全 文 ：
综述与专论

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 2期
真菌漆酶性质、分子生物学及其应用研究进展
司静1
李伟 2
崔宝凯 1
戴玉成 1
( 1北京林业大学微生物研究所,北京 100083; 2中国科学院微生物研究所,北京 100101)


摘
要:
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶。目前发现多种生物能够产生漆酶, 包括植物、真菌、昆虫和细菌等, 其中, 以真
菌中的白腐真菌研究最多。由于漆酶在生物漂白、农作物秸秆利用以及环境污染处理等方面具有广阔的应用前景, 漆酶研究
受到越来越多的关注。同时, 随着分子生物学技术的发展, 漆酶研究已经深入到基因水平, 多种漆酶基因已经成功获得克隆,
一些漆酶基因也实现了异源表达。现针对真菌漆酶的生物学性质、分子生物学及其应用的研究进展进行了概括总结, 并对其
前景进行了展望。
关键词:
漆酶
生物学特性
分子生物学
应用
Advances of Research on Characteristic, Molecular B iology and
Applications of Laccase from Fungi
S i J ing
1
L iW ei2
Cu iBaokai1
Da iYucheng1
(
1
Institu te of M icrob iology, Beijing F orestry University, B eijing 100083;
2
Institute of M icrobio logy,
Chinese A cademy of Sciences, Beijing 100101)


Abstrac:t
Laccase is a k ind o f po lypheno l ox idase wh ich conta ins copper and can be secreted by m any life
fo rm s such as plan ts,
fung ,i insects and bacter ia, amongwh ich, thewh ite
rot fung i have been cons ide red as them ost im po rtant group of organ ism. Recen tly,
laccase has been app ly ing in the fields o f b io
b lanch ing, crop stalk utilization and b io rem ed iation. Laccase research is increasing ly em

phasized in the wo rld. M eanwh ile, w ith the deve lopm ent o f re latedm o lecu lar b io log ica l techno logy, the research o f laccase has reached
to gene leve ,l severa l k inds of laccase genes w ere c loned, and som e other laccase genes w ere expressed heterologously. This paper
summ ar ized its b io log ical character istics, deve lopm en t o fmo lecu la r biolog ica l research and app lications of laccase from fung,i andm ade
prospec t for its foreground.
Key words:
Laccase
B io log ica l character istic
Molecu la r b io logy
App lication
收稿日期: 2010
05
20
基金项目:国家自然科学基金 ( 30900006 ),国家重大科技专项 ( 2009ZX08009
050B)
作者简介:司静,女,硕士研究生,研究方向:真菌漆酶基因工程菌的构建; E
m ai:l jingsi1788@ 126. com
通讯作者:戴玉成,男,博士,研究方向:木生真菌多样性及其应用; E
m ai:l yuch engd@ yahoo. com
cn
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶 ( po lypheno l ox i

dase EC. 1. 10. 3. 2) ,与抗坏血酸氧化酶和哺乳动物
血浆铜蓝蛋白同源, 属于蓝色多铜氧化酶家族 [ 1 ]。
1883年,日本学者吉田 [ 2]首次在日本紫胶漆树 ( Rhus
vernicif lua )漆液中发现一种可催化漆固化过程的蛋
白质, 即为漆酶 ( laccase)。漆酶在自然界中广泛分
布于植物、真菌、少数昆虫和细菌中, 一些动物肾脏
(如猪肾 )和血清中也发现了漆酶。其中, 白腐真菌
产生的漆酶被认为效果最好,因此大量关于漆酶的
研究工作取材于真菌。分泌漆酶的真菌主要集中于
担子菌门 (Basidiomycota)、子囊菌门 (A scomycota )及
半知菌类 (D euteromycetes )等真菌, 其中最主要的是
担子菌门的白腐真菌 [ 3]。
漆酶研究已有一百多年的历史, 是人类研究最
早的酶之一。目前,漆酶的研究内容涉及生物化学、
分子生物学及遗传学等多个领域, 具体包括菌株生
长特征、合成调控、分离纯化、晶体结构、催化机制和
基因克隆表达等内容。鉴于漆酶的重要应用价值,
概述了真菌漆酶生物学性质、应用及其分子生物学
的研究进展,并对其前景进行了展望。
2011年第 2期 司静等:真菌漆酶性质、分子生物学及其应用研究进展
1
真菌漆酶的生物学性质
1. 1
结构特征和催化机理
真菌漆酶是一种糖蛋白, 由肽链、糖配基和
Cu
2 +
3个部分组成,分子量在 60- 390 kD之间 [ 4 ]。
肽链一般由 500- 550个氨基酸组成,糖配基主要有
氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯
糖,占整个分子量的 10% - 80% , 因此糖配基组成
及含量的不同是漆酶分子量存在较大差异的主要原
因 [ 5]。多数漆酶含有 4个 Cu2 + , 一个
型 Cu2+
( Type
Cu2+简称 T1Cu) , 一个
型 Cu2 + ( Type

