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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
点突变对高加索乳杆菌醇脱氢酶酶活的影响
张伟 陈祈磊 朱宝泉 胡又佳
(上海医药工业研究院 创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海 200437)
摘 要: 从高加索乳杆菌基因组中克隆醇脱氢酶基因，构建重组表达菌后发现不同转化子具有不同的活性，测序结果
表明在部分位点发生了点突变。结合生物信息学知识通过对醇脱氢酶结构与作用机理分析，认为在酶关键位点的突变对酶
的活性影响较大，而非关键位点的突变对酶活的影响虽明显降低，但其突变的数目可能对酶活的影响呈现一定的累加效应。
其中活性最高的重组菌表达了一个可将苯乙酮高选择对映还原成(S)-苯乙醇的醇脱氢酶，该研究结果为酶的定向进化研究
提供了理论依据。
关键词: 高加索乳杆菌 醇脱氢酶 点突变
The Effect of Point Mutation on the Activity of Alcohol
Dehydrogenase from Lactobacillus kefir
Zhang Wei Chen Qilei Zhu Baoquan Hu Youjia
(Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry，State Key Laboratory of New Drug and Pharmaceutical Process，Shanghai 200437)
Abstract: An alcohol dehydrogenase(ADH)gene was cloned from the genome of Lactobacillus kefir DSM 20587． We found that
several transformants from this ADH expression recombinants showed different alcohol dehydrogenase activity． Sequencing results con-
firmed several point mutations occurring in the gene． With the help of bioinformatics，the structure of alcohol dehydrogenase and its mo-
lecular mechanism were analyzed． We suggested that the mutation occurring at key motif contributed to the great loss on the enzyme ac-
tivity，while those occurring at other points revealed minor but accumulative effect on the enzyme activity． The highest enzymatic trans-
formant expressed a recombinant alcohol dehydrogenase which can reduce acetophenone to(S)-phenylethanol with high enantioselectivi-
ty． The results of this work provided some theoretical evidences for the directed evolution of enzyme．
Key words: Alcohol Dehydrogenase Lactobacillus kefir Point mutation
收稿日期:2011-02-18
基金项目:“重大新药创制”科技重大专项(2009ZC09301-007)
作者简介:张伟，男，硕士，研究方向:微生物药物;E-mail:bebydou@ 126． com
通讯作者:胡又佳，E-mail:huyj@ sipi． com． cn
高加索乳杆菌(L． kefir)DSM 20587 是目前报道
的唯一一株能通过自身编码的两个醇脱氢酶催化的
两步不对称还原反应，高效、高对映选择性地合成
