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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
三丁基锡暴露条件下杂色鲍肝胰
腺均一化 cDNA文库的构建
贾锡伟 1, 2 张子平 3 邹志华 2 王艺磊 2
(1厦门大学 近海海洋环境科学国家重点实验室 厦门大学环境科学研究中心 ,厦门 361005;
2集美大学水产学院 福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室 ,厦门 361021;
3德克萨斯州立大学化学与生物化学系 ,美国圣马科斯 , TX 78666)
　　摘 　要 : 　用 RDP试剂提取三丁基锡暴露诱导的杂色鲍肝胰腺总 RNA,经 O ligotex纯化得到 mRNA;应用 SMART技术合
成双链 cDNA,双链特异核酸酶 (DSN)进行 双链 cDNA的均一化 ,构建了杂色鲍三丁基锡暴露诱导下的均一化 cDNA文库。
原始文库的库容为 413 ×106 CFU /m l,重组率为 9719%。从文库中随机挑选了 3 288个克隆进行测序 ,得到 3 048个高质量
EST序列 ,其中有 370条 Contigs, 2 103条 Singlets, Unigenes共 2 473条 ,冗余率为 18186%。以上结果说明该文库质量较好 ,为
进一步筛选相关功能基因打下基础 ;较低的冗余率说明该文库值得继续使用大规模 ESTs测序的方法寻找相关功能基因 ,并
为进一步使用基因芯片技术研究相关功能基因的表达谱提供便利。
关键词 : 　三丁基锡 杂色鲍 均一化 cDNA文库
Construction of Normalized cDNA L ibrary from Hepatopancreas
of Abalone H a liotis diversicolor supertexta
Exposure to Tr ibutyltin
J ia Xiwei 1, 2 Zhang Zip ing 3 Zou Zhihua 2 W ang Yilei 2
(1 S tate Key Laboratory of M arine Environm ental Science, X iam en University, Environm ental Science Research Center,
X iam en University, X iam en 361005; 2 The Key Laboratory of Science and Technology for Aquaculture and Food Safety,
F isheries College, J im ei University, X iam en 361021; 3 Departm ent of Chem istry and B iochem istry, Texas S tate
University, San M arcos, TX 78666 USA )
　　Abs trac t: 　A normalized cDNA library from hepatopancreas of abalone Haliotis diversicolor supertex ta exposure to Tributyltin was
constructed. Total RNA were p repared using RDP reagent. O ligotex (Q IAGEN ) was used to separate the mRNA from total RNA. The
first strand cDNA was synthesized by transcrip tion of mRNA with the SMART technique. The LD2PCR was performed using a modified
SMART p rimer as the p rimer set, and the first 2strand cDNA as the temp late to synthesize double strand cDNA. Double strand cDNA
was normalized using Dup lex2Specific Nuclease (DSN). The containing capacity of the unamp lified cDNA library was 413 ×106 CFU /
m l with a recombinant rate of 9719%. A total of 3 288 clones were random selected to be sequenced, and 3 048 high quality ESTs were
generated. After p rocessing, a total of 2 473 unigenes comp rising 370 contigs and 2 103 singlets were obtained. The redundancy was
18186%. These results indicate that the normalized cDNA library is suitable to be used for further cloning and analysis of genes related
to tributyltin exposure.
Key wo rds: 　Tributyltin ( TBT) Haliotis d iversicolor supertex ta Normalized cDNA library
收稿日期 : 2009207221
基金项目 :厦门市科技计划项目 (3502Z20055024) ,国家自然科学基金 (20877034) ,集美大学创新团队基金 (2008A001)
作者简介 :贾锡伟 (19772) ,助理研究员 ,主要从事水产动物功能基因组学研究
通讯作者 :王艺磊 , E2mail: ylwang@ jmu. edu. cn　　20世纪 60年代以来 ,由于三丁基锡可以有效 防止污损生物附着而广泛应用于船舶 ,码头及网箱
