全 文 ：流式细胞仪分离精子法的研究进展
陆阳清 张明 卢克焕*
(广西大学动物繁殖研究所, 南宁 530005)
摘 要: 以 X 精子和 Y 精子的 DNA 含量差别为基础的流式细胞仪分离精子技术是有效的哺乳动物性别控
制方法。目前,流式细胞仪分离精子的速度与上世纪 90 年代初期相比已提高了 30 多倍,以 3 000 个/秒的常规速
度分离 X精子或 Y精子的准确率可达到 85% ~ 90%。迄今,用分离精子人工授精已产下了数万头的动物后代, 而
分离人的精子也开始应用到了避免 X 染色体连锁遗传疾病的生殖医学工程中。
关键词: 流式细胞仪 哺乳动物 精子 分离精子 性别控制
Progress in FlowCytometrically Sorting the X and
YChromosome Bearing Mammalian Sperm
Lu Yangqing Zhang M ing Lu Kehuan*
( A nimal Repr od uct ion Inst i tut e of Guang xi Univ er si t y , N anning 530005)
Abstract: Flowcytometr ically so rting the Xand Ychr omosome bearing sperm based on the measurement o f
sperm DNA is an effectiv e w ay to preselect t he sex of the mammalian offspring . The so rting r ate today has been
near ly thirt y t imes of ten yea rs ago. The accuracy of the sor ted sperm is about 85% to 90% at a r outine r ate o f 3 000
liv e sperm fo r each sex . Thousands of mammalian offspr ing have now been produced via ar tificial insemination w ith
so rted sperm, and so rted human sperm is also used in clinic t o produce girls to avo id Xchr omosome linked genet ic
diseases.
Key words: Flow cytometer Mammal Sperm So rting Sexcontr ol
1 前言
人类在很早之前就认识到性别控制所能带来的
重大意义。对于人类, 如果能根据意愿选择后代的
性别,其最重要的意义在于避免患上与性别相关的
疾病;而目前已知的 X 染色体连锁遗传疾病就有
370多种,如色盲、肌营养不良、血友病等。在畜牧
业生产中,有选择地繁殖出具有预知性别的畜禽后
代,将能使产肉、产奶、产毛等与性别相关生产性能
的经济效益在畜群后代中获得大大提高, 加快畜牧
业生产的发展。
分离精子技术是有效的性别控制方法。如果在
受精之前能将 X精子和 Y 精子分离, 再通过与人工
授精、体外受精和胚胎移植等动物繁殖新技术相结
合,就能得到预知性别的动物后代。自 1925 年
Lush首次尝试分离兔子精子以来,许许多多的科学
工作者对分离精子的研究做了不懈的努力,依据精
子的密度、形态、大小、活力、表面电荷和免疫原性等
特性发明了各种分离精子的方法,试图将 X 精子和
Y 精子分离开。任何一种分离精子方法, 至少应满
足以下三个条件方可认为成功: 一, 所获得的 X精
子或 Y精子具有较大的数量,并能重复得到相似的
结果;二,所得到的精子能够与卵母细胞进行正常的
受精;三,用分离后的精子生产的胚胎或动物后代的
性别必须与期望值相符合[ 1] 。直至目前, 只有以 X
精子和 Y 精子的 DNA 含量差别为基础的流式细胞
仪分离精子法能完全符合这些条件, 也就是说, 该方
收稿日期: 20050203
基金项目: 十五国家重大科技专项( NO. 2002BA518A01)、国家自然科学基金( NO. 30360073)和国家科技攻关项目(NO. 2002BA547C)资助
作者简介:陆阳清( 1976 ) ,男,广西南宁人,博士研究生,研究方向:动物胚胎工程与性别控制
