全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展
张梅 1 刘光瑞 2
( 1甘肃省动物疫病预防控制中心,兰州 730030; 2兰州市动物疫病预防控制中心,兰州 730050 )
摘 要: 猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒 ( PRRSV )诱发的一种接触性传染病, 其症状主要表现为怀
孕母猪流产、早产、产死胎、木乃伊胎及成年猪的呼吸道症状。本病自 1987年在美国爆发后, 给世界养猪业造成巨大损失。近
年来, 由于其危害性大而引起专家学者的关注, PRRS在分子生物学方面研究者较多。就其病原特性, 基因结构, 病毒蛋白,分
子生物学诊断以及 PRRS基因工程疫苗的研究等方面进行论述。
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒 分子生物学 基因工程疫苗
Advanced Researches on theM olecular Biology of Porcine
Reproductive and Respiratory Syndrome V irus
ZhangM ei
1 L iu Guangrui2
(
1
Gausu Centers for AnimalD isease Control& Prevention, Lanzhou 730030;
2
Lanzhou Centers for A nimalD isease Control& P revention, Lanzhou 730050)
Abstrac:t Po rc ine reproductive and resp iratory syndrom e v irus induces sow s abortion, the dea th of embryo s, reproduc tive and re
spiratory syndrom e of p ig lets, a contag ious diseasewh ich is called reproductive and resp irato ry syndrom e. Th is disease has spread all o
ver thew orld since orig inally occurred in 1987 in Un ited S tates. The research b io logy of prrsv has developed at very fast speed. Th is arti
cle summ ar izes the deve lopm ent o fm olecular bio logy abou t the character istic, protien, m o lecular b io logy diagnosis and the genic pro ject
bacter in .
Key words: PRRSV M olecular bio logy Gen ic pro ject bacter in
收稿日期: 20091027
作者简介:张梅,女,兽医师,主要从事重大动物疫性防控工作
通讯作者:刘光瑞,硕士研究生; Em ai:l grl19810202801003@ hotm ai.l com
猪繁殖与呼吸综合征 ( porcine reproductive and
resp iratory syndrome, PRRS) 20世纪是 80年代末出
现的一种新病。 1987年美国首先报道了该病的发
生 [ 1] ,其症状主要表现为怀孕母猪流产、早产、产死
胎、木乃伊胎及仔猪感染后的成活率下降,成年猪的
呼吸道症状。在欧美各国的猪群中引发了一场空前
的流产风暴使有关国家的养猪业蒙受了灾难性的经
济损失 [ 2, 3]。我国 1996年首次报道该病。 2006年 6
月该病在我国的南方部分省、市出现,给我国养猪业
造成了较大的损失。
1 病原特性
PRRS是由猪繁殖与呼吸综合征 ( PRRSV )病毒
引起的, PRRSV最早是荷兰中央兽医院从流产胎儿
体内分离到的, 已确认它是一种有囊膜正链单股
RNA病毒,总长约有15 kb, 含有 8个开码阅读框架
( ORFS) , 3!端有一个 Po ly A 序列 [ 4]。根据基因序