6-氯代-(3R，5S)-二羟基己酸叔丁酯的微生物菌株，
后者是医药工业生产抗胆固醇药物 HMG-CoA 还原
酶抑制剂的重要手性结构单元。近几年，随着各方
面技术的发展，研究人员对酶蛋白的空间结构，活性
位点的研究较以前容易，人们也有意识地利用定点
突变等技术去研究酶蛋白关键区域的结构与其活性
之间的关系，如 Zhang［1，2］等通过对 BLIP 做丙氨酸
突变替换试验来确定 BLIP与 TEM-1 等 A型 β-内酰
胺酶相互作用的关键位点。本研究结合相关生物信
息学知识，对构建来源于高加索乳杆菌(L． kefir)
DSM 20587 的醇脱氢酶重组表达菌的筛选中所得到
的几株转化子进行分析，对突变的位点，数目与酶活
性之间的关系进行了初步的探讨。
1 材料与方法
1. 1 材料
限制性内切酶，LA Taq DNA聚合酶，T4 DNA连
接酶等购于大连 TaKaRa 公司;菌株 E． coli DH5 "，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
E． coli BL21(DE3) ，质粒 pET-28a(+)等为本实验
室保藏，高加索乳杆菌(L． kefir)DSM 20587 来源于
ATCC;试剂苯乙酮、苯乙醇与 NADH 购于 Sigma-
Aldrich公司;其余相关试剂，培养基等均为国产。
1. 2 方法
1. 2. 1 高加索乳杆菌基因组总 DNA的提取 采用
SDS方法提取目的 DNA，其具体操作见参考文献
［3］。
1. 2. 2 重组质粒 pYG461 的构建以及重组菌的筛
选 高加索乳杆菌所属的乳杆菌属表达的醇脱氢
酶之间在分子序列上存有保守序列，因此我们对
GenBank数据库所公布的关于乳杆菌属表达的醇脱
氢酶序列进行一系列分析和对比后，最后根据序列
的同源性设计 PCR 引物:GCGGGATCCATGAAAT-
CAACCATTTTTGT和 GCGAAGCTTCTATTTTTGAGC
GACAACC。参考菌株及其相应醇脱氢酶的GenBank
登录号见表 1，引物由英维捷基生物技术有限公司
合成。以高加索乳杆菌(L． kefir)DSM 20587 基因组
为模板进行 PCR 后将目的基因与载体 pET-28a
(+)相连接后构建质粒 pYG461(图 1) ;再将构建
的 pYG461 质粒转化至菌株 E． coli BL21(DE3) ;质
粒的提取、转化参考文献［4］。
表 1 设计 PCR引物所参考的菌种和醇脱氢酶
菌种 醇脱氢酶登录号
Lactobacillus brevis(ATCC 367) ABJ63420
ABJ64152
ABJ64046
Lactobacillus plantarumWCFS1 NP_786231
NP_786232
NP_785248
CAD65227
CAD65732
图 1 重组表达质粒 pYG461 构建图
1. 2. 3 重组菌的培养以及诱导表达 将重组菌
E. coli BL21(DE3)接种于含有卡那霉素的 LB 液体
培养基，37℃，200 r /min培养 16 h后，以 1%的接种
量转接新鲜的 LB液体置于 37℃，150 r /min 的条件
下培养至 OD600 为 0. 6，加入 IPTG 至终浓度为
1mmol /L诱导表达 6 h。
1. 2. 4 粗酶液的制备以及醇脱氢酶活性的测定
将诱导后的工程菌菌体利用超声波破碎，离心，收集
上清，即粗酶液;所得初酶液可用分光光度计在 340
nm(%340 = 6. 22 mM
－1cm －1)下结合标准底物苯乙酮
以检测醇脱氢酶活性;相应操作见参考文献［5］。
1. 2. 5 酶活力单位的定义 在 30℃的条件下，每
分钟催化转化 1 mol的 NADH的酶量定义为一个酶
活单位(U) ，计算公式:U = EW × V /6. 22(EW 为
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2011 年第 9 期 张伟等:点突变对高加索乳杆菌醇脱氢酶酶活的影响
1 min内 340 nm吸光度的变化，V 为反应液的体积
(mL) ，6. 22 为摩尔消光系数)。
1. 2. 6 醇脱氢酶不对称还原反应 反应体系总体
积 1 mL，含有 0. 20 mmol /L NADH;7. 7 #L 异丙醇
(0. 1 mol /L) ;1. 2 #L 苯乙酮(10 mmol /L) ;176 #L