* 通讯作者:卢克焕 T el: 867713235724, Fax: 867713238064, Email : khlu@ gxu. edu . cn
生物技术通报
技术与方法 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 3期
法是现今最成功而有效的分离精子方法。下面内容
是对流式细胞仪分离精子法的发展历史、分离原理
及其存在问题和应用前景进行概述。
2 流式细胞仪分离精子法的历史和现状
1910 年, Guyer 首次发现了性染色体。1925
年, Lush 第一个试图根据 X 精子和 Y 精子密度差
异的原理,采用离心分离法分离兔子的精子, 但所获
得的后代与对照组没有显著差别。20世纪 60年代
流式细胞仪诞生,激发了人们测定单个细胞的 DNA
进行各项研究的兴趣,而利用精子染色体 DNA 作为
一种标记来分离哺乳动物 XY 精子的研究也从此逐
渐展开。这期间, 许多学者投入到了精子形状对激
发荧光信号的影响[ 2] 、精子 DNA染料的选择以及流
式细胞仪的改进等方面的研究中[ 3~ 5]。1989 年,
Johnson 等用流式细胞仪成功地分离兔子活的 X和
Y精子,并通过人工授精得到兔子后代,雄性准确率
为 81% ,雌性准确率为 94% , 所有的兔仔在形态以
及生育能力上都没有因为分离精子的处理过程而受
到显著影响 [ 6]。这一研究成果第一次向人们展示了
一种科学、准确、高效地分离精子性别控制技术。
1993年,英国剑桥动物生物有限公司开展分离
牛精子体外受精研究并获得成功。他们将获得的预
选性别胚胎移植到 9 头受体母牛, 其中 4 头怀孕并
分别产下 3头母犊牛和 3头公犊牛, 其性别准确率
均达到 100% [ 7] 。在 1997 年至 1999 年间, 美国人
Seidel等共做了 11 组分离公牛精子人工授精试验;
结果显示, 除了冷冻分离精子授精后的怀孕率为对
照组的 80%左右以外, 所获得的怀孕率、产犊情况、
初生体重以及随后的生长发育与对照组的结果没有
显著差别, 至今还没有发现任何异常现象, 用 X精
子授精后所产下犊牛的性别准确率为 83% , Y 精子
为 90% [ 8]。目前, 分离精子性别控制技术已经在牛
马等部分具有优良遗传品质的家畜上开始了大规模
的商业化推广, 分离精子人工授精在世界范围内至
少得到了 2万头以上的牛犊[ 9] 。
在人方面, 为避免 X染色体连锁的遗传疾病以
及平衡家庭性别等需要, 美国弗吉尼亚州的遗传与
体外受精研究所 1998年就利用分离后的精子进行
子宫内授精、体外受精和单精子显微受精的临床研
究;结果显示,女婴的性别准确率达到了 88% [ 10] 。
此外,分离精子性别控制研究还在诸如羊[ 11]、
猪[ 12]等哺乳动物以上相续获得成功。
目前,流式细胞仪分离精子的速度与上世纪 90
年代初期相比已提高了 30多倍,分离 X精子纯度在
85% ~ 90%时速度可以达到 11 106个/小时以上;
分离精子冷冻保存技术不断提高, 液氮冷冻保存解
冻后, 90% 以上的精液样本的活率已经提高到了
0. 35以上[ 13] ;与之相关的人工授精[ 8]、体外受精[ 14]
等技术正不断完善。可以肯定, 流式细胞仪分离精
子技术已经发展成为一种科学、可靠、高效的哺乳动
物性别控制方法。
3 流式细胞仪分离精子的原理
3. 1 X精子和 Y精子的特性
在哺乳动物中, 决定动物性别的关键是其所携
带不同的性染色体。例如正常双倍体黄牛总共有 60
条染色体,其中公牛为 58条常染色体, 1 条 X 染色
体, 1条 Y 染色体; 而母牛为 58条常染色体, 2 条 X
染色体。当经过减数分裂形成单倍体的配子后, X
精子携带 X染色体,它与卵子受精后产生雌性后代;
Y精子携带 Y染色体, 它与卵子受精后产生雄性后
代。在哺乳动物(家畜)中, 通常 X 精子的 DNA 含
量比 Y 精子多 3. 0% ~ 4. 5%。各种动物 X精子和
Y精子 DNA 差别见表 1。
表 1 流式细胞仪分析得到的各种动物 X和
Y精子 DNA含量的差异
动物 DNA 含量差别 ( % )
火鸡 0
人 2. 9
兔 3. 0
猪 3. 6
牛 3. 8
狗 3. 9
马 4. 1
绵羊 4. 2
(引自 J ohnson, Oxf or d r ev iew of rep rod uct iv e biology 1994,
16: 303~ 326)
3. 2 荧光染料 Hoechst33342的特性
Hoechst33342是一种相对安全的活细胞荧光