列的不同将 PRRSV分为两个大类型,即美洲型 (代
表株为 VR 2335) 和欧洲型 (代表株 LV ) ,并与鼠乳
酸脱氢酶病毒 ( LDV )、马动脉炎病毒 ( EAV ) 一起归
为动脉炎病毒科 [ 5 ]。由于基因序列的差异, 所以
欧、美毒株有抗原性差异。与所有的 RNA 病毒一
样, PRRSV具有高度的变异性 [ 6 ] , 易形成一个异源
的种群,产生病毒血症和相应的抗体。 PRRSV形态
有多种,以球形为主, 直径一般为 45- 72 nm, 核衣
壳大约有 25- 35 nm[ 7]。从自然发病猪中分离的
PRRSV没有血凝活性, 不凝集鸡、鹅、豚鼠、牛、马、
2010年第 2期 张梅等:猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展
猪、绵羊和人的红细胞。病毒经过乙醚和吐温 280
处理后具有血凝活性,但 PRRSV的这种血凝活性又
可受到 PRRSV特异性抗血清所抑制 [ 8 ]。PRRSV的
热稳定性差, 感染滴度在 56∀ 15 - 20 m in, 37∀
10- 24 h, 20∀ 、 6 d 条件下可 降 10 倍; 56∀
45 m in、37∀ 48 h以后可以被灭活, 4∀ 可存活 1个
月, - 70∀ 感染滴度可以稳定 4个月,保存 1年以上。
在血浆中的存活时间不超过 5 d, pH值高于 7或低于
5时,感染力可以减少 90% 以上。发病猪场的猪出
场后, 3周内仍有感染力。PRRSV能在灌流收集的肺
泡巨噬细胞 ( PAM )上生长, 在传代的 CRL 11171、猴
肾细胞系 CL 2621、MARC2145等细胞上生长,在这些
细胞系上均能产生明显的细胞病变 ( CPE )。 LV 在
PAM生长较好,在其它细胞系上培养则毒价很低, 而
美洲株在所有细胞系上生长都较好 [ 9]。
2 基因组结构
PRRSV基因组全长 15 kb, 含有 8个开放是阅
读框。ORF1a和 ORF1b位于基因组的 3!端,占整个
基因的 80%。编码病毒的复制酶和 RNA聚合酶活
性蛋白, ORF1a编码区有一个疏水区, 有一个推定
的丝氨酸蛋白酶区和半胱氨酸富集区。ORF1b鉴
定处 4个独特区,分别为含有芯髓序列 S /GDD的聚
合酶基元序列 ( mo tif) , 该序列见于所有正链 RNA
病毒的 RNA聚合酶;富含半胱氨酸和组氨酸的锌指
区 ( zincf inger dom ain) ;结合三磷酸腺苷或蜗牛酶基
元序列;以及其他功能不明的保守区。ORF2ORF7
在基因组的 5 端, ORF2、ORF3和 ORF4分别编码病
毒相关蛋白 GP2、GP3、GP4、ORF5、ORF6和 ORF7
分别编码病毒囊膜蛋白 ( GP5) , 膜蛋白 (M )和核衣
壳蛋白 ( N )。
3 病毒蛋白
PRRSV基因组编码的蛋白有复制酶、聚合蛋白
和结构蛋白。ORF1 编码复制酶和聚合蛋白。
ORF1a编码的聚合蛋白被自身具有的蛋白酶活性
进一步裂解后产生 6个非结构蛋白 ( NSP1、NSP1
和 NSP2 ) , 其中 NSP2 氨基酸序列在北美洲株
(VR2332) 和欧洲株 ( LV ) 之间的同源性仅有
32%,试验表明 NSP2基因中含有 B细胞表位免疫
的优势基因; NSP1和 NSP1包含两个类木瓜蛋
白酶的半胱氨酸蛋白酶区,已证实可从 1a和 1ab多
聚蛋白上自动切割下来 [ 10]。ORF1b编码的聚合蛋
白可为 ORF1a编码的蛋白酶切割后形成 RdRp、
CP2、CP3和 CP4 4个蛋白 [ 11]。GP2为结构糖蛋
白 [ 12] , 由 ORF2编码,分子量为 29- 30 kD, 有两个
明显的疏水峰和糖基化位点, LV的 GP2能整合入
病毒粒子中。GP2通过三硫键和其它结构蛋白可形
成同源或异源多聚体,其糖基化位点为 N聚糖复合
物所覆盖。GP2蛋白免疫原性差, 在病毒中含量较
少, 很难从感染的细胞裂解液或纯化的病毒粒子中
得到分离鉴定 [ 13]。GP3为高度糖基化蛋白, 具有 7
个糖基化位点,分子量为 40- 50 kD, 含 265个氨基
酸。GP3蛋白羧基端有一个与病毒血清型有关的非
中和抗原表位,其可能引起病毒基因型抗原株的差
异。在欧、美型毒株间推导氨基酸的同源率为
54% - 60% ,而且多数变异发生在 N 末端。Duran
