全 文 ：
技术与方法

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2009年第 5期
变性梯度凝胶电泳技术在微生物分子
生态学研究中的应用
翟振华 1
李艳双 2
( 1 首都师范大学生命科学学院,北京 100048; 2 冀州市职业技术教育中心,冀州 053200)


摘
要:
变性梯度凝胶电泳在微生物分子生态学研究中的应用日益广泛,已成为研究微生物多样性和动态变化的有力
工具。对变性梯度凝胶电泳技术中存在的问题,如基因片段的选择、共迁移、背景色和异源双链分子的形成等作了综述, 以期
为进一步更好地利用该技术进行微生态的研究奠定基础。
关键词:
变性梯度凝胶电泳
微生物分子生态学
共迁移
异源双链分子
Application and Analysis of Denaturing GradientGel E lectrophoresis
inM icrobialMolecular Ecology
Zhai Zhenhua
1
L iYanshuang2
(
1
College of Life Science, Cap italN ormal University, B eijing 100048;
2
J izhou VacationalT echnique C entre, J izhou 053200)


Abstrac:t
Denaturant grad ient g el electropho res is ( DGGE) has been w ide ly used for studies o fm icrobia l divers ity and comm un ity
changes in m icrob ial mo lecu lar eco logy
The potentials and lim ita tions of the techn ique, such as cho se of DNA fragm ent, co
m igration,
background and form a tion o f he teroduplexes we re d iscussed
It would be he lp fu l to improve its app lication on m icroeco logy research

Key words:
DGGE
M icrob ia l eco logy
Co
m igration
H ete roduplexes
收稿日期: 2008
10
31
基金项目:北京市自然科学基金资助项目 ( 5062003) , 2006年北京市人事局留学回国优先项目
作者简介:翟振华 ( 1983
) ,男,河南省人,硕士生,主要从事水体微生物多样性方面的研究; E
ma i:l zhaizh enhua168@ yahoo
com
cn


传统微生物的分离分析方法主要是通过表型特
征和细胞形态的观察, 对其生理生化特性进行相应
的比较分析,在早期的分类鉴定中起到了很大的作
用。但实验室的一些培养方法采用配比简单的营养
物质和固定的培养温度, 难以达到某些特殊微生物
自然条件下增殖所需要的条件,并且许多微生物是
附着在沉淀物或颗粒上, 显微镜法也无法检测到。
因此大量具有科研应用价值的新菌由于难培养或不
可培养而无法被研究和利用 [ 1~ 2] , 从而限制了人们
对一些重要微生物的认识。
随着分子生物学技术的发展,许多新的方法和技
术已经被提出并突破了传统培养方法的限制,如核糖
体基因间区分析 ( ribosomal intergen ic spacer ana lysis,
RISA )、扩增核糖体 DNA限制性分析 ( amplified ribo

soma lDNA restrict ion ana lysis, ARDR )、单链构像多态
性 ( sing le strand conformation po lymorphism, SSCP)、变
性梯度凝胶电泳 ( denaturing gradient gel e lectrophore

sis, DGGE )、磷脂脂肪酸图谱分析 ( phospholip id fatty
acid, PLFA)荧光原位杂交 ( fluorescence in situ hybrid