Cu
2 +简称 T2Cu)和两个
型 Cu2 + ( Type
Cu2 4 +简
称 T3Cu)。T1Cu又称蓝色 Cu,与 Cys的 S配位结
合形成的共价键 Cu2 +
SCys在 600 nm处有强吸收
值,使酶分子呈蓝色 [ 6 ]。
漆酶的催化机理尚不十分清楚, 据推测的漆酶
催化机理可分为底物自由基中间体的产生和 O2还
原成 H 2O两个方面, T1Cu从还原态的底物吸收电
子,底物被氧化形成小分子自由基,进而导致多种非
酶促次级反应, 如羟化、歧化和聚合等。同时 T1Cu
吸收的电子传递到 T3Cu, O 2在那里被还原成 H2O,
期间经过了两步双电子反应,第一步是形成超氧化
物中间体, 第二步是生成 H2O[ 7, 8]。正因为漆酶催
化氧化主要依赖于底物自由基的产生, 因此选择适
当的底物和反应条件, 可以提高漆酶催化氧化反应
的选择性。
1. 2
理化性质
1. 2. 1
温度
多数真菌漆酶的最适反应温度较低,
一般在 25- 50
之间。据报道, 也有一些真菌漆酶
比较耐高温, Jordaan等 [ 9]从来自南非的嗜热白腐真
菌菌株中得到的耐高温漆酶, 其最适反应温度为
70
, 90
保温 9 h仍具有完全活性; 担子菌 PM 1
( CECT 2971)漆酶
的最适反应温度为 80
[ 5 ]。
同种漆酶氧化不同底物的活力受温度的影响趋势相
似,但温度对几种漆酶活力的影响因底物不同而有
一定差异。王剑锋等 [ 10] 对黑管孔菌 ( Bjerkandera
adusta )漆酶进行酶学性质分析得到 Lac C在 65
、
70
时酶活最高, LacA在 60
、65
时酶活最高。
1. 2. 2
pH
多数真菌漆酶的最适反应 pH 在 4. 0
- 6. 0之间。研究发现,不同来源的漆酶最适 pH范
围不同, 如毛栓孔菌 ( Trametes hirsu ta ); pH 3. 5 -
4
5, 云芝栓孔菌 (Trametes versicolor) pH 4. 0- 5. 0;
丝核菌 (Rh izoctonia praticola ) pH 6. 0 - 7. 0[ 11]。同
一种漆酶的作用底物有所不同, 其最适 pH 也有差
异, 原因可能是由于 pH直接影响不同底物的氧化
还原电位。大孢花褶伞 (Panaeolus pap ilionaceus )漆
酶 Lcc B和 Lcc D以 ABTS [ 2, 2

azino
b is( 3
ethy l

benzoth iazoline
6
sulfon ic acid), 2, 2

连氮
双 ( 3
乙
基苯并噻唑
6
磺酸 ) ]为底物时的最适反应 pH 均
在 2. 5左右,而以 2, 6
二甲氧基苯酚 ( DMP)为底物
时, 最适反应 pH分别为 6. 0和 7. 0。
1. 2. 3
等电点 ( pI)
真菌漆酶多数为酸性蛋白质,
pI在 3. 0 - 6. 0之间, 少数种类接近中性。刘淑珍
等 [ 12]纯化了 1株担子菌, 在室温下测定其 pI为
4
02。从糙皮侧耳 ( P leurotus ostreatus)中分离的漆
酶 POXA I, pI为 6. 7, 接近中性 [ 13]。 2000年, Sh in
等 [ 14]从毛栓孔菌 (Tram etes hirsu ta )中纯化出一种新
漆酶, pI为 7. 4,显示出与其他真菌漆酶在氨基酸组
成和序列上的差异。
1. 2. 4
金属离子及抑制剂
多种金属离子,如 K+、
Ag
+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Pb2+、Pd2+、H g2 +、
Co
2 +、Ba2+、Fe2+ 和 Fe3 +可影响漆酶的活性。研究
发现, Cu2+对多数漆酶起激活作用, 但对小孔硬孔
菌 (R igidoporusm icroporus)漆酶的活性无影响 [ 15 ]。
一般来说, 铜螯合剂对漆酶的活性都有抑制作
用, 包括卤化物、Cys、EDTA和 SDS等。不同的抑制
剂对漆酶活性的抑制效果不同; 同一种抑制剂对不
同菌种产生的漆酶的抑制作用也有差异;抑制剂对
漆酶活性的影响随抑制剂浓度的不同而不同, 一般
情况下随着抑制剂浓度越大,抑制作用越强 [ 16]。
1. 2. 5
作用底物
漆酶能催化许多化合物的氧化
反应,作用底物比较广泛,包括氨基苯酚、邻、对二苯
酚、多酚、多胺、木质素、芳基二胺、香草酸、藜芦醇、
阿魏酸和吐温等, 一些漆酶还能高效地氧化抗坏血
酸。必须注意的是,过氧化物酶和其他一些多酚氧
化酶也可以催化类似的反应,但这些酶不会利用 O 2
作为第二底物,因此催化反应中氧吸收速率可以作
为测定漆酶活性的可靠依据。
1. 2. 6
其他
不同有机酸配制的缓冲液中, 漆酶活
性也有一定差异。糙皮侧耳 (P leurotus ostreatus) Ax3
漆酶在琥珀酸缓冲液中活性最高,在柠檬酸、酒石酸
49
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 2期
和醋酸缓冲液中活性依次下降 [ 17]。 Bogdanovskaya
等 [ 18]研究了水
乙醇溶液对云芝栓孔菌 (T ram etes
versicolor )漆酶活性及其生物电催化活性的影响。
当然, 影响漆酶活性的因素还有很多, 有待进一步
研究。
2
真菌漆酶分子生物学研究进展
随着分子生物学的发展,越来越多的分子生物
学方法和手段被引入到真菌漆酶的研究中。目前,
漆酶研究已深入到基因水平,对漆酶基因结构有了
比较清晰的认识,多种漆酶基因获得克隆,一些漆酶
基因实现了异源表达, 表达调控机制的研究也越来
越深入,为更好地认识和利用漆酶奠定了基础。
2. 1
真菌漆酶出发菌株的筛选
研究真菌漆酶时, 选取自身产酶量较高的菌株
作为出发菌株对于后续研究工作的顺利进行具有重
要意义。目前研究较为深入的真菌漆酶来自云芝栓
孔菌 (Trametes versicolor ) [ 19]、射脉菌 ( Phlebia radia

