到囊胚各发育阶段的克隆
胚胎中均存在供体和受体来源的 m tDNA, 线粒体呈
异质性。
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2010年第 2期 鞠光伟等:重构胚中线粒体命运的研究进展
以上研究结果可以看出,由同种重构胚发育来
的胚胎或个体都出现供体与受体线粒体共存的现
象,这说明这些重构胚对异源线粒体有一定的兼容
性。虽然有些研究在核移植同种或异种重构胚发育
的个体中没有检测到受体线粒体,如 Evans等 [ 14]通
过 PCR产物的限制性片段长度多态 ( restriction frag
ment length polymorphism, RFLP)分析方法, 检测了
克隆羊 Dolly和另外 9只克隆绵羊的线粒体, 发现
10只体细胞克隆绵羊的 m tDNA均来源于受体卵母
细胞。这可能是受到不同检测方法的影响, ASPCR
可能是最为灵敏和适合的一种。
2. 2 异种核移植重构胚中的线粒体命运
2001年, Lanza等 [ 2]年利用种间核移植克隆出
了白趾野牛,并分析了 3个异种克隆野牛胎儿 11种
组织中的线粒体型, 结果显示线粒体均来源于受体
卵胞质,不存在供体来源的线粒体。之后, Lo i等 [ 3]
利用种间核移植克隆出欧洲盘羊, 线粒体分析结果
也显示,异种克隆盘羊的线粒体完全来源于受体卵
母细胞。M eirelle等 [ 15]把 Bos ind icus的桑堪胚期卵
裂球融入去核的 Bo s taurus卵中, 检测到在异种重
构胚及其移植后产生的胎儿中,供体来源的线粒体
逐渐减少,在出生的核移植牛犊上已检测不到供体
来源的线粒体。这些研究表明异种重构胚及其以后
发育的个体中,线粒体可能来源于受体卵母细胞。
我国科学家陈大元等 [ 16]的研究却不同于以上
的结论,他们将大熊猫的体细胞移到去核的兔卵母
细胞中构建重构胚, 并将其移植入家猫子宫中建立
妊娠, 发现在克隆囊胚中供体来源的大熊猫线粒体
和受体卵胞质来源的兔线粒体共存, 着床后的早期
胎儿中,兔卵胞质来源的线粒体数量下降,供体大熊
猫来源的线粒体逐渐增加。这可能是由于大熊猫和
兔在遗传上亲缘关系较远, 这些核线粒体基因编码
的因子只能支持核供体来源的大熊猫线粒体的发
育,并不能支持受体卵来源的线粒体发育。
2. 3 单精子注射胚胎中的线粒体命运
单精子注射是指借助显微操作仪将精子直接注
入卵母细胞胞质内 ( intracytoplasm ic sperm in jection,
ICSI)或卵周隙中实现受精过程。它可以排除透明
带甚至质膜对精子入卵的阻碍作用, 故对精子的死
活及其完整性无严格要求, 对于男性不育的治疗和
濒危动物的保护有重大作用。
March ington等 [ 17]提取了 11对通过 ICS I获得
后代的夫妇及所获后代 DNA,通过 PCR扩增、固相
微量测序法,在后代的血液、脐带、胎盘等组织没有
发现源于父亲的 m tDNA。Danan等 [ 18]提取 ICSI产
下的 27个胎儿及父母 DNA样品,通过 4种 PCR分
析方法对线粒体 DLoop扩增, 对 PCR产物变性梯
度凝胶电泳 ( dena turing gradient gel electrophoresis,
DGGE) , 发现胎儿 mtDNA的 DGGE图象与母亲相
同, 但与父亲不同, 随后通过对 P32标记的 PCR产物
进行限制性核酸内切酶分析、父源特异 PCR、去除
母源 m tDNA限制性核酸内切酶分析等方法, 对父源
mtDNA进行微量检测,结发现 5个后代的父源 m tD
NA占后代 m tDNA的 0. 01%, 2个占 0. 1%, 2个占