ization, FISH )、末端限制性片段长度多态性技术 ( ter

minal restriction fragment length polymorphism, TRFLP)
等,主要通过在基因水平上利用微生物 16S rDNA序列
来判断微生物间的系统发生关系 [ 3]或设计特殊的核苷
酸探针来检测环境中某个体微生物分类单元 [ 4, 5],这些
方法已经被广泛应用到检测微生物群落的遗传多样
性上。
1
PCR
DGGE的原理
变性梯度凝胶电泳技术是 DNA指纹技术, 由
Fischer和 Lerman[ 6]最先提出并用于检测 DNA的突
变。 1993年, M uyzer等 [ 7]首次将该技术应用于微生
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2009年第 5期
物生态的研究。依据长度相似而在碱基序列上存在
差异的 DNA片段都有一个或多个溶解区域 (m elt ing
doma ins), 这些溶解区域在相应的变性剂浓度下变
性,发生空间构型的变化。 DNA中具有低 G + C含
量的溶解区域首先溶解,而高 G + C含量区域仍保
持双链。部分溶解的 DNA双链最后停留在其相应
的变性剂梯度位置, 染色后可以在凝胶上呈现为分
开的条带,这就能将具有相同长度而序列有差异的
DNA分子分离开。依变性剂梯度方向的不同,
DGGE可分为垂直 DGGE和平行 DGGE, 前者变性
剂梯度同电场方向垂直, 用于分离野生型和变异型
的最佳变性剂梯度范围; 后者变性剂的梯度同电场
的方向平行,主要用于解链范围明确的 DNA片段的
检测。
PCR
DGGE技术打破微生物不可培养性的局
限,直接从所研究的生物样品中提取出总 DNA, 将
目标基因片段采用 5
端加上
GC clamp
的引物进
行 PCR扩增, 再通过变性梯度凝胶电泳进行分
离 [ 8, 9] ,不仅可以比较不同样品中微生物的多样性
和相似性,而且还可通过对目标带的回收、克隆及测
序来进一步分析特征性的微生物类群。因此, 在近
年来的微生物分子生态学的研究中发挥了重要的
作用。
2
PCR
DGGE的应用
当前 PCR
DGGE技术在微生物分子生态学的研
究主要体现在微生物多样性、微生物群落动态、细菌
的富集和分离以及基因水平上的微观差异等方面,其
应用对象包括海水、淡水、土壤、植物内部和根际、污
染环境中的微生物。D iez等 [ 10]首次用 DGGE研究海
洋中微微型真核生物群落的多样性,比较不同时间内
地中海西南部同一地点不同深度的微微型真核生物
的多样性,发现垂直方向上的多样性差异很大,而同
一深度不同时间的差异不显著。Casamayor等 [ 11]利
用 PCR
DGGE和 16S rRNA基因片段的序列分析,发
现 C iso和 V ilar湖中的微生物优势群落成员和组成在
时空上均不相同; D iaz[ 12 ]以 PCR
DGGE对施加无机
肥结合堆肥和堆肥加氮两种不同处理的土壤中微生
物种群进行聚类分析,发现长期堆肥处理并没有改变
土壤中微生物种群。 Sa lles等 [ 13, 14]用 PCR
DGGE检
测和分析两块草地样地中 Burkholderia属群落的多样
性,表明植物主体和根际土壤样品中生物多样性明显
不同。
3
PCR
DGGE在微生物分子生态学研究中
的局限及改进
3
1
基因片段种内异质性导致结果偏差
细菌的核糖体 16S rRNA基因在不同种属间具
有高度的特异性和保守性, 一直以来广泛用于鉴定
不同细菌的系统发育关系和种属的确定。 PCR

DGGE对微生物群落的分析中首先涉及目的基因片
段的 PCR扩增,但许多种的核糖体 16S rDNA拷贝
间存在异质性,这种异质性是由于核糖体基因多拷
贝和拷贝进化不同所造成的 [ 15] , 即在高分辨的
PCR
DGGE中, 一个菌种可分离出多条带,这种异质
性严重影响了对微生物群落多样性和结构的分析,
导致 PCR
DGGE指纹图谱并不能精确的反映出原
始样品中微生物的相应信息。C lay ton等 [ 16]对基因
序列异质性的发生在 GenBank数据库中进行了调
查, 结果表明 42% ~ 80%的公布有两个序列的菌种
是由于异质性而不是由于测序出错引起的。另外,
在 DGGE步骤多次重复操作试验证明, 16S rDNA的
指纹图谱结果是可重复的, 这表明异质性不是因
PCR步骤而产生的假象。所以 16S rDNA为基础的
PCR
DGGE由于存在异质性而在微生物群落分析中
有很大的限制性 [ 17]。
另据报道, RNA聚合酶
亚基的基因 rpo
和
促旋酶 B亚单位的基因 gy rB在不同的细菌中也具
有高度的保守性和特异性, 而且在菌种内没有异质
性, 在 PCR
DGGE图谱中基本上一条带可对应一种
微生物。对 16S rRNA和 rpo
的异质性比较结果表
明 [ 17] , 在分析实验室常见菌株和海水生菌株时,
rp o
更能精确的反映微生物群落的结构和组成。
H iroaki等 [ 18]对分枝杆菌 gy rB序列分析认为, gyrB
序列比 16S rRNA序列更好的区分相似种。 Suzuk i
等 [ 19]研究了海洋细菌 gyrB基因序列认为种的水平
上使用 gy rB序列要优于 16S rRNA序列, 所以 16S
rRNA适用于较远的亲缘关系,而 rpo
和 gyrB比较
适用于种间或属间关系的比较。这表明非异质基因
可能成为未来微生物群落分析的基石,且对于更准
确地分析样品中微生物的信息具有非常重要的
价值。
56
2009年第 5期 翟振华等:变性梯度凝胶电泳技术在微生物分子生态学研究中的应用
但实际应用中由于 16S rRNA序列的数据库信
息量大、全面等优点, 目前仍被广泛用于不同样品中
微生物生态的相对分析。如果想进一步进行样品中
微生物信息的精确分析, 还要同时结合其他技术。
例如, Burr( 2005)等提出利用 PCR
DGGE和 16S rD