等用杆状病毒表达载体表达了 PRRSV ORF3的产
物, 表达产物可给猪提供 68. 4 % 的保护率, 说明
ORF3表达产物在抵抗病毒感染时具有一定作用。
GP4蛋白是病毒的主要结构蛋白之一,分子量约为
31- 35 kD,有 4个糖基化位点, 其 N端和 C端有高
度的疏水区。在高尔基体内发生糖基化反应, 加上
N聚糖。M eulenberg等 [ 12]证明 LV株 FGP4蛋白诱
导的抗体具有中和作用。
GP5为糖基化的囊膜蛋白, 又称 E蛋白, 分子
量约为 26- 30 kD,含 4个糖基化位点, 还具有一段
31个氨基酸的信号肽及 3个跨膜功能区,分别位于
62- 83, 90- 106, 113- 130位氨基酸。该蛋白含有
一段很大的内部疏水区。E蛋白与 M 蛋白在囊膜
内由二硫键结合成异源二聚体。GP5有 6个抗原决
定簇,能诱导机体产生特异性中和抗体 [ 14] , 其中一
个血清型特异的线性决定簇能在体外中和病毒感
染。用 PRRSV中和性单可隆抗体和猪高滴度中和
血清抗体,从 PRRSV cDNA噬菌体文库中筛选出了
位于 GP5蛋白上的两个 B细胞抗原位点 A和 B,非
中和抗原位点 A可以被非中和抗体识别, 不被单抗
ISU252C1和猪中和血清抗体识别,在分离株中高度
可变,具有免疫优势, 该位点的抗体出现在 PRRSV
感染的早期; 抗原位点 B可被单抗 ISU252C1和猪
中和血清抗体识别,不被非中和抗体识别,在分离株
中高度保守,在 PRRSV感染中连续存在,没有免疫
15
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
优势。研究证实 PRRSV的基质蛋白和囊膜糖蛋白
GP5是淋巴细胞增生性应答的靶点。另有报道,
GP5可诱导并引发细胞凋亡 [ 15] ,表明 GP5可能与疾
病的发生有关。ORF6编码非糖基化蛋白, 也称 M
蛋白,分子量为 18- 19 kD。VR2332型和 LV 型分
别含有 174和 173个氨基酸。M 蛋白的 N端有 3
个疏水性跨膜区,针对该蛋白的单抗从欧洲和北美
洲的分离株中识别出 2个共同和 1个独特的抗原决
定 [ 16]。M蛋白在所有的 PRRSV株间高度保守,在
欧、美型毒株间也最为保守。通过感染猪康复血清
的W estern免疫印迹试验证明了M蛋白具有很强的
免疫原性,感染后 10 d就可以检测该抗体应答。表
达重组的 M 蛋白可作为血清学试验的靶抗原。
ORF7编码核衣壳 (N ) 蛋白, 分子量为 14- 15 kD,
具有一个糖基化位点,但非糖基化蛋白。北美洲型
和欧洲型分离株分别含有 123个和 128个氨基酸。
N蛋白有 6个疏水区及至少 5个抗原决定簇,其中
既有对所有毒株保守的共同决定簇,又有北美洲各型
和欧洲各型的特异性决定簇 [ 16]。N蛋白在病毒粒子
中含量较高,约占病毒蛋白总量的 20% - 40%,免疫
原性极强。试验结果表明, 感染 PRRSV后 (约 11 d)
首先产生的是该蛋白的抗体,随后产生的才是其他蛋
白的抗体。因此是 PRRS诊断中具有诊断意义的结
构蛋白之一。但其产生抗体无中和活性和保护性免
疫反应。
4 分子生物学诊断
PRRSV的 ORF6和 ORF7分别编码病毒的膜蛋
白 (M )和衣壳蛋白 (N ),是整个基因组的比较保守的
序列。各种分子生物学诊断方法多缘于此段基因。
4. 1 RTPCR
RTPCR是目前应用非常广泛的分子生物学诊
断方法。蔡家利等 [ 17]根据 PRRSV美洲毒株的基因
序列,设计一对能同时扩增 M 和 N基因的序列引
物。对 4个可疑猪场进行检测,从流产胎儿组织中
同时扩出约 918 bp的基因片段。但是 PRRSV存在
欧洲型和美洲型两种基因型, 我国现在流行的
PRRSV毒株也是两种型都存在, 利用这对引物进行
RTPCR能否能同时检测 PRRSV欧洲毒株和美洲
毒株尚需进一步探讨。 Suarez等根据编码 Le lystead
病毒株 ( LV) 核衣壳蛋白 ORF7的序列设计 1对引
物, 建立了检测 PRRSV的 RTPCR方法。该方法既
可从病毒血清、血浆、组织、PAM 中检测出病毒
RNA, 也可从细胞培养物中检测出病毒 RNA, 具有
很高的特异性和敏感性。Henn ings[ 18]等根据 PRRSV
ORF1b和 ORF7的序列设计了巢式 PCR, 该方法快