100 mmol /L pH6. 0 的磷酸钾缓冲液(含 1 mmol /L
MgCl2) ;800 #L 纯化的醇脱氢酶 LK-ADH(5. 6
U /mL)。混匀后于 30℃振荡反应 4 h 后离心，取上
清液用 1 倍体积氯仿抽提。得到的氯仿层萃取液用
于气相色谱分析，根据峰面积计算产物光学纯度
(对映体过量值，e. e 值) ，并由此确定醇脱氢酶 LK-
ADH的对映选择性。
1. 2. 7 气相分析条件 气相色谱仪:Agilent 6890
色谱工作站;手性色谱柱:CP-Chirasil-DEX CB col-
umn(25 m，diameter:25 #m) ;柱温程序:60℃保持
5 min，5℃ /min升至 195℃;载气流速:1. 3 mL /min;
载气:氦气;进样量:1 #L;检测器:FID。
2 结果
2. 1 L. kefir DSM 20587 基因组提取以及 PCR结果
按照方法 1. 2. 1 提取 L. kefir DSM 20587 基因组
DNA，并用分光光度计测定其浓度(表 2) ，琼脂糖凝
胶电泳鉴定其纯度(图 2) ，从 A260 /A280比值和电泳
图谱可知所提取的 DNA 纯度符合要求。利用方法
1. 2. 2 中所设计的引物以 L. kefir DSM 20587 基因组
为模板进行 PCR，其结果见图 3，可知 PCR所得条带
大小与理论值(1 044 bp)相符。
表 2 高加索乳杆菌基因组 DNA样品的测定
A260 A280 A260 /A280 DNA浓度(#g /mL)
2. 577 1. 196 2. 18 1275. 4
M． DNA /Hind Ⅲ DNA marker;1．基因组 DNA
图 2 基因组 DNA的电泳鉴定
M． DL2000 marker;1．基因组 DNA
图 3 PCR扩增 LK-adh基因结果
2. 2 重组菌的筛选
将 PCR产物凝胶回收后与 pET-28a(+)连接，按
图 1构建路线构建重组质粒，并将重组质粒转化至大
肠杆菌 E. coli BL21(DE3)，过夜培养后挑取转化子，并
对其进行 PCR以及酶切验证以筛选目的转化子，利用
方法1. 2. 3对目的转化子进行诱导表达。取1 mL菌液
样品进行 SDS-PAGE 分析(以诱导前的 E. coli BL21
(DE3)作为对照)，结果如图 4 所示，转化子有蛋白表
达，且其分子量与预测值一致(约 44 kD)，因此我们认
为所得转化子为目的转化子且能表达目的蛋白。
M. 蛋白质 Marker;1． IPTG诱导前重组菌的表达产物;
2． IPTG诱导后重组菌的表达产物
图 4 工程菌表达醇脱氢酶的 SDS-PAGE分析
2. 3 粗酶活的测定结果
按照方法 1. 2. 4 制备所得阳性转化子的粗酶
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
液，并对其进行测活，发现不同转化子间所表达的酶
的活性具有一定的差异;选取 4 株酶活具有代表性
的转化子分别命名为 1#，2#，3#，4#，接种培养、诱
导;诱导培养时每个转化子做 3 个平行，其他培养条
件一致，最后每个转化子的酶活取其平均值，具体结
果见表 3。
表 3 LK-ADH不同转化子的活性
转化子 诱导重组蛋白酶活(10 －2U /mL)
1# 7. 2
2# 5. 1
3# 1. 2
4# 6. 0
2. 4 重组菌的测序
对 4 个转化子进行测序并对其结果进行分析
(测序由英维捷基公司完成)结果发现 4 个转化子
的 DNA序列存在一定的差异，进而导致其氨基酸序
列也存在一定的差异，这也可能是导致其酶活不同
的原因。以活性最高的 1#转化子为参照(表 4) ，发
现其余 3 个转化子与 1#转化子的氨基酸差异与其
酶活的降低并不是简单的累加关系，如 3#转化子只
有 1 个氨基酸残基发生突变，但其酶活远小于 2#转
化子(有 3 个氨基酸残基发生突变) ，造成这种现象
的原因可能是由于一些突变发生在酶的关键区域，
而该位点对酶的活性影响较大所致。另外，虽然对
酶活性的影响与关键位点突变相比，非关键位点的突
变对酶活的影响明显降低，但其突变的数目可能对酶
活的影响呈现累加效应，例如，4#与 2#转化子。
表 4 与 1#转化子相比其他转化子的突变位点及其形式
转化子 氨基酸的突变
1# ——————
2# Cys36→Arg36，Asp239→Tyr239，Phe317→Ser317
3# Gly176→Ser176
4# Glu56→Ala56