NA文库相结合的方法有助于较准确分析样品中微
生物的信息,即利用 PCR
DGGE技术通过对比普通
样品和由该样品建的一定数量的 16S rDNA克隆的
指纹图谱,来确定能覆盖样品中微生物信息的克隆
数目, 然后随机取相应数量的 16S rDNA文库的克
隆进行测序,根据序列分析结果确定样品中微生物
的群落结构,一般取 35~ 50个克隆进行测序分析便
可覆盖淡水中微生物的优势群落的范围 [ 20 ]。
3
2
PCR
DGGE中存在共迁移现象
DGGE对细菌群落的分析主要根据相同或相似
长度 DNA双链分子, 理论上每一条带对应于一个单
独的操作分类单元,全部的条带反映了种群的丰度和
多样性 [ 21] ,对 DGGE条带可以进行切胶直接 PCR扩
增测序或 PCR克隆来鉴定感兴趣的条带。但近期研
究发现 [ 22~ 25] ,不同的分类单元的 DNA片段在 DGGE
图谱上可能会共迁移到相同的位置,导致 DGGE条带
的切胶测序结果并不等同于 DGGE条带所对应的结
果。产生这种现象的原因可能是相同长度的 DNA片
段含有相似的溶解区域,致使它们在变性梯度凝胶中
具有相似的溶解行为而停留在了相同的位置。为了
减少共迁移对 DGGE的限制, Gafan等 [ 26]提出了变性
梯度凝胶电泳凝胶扩展 ( denaturing gradient gel e lec

trophoresis ge l expansion, DGGEGE) ,此方法根据胶的
长度、浓度梯度和条带在 DGGE胶中所停留的位置计
算目的条带所在位置的胶的浓度,然后依据此浓度浓
度
2%的浓度梯度胶进行二次电泳分离, 就可将具
有相同溶解行为的 DNA片段分离开来,即对目的条
带进行小范围的二次电泳来分离共迁移的 DNA片
段。这种方法可对共迁移问题加以解决,但在进行多
个样品的比较分析时工作量大、耗时,而且在二次电
泳后还可能存在共迁移的现象,因此难以彻底有效地
解决问题。目前多数研究者在目的条带的切胶鉴定
中,主要通过 PCR克隆及序列分析提高阳性克隆的
数目,来减少共迁移对 DGGE对细菌群落鉴定的造成
的局限性。
3
3
背景色和异源双链核苷酸分子的形成对 DGGE
分析的影响
由于 DGGE的检测精确度的限制,仅能检测出
种群中的优势菌种,在较为复杂的群落结构,可辨别
的条带的数目与动力学估测的数目是不同的, 并且
PCR
DGGE展示的结果可能扭曲原始样品中相对丰
度的比例,优势的扩增结果可能并不是群落中的优
势菌种 [ 27, 28] ,而群落中数量较少的菌种在生化循环
中也起着非常重要的作用 [ 29~ 31]。至今, DGGE图谱
中常存在背景拖尾现象, 是由于低丰度扩增产物被
染色的结果,所以背景中的 DNA的分离和扩增对研
究非优势群落有很重要的意义 [ 32, 33]。
由于不同 DNA片段迁移的问题, 不能从离散的
条带中提取到比较纯的序列 [ 34, 35 ], 用 SSCP分析也能
得到相类似的结果 [ 36]。DNA片段含有多个解链域也
可导致清晰度受限,出现拖尾的模糊条带 [ 37] ,对后来
的切胶扩增中也会产生影响, PCR中不完全链的合成
可能导致一个模板产生多条带,也使切胶扩增结果异
样。有相似解链行为的不同序列共同迁移,优势扩增
产物在整个胶上都有分布,这就表明条带图案并不仅
是扩增产物由于不同的解链行为而简单地离,还是不
同 DNA结构的复杂相互作用的结果 [ 33]。此外, PCR
过程中存在单链 DNA的形成 [ 38, 39] , 继而影响迁移和
切胶扩增。
异源双链核苷酸分子的形成是影响切胶扩增的
另外一个因素。 Satokari等 [ 40] 在分析研究某种
B ifidobacterium strains时发现,异源双链的形成导致
DGGE条带数目的增加; Speksnijder等 [ 41]使用 PCR