ta )
[ 9]、鲜红密孔菌 (Pycnoporus cinnabarinus ) [ 20 ]、糙
皮侧耳 (P. ostreatus ) [ 21]、毛木耳 (Auricularia poly tri

cha )
[ 22]、黑木耳 (Auricularia auricula) [ 23]等。但上述
研究工作中,均未对所选取的菌株种类做系统性的
筛选与产酶活性对比, 仅随机选取一些菌株进行研
究。因此, 这些研究存在明显的片面性、零散化现
象,大量潜在的具高产漆酶活性的真菌种类被忽视
了,造成了目前一些研究工作事倍功半的局面。综
上所述,应当扩大菌株的筛选范围,增加菌株的近缘
种种类,如对于研究较多的栓孔菌属 ( Trametes)、侧
耳属 (P leurotus)等可以增加其中的种类, 对整属或
该属中多数菌株的产酶活性进行系统性对比分析,
选取产酶活性高的菌株作为后续研究的出发菌株。
2. 2
真菌漆酶基因的结构分析
真菌漆酶基因整体序列的同源性并不高, 但是
不同漆酶中铜原子结合区域的保守性相当高 [ 50 ]。
启动子元件常为 CAAT、TATA框, 外显子长度一般
介于 1 000- 2 500 bp,内含子多,长度变化很大,其
中一些高度保守。例如, 金针菇 ( F lammulina velu

tipes)漆酶结构基因编码区序列全长为 2 110 bp,包
括 9个内含子,其长度从 56- 69 bp不等,在起始密
码子上游 275 bp和 64 bp处有 CAAT框和 TATA
框,终止密码子下游 204 bp处有 Po ly (A )加尾信号
ACTAAA
[ 24]。鲜红密孔菌 (Pycnoporus cinnabarinu s)
漆酶基因 cDNA克隆全长为 1 828 bp, 不包含 Poly
( A )尾,基因开放读码框长度为 1 554 bp, 上游序列
240 bp处包括启动子元件 CAAT和 TATA, TATA框
位于转录起始位点上游 68 bp处。其他的真菌漆酶
也包含启动子元件 CAAT和 TATA, 然而,尽管这些
序列保守,但它们的位置并不相同 [ 21]。
此外, 许多真菌能产生由多基因编码的几种漆
酶基因的同系物,如云芝栓孔菌 (Trametes versicolor )
有 5种 [ 25] ,双孢蘑菇 (Agaricus bisporus)有 2种 [ 26] ,
环柄韧伞 (L entinus sajor
caju )有 4种 [ 27 ] , 糙皮侧耳
(P leuro tus ostreatus)至少有 4种 [ 28]。一般来说这些
基因在不同的环境条件下或真菌生长的不同阶段中
表达。研究发现,环柄韧伞 (L entinus sajor
caju )漆酶
的 4种同系物产生发生在基因转录的不同水平, Lac
3基因为组成性表达基因, 而 Lac 1、Lac 2和 Lac 4
则在不同的诱导条件下表达 [ 27 ]。
2. 3
真菌漆酶基因的克隆
随着分子生物学技术的发展, cDNA末端快速
扩增 ( RACE )、外显子拼接 PCR、基因组步行 ( G e

nom e
W alking)和 RT
PCR等各种新的技术和策略
也被应用于漆酶基因的克隆中。在众多研究中,
RT
PCR被认为是目前获得真菌漆酶基因应用最为
广泛并且较为成熟的技术; 从获得基因全长角度考
虑, RACE技术正成为漆酶基因分离克隆中一种重
要而有效的技术手段, 而 Genome
Walk ing是 RACE
技术的有益补充,因此, 可将二者有机结合来获取真
菌漆酶基因的全长。
1988年, F rohm an等 [ 29]利用 RACE技术从糙皮
侧耳 (P leuro tus ostreatus)中克隆到漆酶 POX I基因。
随后, O tterbe in等 [ 4 ]利用 RT
PCR合成了 cDNA第
一链,并根据已克隆的鲜红密孔菌 (Pycnoporus cin

nabarinus ) I
937 漆酶 Lac 1基因设计引物, 经
RACE /PCR扩增得到 1个 1 570 bp的 DNA片段。
2004年, 张银波等 [ 24 ]利用 RACE和 G enome
W alk

ing技术获得金针菇 (F lammulina velutip es)漆酶基因
全长为 1 563 bp,编码 21个氨基酸残基组成的信号
肽和 500个氨基酸残基组成的成熟肽。 2007年张
桂敏等 [ 30 ]利用外显子拼接 PCR技术获得灵芝 ( Ga

nod erma lucidum )漆酶基因全长。
50
2011年第 2期 司静等:真菌漆酶性质、分子生物学及其应用研究进展
另有学者利用漆酶铜原子结合位点的保守性,
根据其氨基酸保守性设计引物克隆漆酶基因。 D