速、敏感、可靠、接毒 92 d后仍能从精液中检测出病
毒 RNA。
4. 2 核酸探针杂交技术
Park等应用生物素标记方法制备了互补于
ORF1b( LV株 1 441 - 1 480位核苷酸 ) 和 ORF7
( VR2385株核苷酸 553- 592位 ) 的两种寡核苷酸
探针,建立了检测福尔马林固定肺和淋巴组织中
PRRSV RNA的原位杂交技术, 具有很强的特异性
和敏感性。Sur等 [ 19]以 PRRSV的 RNA 为模板, 通
过 RTPCR扩增 ORF7中的 433 bp片段, 应用地高
辛标记制备 PRRSV特异性 cDNA探针,建立了检测
PRRSV的 RNA的原位杂交技术。核酸探针杂交技
术可以在肺、淋巴组织、巨噬细胞 ( PAM ) 、淋巴结及
肾的感染细胞内检测到 PRRSV的 RNA, 比免疫组
化具有更高的敏感性和特异性, 特别是检测感染后
期的细胞内 PRRSV 的 RNA。任慧英等 [ 20] 利用
ORF6片段的 463 bp的 cDNA探针, 对 45日龄 SPF
仔猪分别人工感染 ATCCVR2332株及北京分离株
B964后不同时间呼吸系统及繁殖系统中病毒核酸
的分布进行了研究。结果显示,在感染后 30 h,即可
在鼻粘膜、气管、肺脏、睾丸、附睾、精囊、前列腺、子
宫、扁桃体等组织中检出阳性杂交信号,且一直持续
到感染后 28 d。其中扁桃体中病毒的数目远多于呼
吸系统及繁殖系统组织中的数目, 说明扁桃体可作
为活体检查临床诊断重要靶器官 [ 20 ]。
5 基因工程疫苗的研究
目前,用于预防 PRRS病毒的主要是弱毒疫苗
和灭活疫苗,但弱毒疫苗存在毒力返强的危险,且有
可能传播疫苗毒。灭活疫苗的效果不十分稳定, 而
且经常导致免疫失败。为此, 各国学者都在致力于
寻找安全、效果可靠、有效的基因工程疫苗。最近发
现, ORF3和 ORF4重叠处存在一个高变区, 该区域
容易迅速变异,可能是受到免疫选择压力导致的结
果, 在免疫 (自然或疫苗诱导 ) 中可能起重要作用,
所以在未来疫苗研究中应予以充分考虑 [ 21]。Duran
16
2010年第 2期 张梅等:猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展
等 [ 22]用杆状病毒表达系统进行了 PRRS重组亚单
位疫苗的研究, 他们将 ORF27分别插入到重组的
杆状病毒的多角体启动子下游, 用 sf9细胞表达了
ORF3、ORF5和 ORF7, 利用表达产物妊娠母猪免疫
保护试验,通过检测断奶仔猪的健康状况以及成活
率等指标来证明, ORF3和 ORF5表达产物能提供一
定的免疫保护,并能阻止病毒复制,相反, 用 N表达
产物免疫的母猪虽然可以产生强烈的 IPMA抗体应
答,却不能提供保护。PlanaDuran[ 22]用杆状病毒表
达的 GP3( ORF3)免疫猪, 甚至可产生比 GP5蛋白
(被认为有望成为亚单位疫苗的候选者 ) 免疫具有
更好的保护作用, 并发现通过重组的 GP3- GP5蛋
白共同免疫可产生更好的免疫效果。随着 PRRSV
感染性克隆的成功构建,通过基因的缺失、或替换基
因组的某些部分等基因工程技术而研制出安全、高
效的基因工程疫苗以成为可能 [ 21 ]。另外, PRRSVD
NA疫苗研究也取得了较好的效果, 将 GP5基因克
隆到巨细胞病毒 ( CMV )早期启动子的控制之下构
建成真核表达质粒, 制备 DNA疫苗, 免疫仔猪后可
诱导产生抗体,实验室攻毒试验结果表明具有良好
的保护效果。由于 DNA疫苗可同时诱导产生细胞
免疫和体液免疫,并且对不同的血清型的毒株具有
交叉保护性,有可能克服病毒外壳蛋白变异导致的
免疫逃脱现象。因此, DNA 疫苗有望成为今后
PRRSV疫苗的重点研究方向 [ 8]。
6 结语
目前,国内外对 PRRSV基因结构, 病毒蛋白抗
原特性,及诊断技术等研究有很大进展,但仍有很多
问题尚不十分清楚, 如非典型的 PRRS毒株是如何
变异的及病毒如何复制、病毒编码蛋白的结构与功
能关系、病毒抗原和毒力变异的分子基础及其对免
疫系统的抑制机理等。免疫原性基因及致病基因的
筛选, 改造和利用,以及如何研制稳定、高效、安全及
可靠的基因工程疫苗将是今后对 PRRS的重点研究
方向。
参 考 文 献
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