DGGE分析关系相近的 16S rDNA克隆混合模板,混
合产物的 DGGE条带中出现两条新的条带,这两条带
的再扩增和 DGGE分析表明,扩增产生的条带与原始
样品的相同,仅仅在亮度上有差异,这种现象是由异
源双链的形成引起。
研究证明,在任何混合菌落 PCR中都可能发生
异源双链核苷酸分子的形成, 而且其形成与序列间
的相似度相关 [ 20 ]。种内的异源双链的形成比种间
的形成更为普遍,加大引物浓度, 降低循环数可减少
这种现象,且通过测序和计算机分析可对异源双链
核苷酸分子的认识更进一步, 但还不能根本解决这
个问题。为了去除 PCR产物中的异源双链 DNA分
57
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2009年第 5期
子, Q iu等 [ 42]根据异源双链的迁移速度与源双链、
单链的不同的原理, 采用 5%的非变性丙烯酰胺凝
胶进行 PCR产物同源双链纯化; Thompson等 [ 43 ]利
用修补 PCR( recond ition ing PCR)的方法降低异源双
链和单链分子的产生。这些方法都有效地减少了异
源双链 DNA分子, 而在扩增 rpo
时目前还未观察
到异源双链核苷酸分子的形成, 所以 DGGE条带的
条带的序列分析中可以考虑并使用适合的基因和一
些补偿的方法。
3
4
提取方法和通用引物对 DGGE分析结果的
影响
PCR
DGGE在分析微生物群落多样性时, DNA
的提取方法和通用引物的选择和使用也影响着
DGGE的分析。在用不同的裂解方法来提取同一土
壤样品的 DNA时, 每种方法对应的 DGGE指纹分析
结果也不同 [ 44, 45]。Martin
Laurent[ 46 ]用 RISA方法
分析不同 DNA提取方法的结果也有偏差, 这表明环
境样品中 DNA提取方法引起的偏差并非偶然; Luo
等 [ 47]对 DNA提取方法和通用引物的选择对渔场水
中细菌群落 DGGE分析的影响作了研究, 其中对 7
种不同的 DNA提取方法和 4对通用引物 ( 968 f/
1401r 63 f/518r, 341f /926r和 933f /1387r)的分析结
果表明, 不同的提取方法的 DNA产量、纯度都不相
同,此外, DGGE图谱中条带的数目、条带的亮度及
优势条带也不尽相同。DNA的提取中,裂解效率可
能改变了原来的种类的相对丰度 [ 46] , DNA样品中
引入不同程度的抑制剂, 例如自然样品中的腐植酸
和重金属可能影响 PCR扩增的效率, 从而导致了提
取结果的差异。目前还没有一个能适用于所有环境
样品分析得 DNA提取方法, 为了减少提取方法的问
题或操作问题而不能真实反映原样品种细菌的相关
信息的影响, Dorthe G roth Petersen[ 49]在 PCR
DGGE
和 DNA提取过程中使用内参,可使对个体菌种的相
对丰度分析追朔到原始样品,简化了多样性的相关
比较分析,补偿了实验中的变化,把实验的错误与真
正的群落丰度和结构的变化区别开来。
4
展望
传统培养分离方法为现代微生物分类鉴定奠定
了良好的基础,在微生物分类鉴定史上有着不可替
代的作用。现代分子生物技术在基因的水平上对微
生物进行快速、准确、简便地分类鉴定,拓宽了人们
的认识范围。PCR
DGGE技术作为广泛使用的方法
虽然具有一定的局限性,但避免了培养的限制,适合
分析优势种群和调查群落的动态变化。为了弥补此
方法的不足, 可与其他方法相结合 [ 49] , 如克隆测序
技术,对 DGGE条带进行切胶、克隆、测序, 或将得
到的序列进行荧光原位杂交、实时定量 PCR等, 这
些方法的结合将提高对样品中微生物的分子生态研
究能力,更好地开发和利用有益的微生物资源。
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