Souza等 [ 31]根据 9种担子菌漆酶基因氨基酸 N
末端
的铜原子结合区域设计引物克隆到相应的 PCR产
物。Co ll等 [ 5]运用基因组文库和 cDNA文库克隆到
担子菌 PM 1( CECT 2971)的漆酶 Lac I基因。
2. 4
真菌漆酶的异源表达
漆酶基因的克隆和序列分析, 最终目的都是为
了实现漆酶的高效表达,因此, 研究该基因的表达尤
为重要。真菌漆酶可以在酵母和丝状真菌中表达,
影响漆酶在酵母中表达的因素有很多,如启动子、C
端界点序列、信号肽、菌株型号和发酵条件等, 而通
过构建融合蛋白、抑制丝状真菌自身的蛋白酶系统
对于提高漆酶的分泌水平有十分重要的作用 [ 32]。
2008年, V incenza等 [ 33]将糙皮侧耳 (P leurotus ost

reatus)漆酶基因 POXA3中两个编码同工酶的基因
POXA 3a和 POXA 3b导入乳酸克鲁维酵母 (K luyvero

myces lactis)中, 成功建立了异源二聚体蛋白重组表
达系统。同年, G ianluca等 [ 34]对刺芹侧耳 (P leuro tus
eryng ii)的一个漆酶基因进行克隆并成功将其在酿
酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae )中进行诱导表达,
并且证明在固定化酵母中表达的重组酶酶活比游离
化酵母中的高 1. 6倍。这样的例子还有很多, 说明
异源表达是目前漆酶基因表达方式的主要趋势,而
且发展较为广泛,技术相对成熟。
到目前为止,真菌漆酶基因的表达还处于实验
室研究阶段,还未得到令人满意的可以投入工业生
产的漆酶基因工程菌株。这其中原因很多, 在异源
表达过程中存在的主要问题包括: 选择的表达系统
有局限性,有些宿主遗传稳定性较低;关于影响漆酶
表达的具体因素尚不十分确定,这种影响可能来自
于基因转录时某种调控因子,或是来自于翻译过程
中某些中间代谢产物, 以及宿主本身的内部机制对
于漆酶基因表达的作用等; 表达宿主中存在一定的
反馈调节,漆酶自身信号肽与宿主信号肽之间的相
互作用,以及诱导后表达的重组蛋白在宿主内加工
不完整,造成空间构象混乱、酶活较低等问题。解决
的办法如下:首先,表达系统的选择。目前国内外研
究中使用的表达系统包括酿酒酵母 (Saccharomyces cer