2. 5 生物信息学分析
利用蛋白质数据库对目前已经公开发表的的乳
杆菌属的醇脱氢酶(ADH)进行生物信息学分析，发
现 ADH有两个进化上的高度保守域:锌离子结合位
点以及辅因子结合区域，这两个区域特别是辅因子
结合区域对 ADH 的生物学功能的实现至关重要。
另外，由于来源于高加索乳杆菌的醇脱氢酶(LK-
ADH)含有 348 个氨基酸残基，属于中等链的醇脱
氢酶，因此我们将 LK-ADH 的序列上传到由德国斯
图加特大学生化技术研究所创建的中等链脱氢酶 /
还原酶蛋白工程数据库(http:/ /www． mdred． uni-
stuttgart． de)进行了进一步深入分析。与该数据库
现有收录的总共 2 684 条中等链脱氢酶序列的比对
后，在线分析系统返回了与 LK-ADH 结构最为接近
的 15 条序列，并在多序列比对结果中指出了预测的
可能结构域位点，图 5 列出关键部分。而后，根据
Michael教授［6］关于中等链醇脱氢酶结构与功能关
系的研究，我们对比对结果进一步分析，发现某些醇
脱氢酶结构能够结合两个锌原子，分别为结构锌和
催化锌;其中结构锌原子结合在 4 个半胱氨酸残基
的硫原子上，这 4 个半胱氨酸残基在酶蛋白一级结
构上相互靠近，处于分子结构的表面并且固定而保
守的分别间隔 2，2，4 个残基［7］;另一方面，催化锌原
子由 3 个氨基酸残基固定，分别是 Cys-His-Asp，另
一个位置由一个水分子的氧占据从而完全饱和锌原
子的配位层［8］。结合上述信息，认为在 LK-ADH 的
序列中，氨基酸残基“ Cys-Xaa(2)-Cys-Xaa(2)-Cys-
Xaa(7)-Cys”参与结构锌的结合，Cys、His、Asp 则参
与结合催化锌，且序列中的 GDGAVG是典型的 Gly-
Xaa-Gly-Xaa(2)-Gly结构(图 5 黑框部分) ，即醇脱
氢酶的辅因子结合域，该区域对 ADH 的生物学功
能的实现至关重要，因此该区域的突变可能会对
酶活产生显著影响(3#转化子) ，这与本试验结果
一致。
2. 6 转化产物对映选择性测定的气相分析
按照方法 1. 2. 6，对活性最高的 1#转化子在不
对称还原反应中的对映选择性进行了测定与分析，
其气相色谱分析结果见图 6。根据图 6 可知，反应 4
h后，苯乙酮峰面积 = 23. 88; (R)-苯乙醇峰面积 =
1. 42;(S)-苯乙醇:峰面积 = 462. 28，因此所得的 1#
转化子在不对称还原苯乙酮的反应中光学对映选择
性为 S-构型。其中，对映体过量值(e. e 值)=
(462. 28 － 1. 42)/(462. 28 + 1. 42 ) × 100%
=99. 4%。
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2011 年第 9 期 张伟等:点突变对高加索乳杆菌醇脱氢酶酶活的影响
图 5 LK-ADH与 15 种中等链脱氢酶序列的比对
3 讨论
本研究通过 PCR 得到了来源于高加索乳杆菌
的醇脱氢酶基因，并通过测序，结合生物信息学知识
对其结构与作用机理，突变位点与活性之间的差异
进行分析，初步探讨了点突变与酶活之间的关系，认
为酶关键位点氨基酸的突变，对酶的活性影响最大，
而非关键位点的氨基酸突变对酶活的影响虽明显降
低，但其突变的数目可能对酶活的影响呈现一定的
累加效应。
目前，已报道发现的众多醇脱氢酶中只有少部
分能够还原。例如，苯乙酮及其衍生物这类带有庞
大侧链的酮类化合物［9，10］，之前有研究报道从高加
索乳杆菌中克隆得到了可以高对映选择性地将苯乙
酮转化为(R)-苯乙醇的 adhR 基因［11］，而我们克隆
到的醇脱氢酶 LK-ADH 的转化子能够高对映选择
性将苯乙酮转化为(S)-苯乙醇，对映体过量值(e． e
值)达到 99． 4%，不但表现出了潜在的应用价值，而
且极大地拓宽了高加索乳杆菌在生物转化中的应用
范围。活性最高的 1#转化子的插入基因 adhS 也提
交 GenBank数据库获得登录号:EU877965。
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图 6 不对称还原苯乙酮产物的 GC分析
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠)
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