1%, 说明后代中含有父源 m tDNA, 但含量极少。
2. 4 卵胞质移植重构胚中的线粒体命运
在受精和植入前胚胎的发育中, 卵胞质中的线
粒体对 ATP的代谢过程起重要作用。胞质中低水
平 ATP的卵母细胞受精能力差,受精后胚胎培养时
会发生发育阻滞。为了克服妇女卵子质量差, ATP
含量低的问题,可采用卵胞质注射技术,即将供体卵
母细胞的部分细胞质经显微操作移植到受体卵母细
胞内,再对重构卵进行 ICSI, 从而形成重构胚, 胞质
注射量一般在 5% - 15%之间。Cohen等 [ 19]首次使
用卵胞质移植技术,在一名老年妇女卵子内注入年
轻妇女质量较好卵子的卵胞质, 对重组卵进行显微
受精,获得了受精卵, 胚胎移植后诞生了 3p ( three
parents)婴儿 !。Da le等 [ 20 ]给一对多次体外受精失
败的先天性不育夫妇进行了卵胞质移植,发现处理
后的胚胎细胞碎片减少,胚胎质量明显提高, 4枚经
卵胞质移植的胚胎在移植后怀孕, 并诞生了一对健
康的双胞胎。
但并不是所有的卵胞质移植都是有利的。
H aw se等 [ 21]认为细胞质移植并非是简单的线粒体
嵌合问题,不相容的两种细胞质可导致基因的表达
缺陷,进而影响个体的发育, 而且这种基因表达缺陷
可遗传给下一代。卵胞质移植产生的重构胚中, 异
源卵胞质会对父母来源的基因组产生影响, 使外在
性状发生某些改变。但 B renner等 [ 22]认为, 少量的
异源 m tDNA不会对机体产生伤害,因为线粒体具有
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
表型异质性,在正常个体中, 也有突变线粒体累积,
而且这些突变线粒体可以持久存在。
2. 5 异源线粒体注射重构胚中的线粒体命运
Ebert等 [ 23]将异源线粒体注入小鼠胚胎, 经过
注射的胚胎移植后发育正常,但在出生的仔鼠中检
测不到异源线粒体。P inkert等 [ 24]将从 Mus sp etrus
系小鼠肝细胞中分离到的活的线粒体显微注入原核
期的M. musculus系小鼠胚胎中,经过显微注射后的
原核卵经 4. 5d的体外培养后发育到囊胚。经巢式
PCR检测发现,小鼠胚胎在体外培养时,从第 0天到
第 4天均能检测到 Mus sp etrus系小鼠的线粒体。之
后, Irw in与 Pinkert等 [ 25]又将 201枚经异源线粒体
显微注射的小鼠胚胎移植到假孕雌鼠的输卵管,生
出 93只小鼠,其中有 5只 ( 3雄 2雌 )能检测到异源
线粒体。上述研究表明, 虽然异源线粒体存在的几
率很低,但是动物个体之间进行线粒体移植是可能
的,而且在线粒体注射形成的重构胚中,异源线粒体
能够持久存在。
3 结语
无论是何种重构胚都存在供体线粒体和受体线
粒体共存的阶段,从线粒体的表型异质性遗传特征
来看, 这种共存关系可能靠母性遗传传递给后代。
线粒体与核必须都正常表达,才能保证线粒体的正
常功能,异种克隆虽然为珍稀动物保护提供了可能
的途径,但目前异种克隆胚胎的发育率很低,供体细
胞核与受体胞质间的线粒体不能协调工作可能是影
响胚胎发育的重要因素之一。迄今已成功的异种克
隆都是发生在亲缘关系较近的物种中, 这可能是由
于是亲缘关系较近, m tDNA的差异不大, 供体核有
可能兼容受体线粒体的差别,从而相互协调保证线
粒体功能的正常行使。相信在不久的将来, 对于异
种克隆中线粒体的研究一定会得到快速的发展,为
异种克隆能否应用于珍稀动物的保护提供理论
依据。
参 考 文 献
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