evisiae )
[ 35, 36]、甲醇毕赤酵母 (P ichia methanolica) [ 4, 27]、
曲霉属 (Asp erg illus )和木霉属 ( Trichoderma ) [ 37, 38]的
一些种类等。而寻找新的适合于真菌漆酶基因表达
的宿主成为一种发展趋势,如采用二倍体宿主,以及
真菌漆酶基因同源表达研究的兴起。但由于一些高
等真菌生长较为缓慢,摇瓶培养会导致菌丝断裂,不
易产生菌丝球,进而影响到漆酶的产生, 因此, 大量
研究仍采取异源表达的方式。其次, 对已有表达系
统的改造。对毕赤酵母进行全基因分析,选择强启
动子、适宜的转化方法, 通过基因敲除以及诱变等方
法, 提高表达载体在宿主中的拷贝数和稳定性,优化
翻译起始区前后 mRNA的二级结构, 尽量选择表达
系统偏爱的密码子,避免表达产物在细胞内的降解,
保证产物的加工和修饰等,亦可提高漆酶产量,这也
为以后的研究提供一种新的思路。再次,深入研究
表达宿主内部分子调节机制。表达系统中存在拮
抗、协同、反馈等调控作用, 势必会影响到异源蛋白
质的表达,这些机制亟待解决,也是影响到漆酶能够
投入工业生产的关键所在。
2. 5
真菌漆酶基因的表达调控
真菌漆酶的表达受不同条件的影响, 包括前文
中提到的培养温度、pH, 培养基中的碳源、氮源, 金
属离子和低分子芳香族化合物等均可影响漆酶的产
生,并且漆酶的表达调控在种间有显著的不同。除
外源物质和培养条件能影响漆酶基因表达外, 分子
水平也存在调控漆酶表达的机制。研究较深入的是
一种板栗疫病病原真菌 ( Cryphonectria parasitica )漆
酶基因 Lcc 1的表达调控机制,它的转录受两种拮
抗途径所调控: 一条是依赖于 Ca2+、肌苷三磷酸及
钙调蛋白的正调控途径; 另一条是对低水平蛋白合
成抑制剂环丝胺酸敏感的负调控途径。 Ping等 [ 39]
鉴定了该基因启动元中一个 111 bp的元件, 它和该
菌细胞中蛋白提取物显示了回文专一性结合, 并且
在插入一个漆酶基因的基本启动元件后对该基因有
激活转录的功能。在这一领域的深入研究, 将有助
于揭示该酶的表达调控机制和实现对其人为控制。
K iisk inen等 [ 3 7 ]研究木霉 (M elanocarpus albomyces )
漆酶在里氏木霉 (T richoderma reesei)中异源表达时
发现,野生漆酶比狂犬病毒漆酶融合蛋白表达量高,
W estern b lo tting分析表明, 融合漆酶的胞内积累水
平在转录后受到限制。同年 [ 3 5 ]他们使用酿酒酵母
51
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 2期
(Saccharomyces cerevisiae )
因子基因的前导序列替
换木霉 (M elanocarpus albomyces )漆酶基因 Lac 1自
身的信号肽序列,漆酶表达量增加,而且延长漆酶本
身的 C
末端基因序列也能显著提高漆酶产量 ( 6倍
于天然漆酶基因 )。
目前,国外真菌漆酶基因的研究较深入系统,已
有多种菌种的漆酶基因得到克隆并进行了分析和鉴
定,其中很多甚至实现了异源表达。相比之下,国内
关于漆酶基因表达的研究大多集中在基因表达条件
的优化上,重复研究较多, 而探索漆酶新的表达途径
以及选择新的表达宿主方面研究相对较少, 而这也
将成为以后研究的热点。
3
真菌漆酶的应用研究
3. 1
纸浆造纸领域
漆酶在纸浆造纸领域中的应用是目前研究的热
点,并取得了一些可喜的进展。主要体现在纸浆生
物漂白、生物制浆、纸浆增湿作用、纸浆脱墨、处理制
浆污水和改善纸浆纤维性能等诸多方面 [ 40, 41]。由
于真菌等微生物能够产生漆酶,具有降解污染物的
巨大潜力,而且在环境中可以保持较高的活性,所以
主要被应用于纸浆造纸领域。这些应用具有操作简
单,处理效果好且污染物转化后无二次污染等众多
优点。但由于真菌漆酶的生产周期长,产量低,因此
漆酶还没有真正投入工业生产,仅处于实验室研究
阶段。鉴于真菌漆酶在造纸行业的应用将有助于解
决当今环境污染等问题,随着研究的不断深入,真菌
漆酶应用也将会越来越成熟,因此利用真菌漆酶进
行纸浆的生物漂白和提高纸浆的漂白质量是一个极
具潜力的研究课题,具有诱人的应用前景。
3. 2
生物合成领域
漆酶在真菌色素合成中扮演着重要的角色,并
且可能参与菌索的形成, 它也能通过细胞间催化酚
类化合物的聚合粘连来固定菌丝 [ 42] , 人们已经把漆
酶的这种功能应用到化工行业的开发研究中。在酶
的催化作用下,漆酶氧化木质素可以提高纤维板原
料中木质素与纤维之间的连接能力, 用制浆废水中
的木质素为原料可以生产木屑板等产品 [ 43]。此外,
漆酶能催化生漆中的漆酚氧化,产生高分子聚合物,
使生漆干燥成膜,这是漆酶最重要的作用之一 [ 44]。
3. 3
食品领域
漆酶在饮料加工、食药用菌生产、食品分子交联
等方面均有涉及。利用漆酶处理果汁可专一性去除
酚类,改善果汁的口感、色泽、透明度及防止发生混
浊, 有助于天然果汁的稳定 [ 45 ]。不过, 漆酶可破坏
水果的颜色和香味,催化破坏果蔬食物中存在的维
生素 C,尤其当组织受到破坏又与空气接触或加热
时 (如榨取过程 ), 酶的活性更高。因此, 加工时应
缩短反应时间、降低温度等。还有研究指出,漆酶处
理过的样品在储存中更易变色。此外,漆酶还参与
子实体形成的调控作用。岁楼等 [ 46]研究发现,漆酶
转录水平和活性在菌丝生长阶段是最高的。因此,
在食药用菌制种过程中加入漆酶制剂能加速木质素
的分解,为菌丝提供更丰富的养料,加快菌丝吃料,
缩短培养时间,利用这种方法培养木耳、香菇、灵芝
等将有益于节约木材和扩大生产规模。同时, 漆酶
能使食品分子间形成交联, 而凝胶态对于研究食品
的半固体结构特征是很重要的, 这也为食品的开发
利用打开了新途径。今后应在漆酶毒理学方面加强
研究,以保证漆酶作为食品添加剂的安全性。
3. 4
能源领域
生物燃料电池是利用酶或者微生物组织作为催
化剂,将燃料的化学能转化为电能。近年来,在无隔
膜的酶生物燃料电池方面, 研究较多的是利用漆酶
在阴极催化 O2还原生成 H 2O [ 47]。然而底物的 pH
值变化会对漆酶的活性产生一定影响 [ 48]。目前这
类电池的工作寿命较短,因此还不适合于实际应用,
仍需进行深入细致的研究。此外, 利用漆酶以及漆
酶中间体系统对农作物秸秆进行预处理,降解其中
的木质素,为农作物燃料乙醇生产工艺中秸秆预处
理的无污染化奠定生物学基础 [ 49]。
3. 5
木材加工领域
王国栋等 [ 50 ]发现, 用漆酶或漆酶的复合体系
替代当今所用的含有毒物质的木材胶黏剂, 生产人
造板,无环境污染, 能耗低, 是制造真正绿色木制品
的必然途径,为人类提供更好的健康、绿色、环保产
品。然而,生产的人造板对水较为敏感,且漆酶处理
木材人造板的中试及其产业化, 漆酶处理木材的反
应动力学、漆酶处理木材产生自由基的种类、漆酶催
化氧化木本植物材料的无胶胶合机理等基础理论尚
52
2011年第 2期 司静等:真菌漆酶性质、分子生物学及其应用研究进展
缺乏研究,这将成为未来研究的重点。
3. 6
环保领域
近年来, 人们已经利用漆酶有效地去除制浆废
水、纺织废水中的木质素, 在有毒化合物的生物消除
方面也有很好的应用价值 [ 51]。2009年, R igas等 [ 52]
在无菌条件下设计多水平因素试验, 利用糙皮侧耳
(P. ostreatus)对被一种称为林丹的杀虫剂污染的土
壤进行生物净化,发现其产生的漆酶可以降解稠环
芳烃类 ( PAH )物质, 对土壤的生物救治起到很好的
作用。
3. 7
改善纤维特性领域
漆酶在改善纤维特性领域方面也有一定应用,
此过程是纤维表面木质素的直接氧化和溶液中酚类
物质中间体氧化的循环过程。刘娜 [ 5 3 ]对漆酶和漆
酶 /中间体改善纤维特性的机理进行研究时发现,漆
酶单独处理纸浆时, 主要发生的是纤维表面木质素
的聚合反应,纤维表面之间产生黏合,从而改善了纸
张的湿强度;漆酶 /中间体体系处理纸浆时, 介体的
结构不同,活化纤维的机理不同,纤维特性的改善程
度也不同。以酚类物质 (丁香酸甲酯 )为介体, 木质
素的降解和聚合同时发生, 并以酚类物质与纤维之
间发生的交联反应为主, 漆酶处理后的纤维因交联
的广度与深度大大增加,纤维之间产生融合现象,大
大改善了纤维特性,提高了纤维之间的胶合程度。
3. 8
生物检测领域
随着漆酶研究的不断深入、生物技术的日臻完
善以及微电子学技术的迅速发展, 漆酶在催化过程
中消耗 O2的这一过程很容易被转化为电信号而被
高灵敏地检测到。利用这一原理可以制造各种类型
的生物传感器 [ 48 ]。一种安培生物传感器用于测量
酚类化合物已被应用于纸浆厂的污水测定, 并且在
免疫检测中, 漆酶有望替代辣根过氧化物酶而成为
新的标记酶 [ 54]。
20世纪 80年代后, 固定化漆酶的研究得到了
新的发展,到目前为止,已研究开发了多种固定化方
法,固定化漆酶技术的不断成熟为漆酶在生物检测
中的应用提供了重要的条件。Bogdanovskaya等 [ 18]
对漆酶固定化技术与酶活的关系以及漆酶电极的工
作原理进行了系统性研究, 发现固定化漆酶电极具
有灵敏度高、重复性好、检测范围宽等优点。
4
结语
漆酶是一种多功能酶,可催化的反应多种多样,
其生物学性质、培养条件优化、基因克隆、异源表达
和表达调控的研究对于探索漆酶的应用和其在真菌
个体发育过程中的功能具有十分重要的作用。真菌
中漆酶研究比较系统,工业应用和体内的分子调控
机制将是今后的研究热点。国际国内针对漆酶的种
种价值都在进行很深入地研究, 广泛涉及到各个领
域, 但仍存在不少问题, 如关于漆酶大规模工业化生
产方面的报道较少,菌株合成漆酶水平偏低,生长缓
慢, 重组酶催化效率低等。可以预见,一方面, 今后
的主要研究方向仍将集中于开拓漆酶新的应用领域
和应用途径;另一方面, 开发漆酶高表达菌株, 探索
酶合成代谢的影响因子及其作用规律,构建漆酶基
因工程菌和基因敲除、诱变等方法将大大促进真菌
漆酶功能与表达调控机制的研究。
参 考 文 献
[ 1] H aku lin enN, K i isk inen LL, K ruu sK, et a.l C rystal structu re of a
laccase fromM elan ocarpu s a lbom yce s w ith an in tact trinuclear copper
site. Nat S truct B io,l 2002, 9: 601
605.
[ 2] Yosh ida H. Ch em istry of Lacquer ( Uru sh ) part 1. J Chem Soc,
1883, 43: 472
486.
[ 3 ] 许颖, 兰进. 真菌漆酶研究进展. 食用菌学报, 2005, 12 ( 1 ):
57
64.
[ 4] Otterbein L, Record E, Longh i S, et a.l M olecu lar clon ing of the
cDNA encod ing laccase from Pycn oporus c innabarinu s I
937 and ex