染料, 分子式为 C27 H 28 N 6 O 3HCL, 分子量为
561. 9。它能穿透活细胞的脂质膜, 以非嵌入 ( Non
intercalate)方式特异地到结合到 DNA 双链小沟的
腺嘌呤和胸腺嘧啶密集区域,即主要通过氢键、范德
272005年第 3期 陆阳清等: 流式细胞仪分离精子法的研究进展
华力和电场相互作用力与 DNA 结合。精子上的
Hoechst33342在激光的照射下, 能定量地激发出荧
光。该染料的特殊性在于不仅能渗透进入活精子
膜,而且在适当浓度时对精子活力、受精后的胚胎和
动物后代的发育都没有造成显著影响[ 15, 16]。
3. 3 流式细胞仪分离精子的原理
分离精子时 Hoechst33342的染色方法, 通常先
将精子稀释到 1. 5 亿/毫升, 加入 Hoechst33342至
40微克/毫升,在 35 水浴中染色 60分钟。染色后
精子通过流式细胞仪时, 在细微的进样管液流中排
成单列,高速射出喷嘴后逐个与激光交截。精子上
的荧光染料 Hoechst33342 被氩离子紫外激光( ~
350nm)激发, 产生蓝色激发光 ( ~ 460nm)。由于 X
精子所含有 DNA 比 Y 精子多, 结合上比较多的
Hoechst33342,所激发出的荧光就比 Y 精子强(图
1)。流式细胞仪根据荧光强度的差别分辨出哪个是
X精子,哪个是 Y精子。同时,由于喷嘴产生高频率
震动,高速喷射出的液流形成了包含单个 X精子或
者 Y精子的微小液滴。当液滴被充上正电荷或者负
电荷后,在电场力的引导下, 分别落入不同的收集容
器中, X精子和 Y 精子得以分离。
图 1 流式细胞仪检测到的水牛 X精子和
Y精子 DNA含量差别双峰
分离精子准确率和速度的关键在于精子通过流
式细胞仪接受激光照射时姿态的一致性, 即定向效
率。由于哺乳动物的精子形状不对称, 激光从不同
的角度照射激发荧光量存在差异。若精子通过流式
细胞仪过程中定向不一致时, X精子和 Y 精子之间
DNA 含量微小的差别被掩盖, 探测器收集到的荧光
信号就没有显著差异。简而言之, 分离时只对那些
扁平面整齐地向着前相角荧光探测器的精子进行分
离,其余均被抛弃。普通的流式细胞仪的定向是随
机的, 当包含精子的液流从喷嘴射出时, 只有大约
10%的精子定向正确。目前, 效率最高精子定向系
统是由 Rens 等[ 17] 发明制作的椭圆内腔喷嘴, 其精
子定向效率可达 70% , 能正确辨别并分离的精子数
目大大提高。这一发明成果后来由美国的 XY公司
获得,再经过改进后制成陶瓷喷嘴, 安装在高速流式
细胞仪 MoFlo SX中,实现了 X 精子和 Y 精子的高
速分离。
3. 4 分离精子准确率的评价
分离精子准确性的评价可通过两方面来进行:
一是受精前评定,即在实验室分析分离精子的纯度;
二是受精后评定, 即通过胚胎性别鉴定或者产出后
代的性比例进行验证。在实验室中, 受精前评定分
离精子样本的准确率有主要有以下三种方法:
3. 4. 1 荧光原位杂交法 ( F ISH )法[ 18] 即利用 Y
染色体特异核酸探针与精子上的特定序列杂交, 而
后标定荧光物质, 在荧光显微镜下直接观察并区分
X精子和 Y 精子。该方法特别适用于 X 精子和 Y
精子 DNA 含量差别很微小, 重分析不能保证准确性
的情况。比如人的精子, 用 FISH 法分析分离精子
的纯度要优于重分析法, 因为人的 X 和 Y 精子的
DNA 含量差异仅为 2. 8% ,重分析法不能一直保持
所要求的精确性 [ 10]。此外, FISH 法还提供了使用
独立的技术来评价分离精子有效性的机会,这一点
优于依赖昂贵仪器设备的流式细胞仪的重分析法。
但是该方法的缺陷是耗费时间长, 且试剂的价格较
高。
3. 4. 2 定量 PCR鉴定法[ 19] 即通过常规的分离精
子方法先将单个精子分离进入 96孔板的每一个孔
穴,利用特定引物分别进行 PCR扩增, 检测扩增得
到的 100个孔中含有 X 染色体还是 Y 染色体的比
率,确定分离样本的精子纯度。定量 PCR 鉴定法具
有准确性高的特点, 但缺点是花费的时间较长,一般
要花 6个小时来完成分析工作。因此, 用该法来分
28 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 3期
析分离精子的准确率益处不大。
3. 4. 3 流式细胞仪重分析法[ 20] 其原理是先用超
声波对分离精子处理 2~ 10秒钟,去除精子尾巴,仅
留下精子头部, 增加精子的定向效率; 而后用 Ho