p ress ion in P ich ia pa storis. Eu r J B iochem, 2000, 267 ( 6 ):
1619
1625.
[ 5] Co llPM, Tabernero C, S antam aria R, et a.l C haracterizat ion and
structu ral analys is of the laccase I gene from the new ly isolated l ign i

no lytic ba sidiom ycete PM 1 ( CECT 2971) . Appl EnvironM icrob io,l
1993, 59( 12) : 4129
4135.
[ 6] Litvin tseva AP, H enson JM. C lon ing, characterization, and tran

scrip tion of th ree laccase genes from G aeum annomyces gram inis var.
tritici, th e take
al l fungus. App l Environ M icrob io,l 2002, 68 ( 3 ):
1305
1311.
[ 7] Zoppellaro G, Sakura iT, H uang H. A novelm ixed valence form of
Rhu s vern ic if era laccase and its react ion w ith d ioxygen to g ive a per

oxide in term ed iate bound to the trinuclear center. J B iochem, 2001,
129( 6) : 949
953.
[ 8] T orres J, Svistunenko D, Karlsson B, et a.l Fast redu ct ion of a cop

p er center in laccase by n itric oxide and form at ion of a perox ide in

term ed iate. J Am Chem Soc, 2002, 124( 6 ): 963
967.
53
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 2期
[ 9] Jordaan J, Leukes WD. Isolat ion of a therm ostab le laccase w ith
DMAB and MBTH ox idative coup ling activity from a m esoph ilic
w h ite rot fungu s. E nzym e and M icrob ial T echnology, 2003, 33 ( 2

3) : 212
219.
[ 10 ] 王剑锋,王璋,饶军,等.烟管菌漆酶的分离纯化及部分酶学性
质研究.菌物学报, 2008, 27( 2 ) : 297
308.
[ 11 ] Yaropolov A I, Skorobogat
ko OV, V artanov SS, et a.l Laccase:
propert ies, catalyticm echan ism, and app licab ility. App l B iochem
B iotechn, 1994, 49: 257
280.
[ 12 ] 刘淑珍,钱世钧.担子菌漆酶的分离纯化及其性质研究.微生物
学报, 2003, 43( 1) : 73
78.
[ 13 ] Palm ieriG, B ianco C, C ennam o G, et a.l Purificat ion, character

ization and fun ct ional ro le of a novel extracellu lar protease from
P leurotus ostrea tu s. A pp l Environ M icrob io,l 2001, 67 ( 6 ) :
2754
2759.
[ 14 ] Sh in KS, Lee Y J. Pu rification and characterizat ion of a n ew m em

ber of the laccase fam ily from the wh ite
rot basid iomycete Coriolu s
h irsu tu s. A rch B iochem B iophys, 2000, 384( 1 ) : 109
115.
[ 15 ] 康从宝,刘巧,李清心,等.白腐菌产漆酶的纯化及部分酶学性
质.中国生物化学与分子生物学, 2002( 5 ) : 638
642.
[ 16 ] E ggert C, Tem pU, ErikssonKE, et a.l The lign inolyt ic system of
the wh ite rot fungus Pycnoporu s cinnabarinu s: pu rif icat ion and
characterizat ion of the laccase. A pp l E nviron M icrob io,l 1996, 62
( 4 ) : 1151
1158.
[ 17 ] 刘尚旭,董佳里,张义正.糙皮侧耳 Ax3产漆酶条件及其部分酶
学性质研究.四川大学学报: 自然科学版, 2004, 41 ( 1 ) : 160

161.

[ 18 ] Bogdanovskaya VA, Kuznetsova LN, Tarasev ich MR. B ioelectro

catalyt ic and enzym atic act ivity of laccase in w ater
eth anol solu

t ion s. Ru ss ian Jou rnal of E lectroch em istry, 2002, 38: 1192
1200.
[ 19 ] J
n sson L, S j
str
m K, H oggstr
m I, et a.l Characterization of a
laccase gen e from the wh ite
rot fungu sTrame tes versicolor and stru c

tural featu res of b as id iom ycete laccases. B ioch im B iophys A cta,
1995, 1251( 2 ) : 210
215.
[ 20 ] E ggert C, Lafayetfe PR, Tem p U, et a.l M olecu lar analys is of a
laccase gene from th e wh ite rot fungus Pycnoporu s cinnabarinu s.
App lEn vironM icrob io,l 1998, 64( 5 ) : 1766
1772.
[ 21 ] G iard ina P, C ann io R, Martitran i L, et a.l C lon ing and sequ en

cing of a laccase gene from the lign in
degrading ba sid iomyce teP leu

rotu s ostrea tus. App lEnv ironM icrob io,l 1995, 61( 6 ) : 2408
2413.
[ 22 ] 杨建明,孟鑫,徐鑫,等.毛木耳漆酶基因的克隆、测序分析及鉴
定.微生物学通报, 2008, 35( 11 ): 1708
1714.
[ 23 ] 高键,李杰.黑木耳漆酶基因在毕赤酵母中的表达及其酶学性
质研究.东北农业大学学报, 2009, 40( 8 ): 58
62.
[ 24 ] 张银波,姜琼,江木兰,等.金针菇漆酶基因的克隆及其在毕赤
酵母中的表达研究.微生物学报, 2004, 44 ( 6) : 775
779.
[ 25 ] Yaver DS, Golight ly E J. C lon ing and characterization of three lac

case genes from th e w h ite rot basid iomycete T ram etes vil losa: ge

nom ic organ izat ion of th e laccase gene fam ily. G ene, 1996, 181 ( 1

2 ): 95
102.
[ 26] Sm ithM, Shnyreva A, W ood DA, et a.l Tandem organ izat ion and
h igh ly d isparate exp ress ion of the tw o laccase gen es Lcc 1 and L cc
2 in the cu lt ivated m ush room Agaricus bisporus. M icrob iology,
1998, 144: 1063
1069.
[ 27] Soden DM, O
C allaghan J, Dob son ADW. M olecu lar clon ing of a
laccase isozym e gene from P leurotus sajor
caju and expression in the
h eterologou sP ich ia pastoris host. M icrob iology, 2002, 148: 4003

4014.

[ 28] Pezzella C, Autore F, G iard ina P, et a.l The P leu rotu s ostreatus
laccase m u lt i
gene fam ily: isolat ion and h eterologou s exp ress ion of
n ew fam ily m embers. Cu rr G enet, 2009, 55( 1 ): 45
57.
[ 29 ] Frohm anMA, Du shMK, M artin GR. R ap id isolation of fu ll
length
cDNA s from rare tran scrip ts: am pl ification us ing a s ingle gene
spe

cific o ligonucleot ide prim er. Proc N at l Acad Sc,i 1988, 85: 8998

9002.

[ 30] 张桂敏,王亚平,蔡立涛,等.外显子拼接法合成真菌灵芝漆酶
基因 cDNA.武汉大学学报:理学版, 2007, 53( 6) : 701
705.
[ 31] D
Souza TM, Boom inathan K, Reddy CA. Isolat ion of laccase
gene
specific sequences from w h ite rot and brown rot fung i by
PCR. A pp l EnvironM icrob io,l 1996, 62 ( 10) : 3739
3744.
[ 32] 刘志明,郭丽琼,林俊芳.真菌漆酶异源表达研究进展.中国生
物工程杂志, 2009, 29: 135
142.
[ 33] V incen za F, Carm ine E, G iovanna F, et a.l H eterologou s exp res

sion of heterod im eric laccase from P leurotus ostrea tu s inK luyvero

myces lac tis. App lM icrob iol B iotechno,l 2008, 77( 6) : 1329
1335.
[ 34] G ian luca B, Ch iara L, G iovann iM, et a.l M olecu lar clon ing and
h eterologou s expression of a laccase gen e from P leurotus eryngi i in
free and imm ob ilizedSa ccharomyces cerev isiae cells. App lM icrob io l
B iotechn o,l 2008, 79 ( 5) : 731
741.
[ 35] K iisk inen LL. Saloheim o M. M olecu lar clon ing and expression in
Saccharomyces cerev isiae of a laccase gene from th e ascom yceteM el

anocarpu s albomyces. Appl E nviron M icrob io,l 2004, 70( 1 ) : 137

144.