echst33342进行重新染色,再次使精子 DNA 充分着
色; 最后通过流式细胞仪重新检测分离精子样本的
DNA,利用高斯曲线拟合确定分离精子样本中不同
DNA 含量的精子的比例, 即 X和 Y 精子的比例(图
2)。试验表明, 分离精子重分析法与 FISH 以及
PCR法分析得到的结果没有显著差异。流式细胞仪
重分析方法具有高效、准确、可靠和快速等优点, 在
用流式细胞仪分离家畜精子的日常研究和生产中,
一般均采用该方法。
图 2 流式细胞仪分离精子重分析法所示 90%纯度的
水牛 Y精子样本
4 流式细胞仪分离精子存在的问题及应用
前景
精子分离之后, 主要通过人工授精、体外受精、
单精子显微注射并结合胚胎移植等动物繁殖新技术
应用于畜牧业生产和人类生殖医学工程。目前, 虽
然利用分离精子进行体外受精[ 7] 和单精子注射显微
受精[ 10] 均已获得成功, 并且对于诸如人等分离获得
精子数量较少及活力可能降低的分离精子来说意义
非常大;但在畜牧业生产中, 人工授精技术依然是目
前最具影响力的动物繁殖技术, 其与分离精子技术
相结合将能更有效地推动这项动物性别控制技术的
广泛应用。
目前,家畜分离精子应用于人工授精进行商业
化推广的最主要缺陷仍然是分离的效率相对较低。
在常规的人工授精技术操作中, 每支冷冻精液通常
含有 10 108个有效精子,而即使是利用有一定操作
难度的低剂量子宫深部人工授精技术, 分离精子的
每个剂量通常也要分装有 2~ 3 106个。按照目前
常规情况, 每小时只能分离得到 11 106个左右的 X
精子或 Y精子,这就造成了分离精子的价格和商业
化成本偏高。为提高分离的效率, 将来的研究必须
在流体力学上作更深入细致的工作, 以期在保持液
流稳定的同时提高进样速度; 或利用更先进的信息
处理技术更准确快速地收集处理精子信号,正确辨
别 XY 精子并分离;或在精液样本处理方面, 让精子
在分离的过程暂时制动, 提高精子定向和分离的效
率;或开发出其它种类荧光标记方法, X 精子和 Y
精子不必受限于以 DNA 微小差别为基础来进行分
离。
除了分离效率外, 分离精子的活力也是其中一
个问题。目前, 分离精子人工授精的受胎率只有常
规冷冻精液的 70% ~ 80% ,在管理不完善的牧场或
者高产奶量的牛群中还要低一些[ 9] 。导致分离精子
受精能力降低的原因是多方面的, 如精子染色的过
程以及激光照射的复合影响, 分离精子过程中的高
倍稀释作用以及分离过程中的高压鞘液对精子膜的
破坏作用等, 这些都需要进行大量的基础研究予以
阐明。
虽然困难重重, 但由于分离精子性别控制的重
大意义,近年来持续有大量科研力量和资金的投入
其中, 分离精子性别控制的研究在各个技术环节也
正在不断得到提高, 其商业化的诱人前景正逐渐向
世人展开。位于美国科罗拉多州的 XY 公司是较早
致力于分离精子研究与开发的公司, 其获得了多项
与分离精子相关的专利。2000 年 7 月, 在英国皇家
农业博览会上, 英国的 Cogent 公司作为 XY 公司的
合作伙伴, 正式宣布为其下属的牧场主提供奶牛分
离精子服务, 成为世界上第一家利用流式细胞仪投
入生产分离精子的公司; 该公司拥有全英国最优秀
的 10头公牛中的 3头,利用 10 台流式细胞仪 24小
时运作生产分离精子。目前其分离精子市场处于供
292005年第 3期 陆阳清等: 流式细胞仪分离精子法的研究进展
不应求状态。现在除美国和英国外, 利用流式细胞
仪进行分离精子研究的国家还有瑞士、日本、澳大利
亚、德国和阿根廷等国。
中国分离精子研究起步较晚,但发展非常迅速。
广西大学动物繁殖研究在 2002年购入一台流式细
胞仪,率先在国内开展了分离精子性别控制的研究,
现已初步建立了分离黄牛、水牛和山羊 XY 精子的
方法和步骤。此外, 目前还有东北、内蒙等地也购入
了流式细胞仪, 开展分离精子的研究。国内商业化
的公司也正在跃跃欲试, 瞄准了这一块市场大蛋糕。
2004年 8 月底, 中美合资的 XY种畜公司在北京成
立, 准备批量购入流式细胞仪进行大规模分离生产
良种公牛 XY精子。这标志着我国分离精子的推广
应用正式展开。可以预见, 分离精子性别控制技术
的推广应用, 将大大提高我国相对落后的乳用牛和
肉用牛产业的生产效率, 缩短本地畜种品种改良的
繁育周期, 对我国整个畜牧业的产业结构调整和长
远发展将起到巨大的推动作用。
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