[ 36] K lonow ska A, Gaudin C, AssoM, et a.l LAC 3, a n ew low redox
poten tial laccase from T ram etes sp. Strain C30 ob tained as a recom

b inant p rotein in yeast. Enzym eM icrob Techno,l 2005, 36 ( 1) : 34

41.
[ 37] K iisk inen LL, K ruus K, Ba iley M, et a.l Expression ofM elano

carpu s albomyces laccase in Trich od erm a reesei and characterization
of the purif ied enzym e. M icrob iology, 2004, 150: 3065
3074.
[ 38] Saloheim o M, N iku
Paavola ML. H eterologou s produ ct ion of a
l ign inolytic enzym e: expression of theP hlebia rad ia ta laccase gene
in Trich od erm a reesei. B iotechnology, 1991, 9: 987
990.
[ 39] Wang P, Nuss DL. Iden tif icat ion of a Cryphon ectria para si tica lac

54
2011年第 2期 司静等:真菌漆酶性质、分子生物学及其应用研究进展
case gen e p rom oter elem ent in volved in cyclohex im ide
inducib le,
hypoviru s
repress ib le tran scrip tional activation. Gen e, 1998, 210
( 1 ) : 79
84.

[ 40 ] 周学飞.微生物酶制剂在造纸工业的应用前景.中国造纸学报,
1998, 13( B12) : 74
82.
[ 41 ] 宋美静.纸浆氯漂废水的处理.纤维素科学与技术, 1999 ( 2 ) :
22
25.
[ 42 ] 付时雨,周攀登.真菌漆酶及其催化对苯基酚聚合条件的研究.
化学通报, 2005( 3) : 26
28.
[ 43 ] 史长兴,魏丽华.三种树种木纤维的漆酶活化胶合.木材工业,
2005, 19( 1) : 25
26.
[ 44 ] 甘景镐.生漆的化学 [M ] .北京:科学出版社, 1984: 73
117.
[ 45 ] 黄慧艳.漆酶在食品工业中的研究与应用进展.食品科技, 2003
( 4 ) : 4
7.
[ 46 ] 岁楼,王波.漆酶在食品工业中的应用及其产生菌的研究.食品
科学, 2005, 26: 260
263.
[ 47 ] B arton SC, K im HH, B inyam in G, et a.l E lectro redu ct ion of O2
to w ater on the
w ired
laccase cathode. Phys Chem B, 2001, 105
( 47 ): 11917
11921.
[ 48] W illner I. B iom aterials for sen sors, fuel cells and circu itry. Sci

ence, 2002, 298( 5602) : 2047
2048.
[ 49] 李玉英,杨震宇.漆酶的特性和应用研究进展.江西科学, 2009,
27( 5) : 680
684.
[ 50] 王国栋,陈晓亚.漆酶的性质、功能、催化机理和应用.植物学通
报, 2003, 20 ( 4) : 469
475.
[ 51] 钞亚鹏,钱世钧.真菌漆酶及其应用. 生物工程进展, 2001, 21
( 5) : 23
28.
[ 52] Rigas F, Papadopoulou K, Ph ilippou ssisA, et a.l B iorem ed iation
of lindane con tam inated soil by P leurotus ostrea tu s in non sterile
cond itions u sing m u ltilevel factorial design. Water A ir Soil Po llut,
2009, 197 ( 1
4 ) : 121
129.
[ 53] 刘娜.漆酶和漆酶∕介体改善未漂 KP纤维特性及其机理研究
[D ] .天津:天津科技大学, 2006.
[ 54] 初华丽,梁宗琦. 漆酶的潜在应用价值. 山地农业生物学报,
2004, 23( 6 ): 529
533.
(责任编辑
马鑫 )
(上接第 6页 )
[ 37 ] R ichterCV, BalsT, S ch
nem ann D. C om ponen t interact ions, reg

u lation and m echan ism s of ch lorop last s ignal recogn it ion part icle

depend ent protein transport. EJCB, 2010, 89( 12 ): 965
973.
[ 38 ] H am elP, O live J, Pierre Y, et a.l A new subun it of cytochrom e
b6 f com p lex undergoes revers ib le phosphorylat ion upon state transi

tion. J B iol Chem, 2000, 275( 22 ) : 17072
17079.
[ 39 ] Yu SG, S tefanssonH, Rom anosk a E, A lbertsson P
. Tw o d im en

s iona l electrophores is of thylakoidm em brane proteins and its app li

cat ion to m icrosequencing. Photosyn th Res, 1994, 41 ( 3 ) : 475

486.

[ 40 ] G
m ezSM, N ish io JN, Fau llKF, et a.l Th e ch lorop last grana pro

teom e defined by in tactm ass measurem ents from liqu id chromatog

raphym ass spectrom etry. M olC ellProteom ics, 2002, 1( 1) : 46
59.
[ 41 ] W h itelegge JP, Zh angH, Agu ilera R, et a.l Fu ll subun it coverage
liqu id chrom atography electrospray ion ization m ass spectrom etry
( LCM S+ ) of an oligom eric m em brane p rotein. M ol C ell Pro

teom ics, 2002, 1( 10 ): 816
827.
[ 42] Friso G, G iacom elli L, Y tterb erg A J, et a.l In
depth analys is of
the thylakoid m em bran e proteom e of A rabidopsis thal iana ch loro

p lasts: new p roteins, n ew fun ct ion s, and a p lastid proteom e data

b ase. P lant C el,l 2004, 16 ( 2) : 478
99.
[ 43] Gou las E, S chubertM , K ieselbach T, et a.l Th e ch lorop last lum en
and stromal p roteom es ofArabid opsis tha liana show d ifferent ial sen

sit ivity to short
and long
term exposure to low tem peratu re. Plant
J, 2006, 47( 5 ) : 720
734.
[ 44] S chub ertM. The ch lorop last lum en proteom e ofA rabidopsis tha li

ana [ D ] . S tockholm: In tellecta DocuSys, Gteborg ( ISBN: 91271
40265429 ) , 2006: 7
37.
(责任编辑
马鑫 )
55