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2009年第 11期 贾锡伟等 :三丁基锡暴露条件下杂色鲍肝胰腺均一化 cDNA文库的构建
的油漆涂料中。三丁基锡在低浓度下就可以对目标
生物和非目标生物产生毒害作用 ,如性逆转及不
育 [ 1～5 ] ,内分泌干扰 [ 6 ] ,免疫毒性 [ 7～10 ] ,细胞凋亡诱
导 [ 11～13 ]等。虽然世界海事组织于 2003年通过法
令 ,禁止三丁基锡在部分小型船舶上使用 [ 14 ] ,但是
很多发展中国家 ,包括我国对三丁基锡的使用并没
有明确的禁令。在我国 ,无论是在水体环境 ,底泥以
及海产品中都可以检测到三丁基锡的存在 [ 15～17 ]。
杂色鲍 (Haliotis d iversicolor supertexta )是我国南
方沿海重要的经济养殖贝类 ,目前国内对杂色鲍的研
究主要集中在种质资源 [ 18～21 ]及病害 [ 22～24 ]等方面 ,而
对杂色鲍的毒理学 [ 25, 26 ]及相关功能基因的研究较
少。为此 ,本试验构建了三丁基锡诱导的杂色鲍肝胰
腺均一化 cDNA文库 ,该文库对进一步筛选杂色鲍污
染物暴露诱导相关功能基因提供了有力工具。
1　材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1　试验对象 杂色鲍购自福建省东山岛 ,壳长
4165 ±0127 cm ,体重 10107 ±2103 g。在集美大学
海水养殖场暂养 2周 ,每天更换新鲜砂虑海水并喂
食石莼和江蓠 ,鲍密度为 1只 /3 L海水 ,海水温度
为 23～25℃。
1. 1. 2 化学试剂 RNA抽提试剂 RDP由本实验室
自制 [ 27 ] ; oligotex试剂盒购自 Q IAGEN公司 ; CreatorTM
SMARTTM cDNA L ibrary Construction Kit购自 Clontech
公司 ; TR IMMER2D IRECT cDNA Normalization Kit购
自 Innovative公司 ;氯化三丁基锡购自 Sigma公司 ,用
100%乙醇配制成 315g (Sn) /L的母液待用。
11113 引物 引物名称及序列见表 1。
表 1 引物序列
引物名称 序列 (5′→3′) 　　
SMARTⅣ AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCAT2
TACGGCCGGG
CDS 3M AAGCAGTGTATCACGCGAGTGCCAGGCG2
GCCT(17)
5‘PCR p rimer AAGCAGTGGTATCAACGCAG
PCR p rimerM1 AAGCAGTGGTATCAACG
PCR p rimerM2 AAGCAGTGGTATCAACGCAG
M13F GTAAAACGACGGCCAG
M13R CAGGAAACAGCTATGACC
112 方法
11211　三丁基锡暴露试验 在前期试验中 ,经测定 ,
三丁基锡对杂色鲍 96 h半致死浓度为 315μg ( Sn) /
L[ 28 ]。暴露试验采用杂色鲍 96 h半致死浓度的 1 /
10,即 0135μg ( Sn) /L,每天更换新鲜海水和三丁基
锡 ,并喂食石莼和江蓠。分别于暴露试验 2, 6, 24, 48,
96, 192 h后采集杂色鲍肝胰腺置于液氮中速冻 ,并于
- 80℃冰箱中保存备用 ;每个时相取 15只。
11212　总 RNA提取及 mRNA分离 每只鲍取 50～
100 mg肝胰腺组织于 1 m l RDP试剂中充分匀浆 ,
静置 10 m in; 12 000 g离心 10 m in,取上清 ,加入
200μl氯仿 ,充分混匀 ,静置 10 m in; 12 000 g离心
15 m in,取上清 ,加入 500μl异丙醇进行沉淀 ,充分
混匀 ,静置 15 m in; 12 000 g离心 10 m in,弃上清 ,
1 m l 75%乙醇清洗 RNA沉淀 , 7 500 g离心 5 m in,
重复清洗一次 ;最后于 1 m l 100%乙醇中 - 80℃保
存。取等量各时相总 RNA混合 ,用 oligotex试剂盒
分离 mRNA。
11213 双链 cDNA的合成 　取 015μg mRNA ,分
别加入 1μl SMARTⅣ引物 (10μM )和 CDS III引物
(10μM ) ,加水至总体积 5μl, 72℃变性 2 m in,冰浴
2 m in;在 Superscrip tⅡ逆转录酶作用下 , 42℃ 2 h,合
成 cDNA第一链。取 cDNA第一链 2μl,加入 80μl
去离子水 , 10μl 10 ×Advantage 2 PCR Buffer, 2μl
50 × dNTP M ix, 4 μl 5′PCR Primer, 2 μl 50 ×
Advantage 2 Polymerase M ix,用长距离 PCR的方法
合成 cDNA第二条链。
11214 cDNA均一化 取 4 μl纯化后的 cDNA
加入 4μl杂交缓冲液 ,加水至 16μl, 98℃变性 2
m in, 68℃杂交 5 h,加入适量 D SN 酶及缓冲液处
理 20 m in,加入 10μl终止缓冲液完成 cDNA均一
化。
11215 均一化文库构建 分别以 PCR p rimer M1
和 PCR p rimer M2为引物 ,对均一化后的 cDNA进
行两轮 PCR扩增 ;取 1μg纯化过的 cDNA用 S fi I
核酸内切酶酶切 2 h后割胶纯化大于 500 bp 的
cDNA片段 ;回收的片段与经过 S fi I核酸内切酶处
理过 pDNR2L IB文库载体连接过夜 ;连接产物直接
转化大肠杆菌感受态细胞 ,制成原始文库。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
11216 文库库容测定及质量鉴定 取适量原始文
库进行 10 - 3 , 10 - 6梯度稀释 ,每个梯度设 3个平行 ,
取适量稀释液于 90 mm培养皿中涂布 , 37℃培养过
夜 ,计数培养皿中克隆数目以计算出文库库容 ;随机
挑选 96个单克隆 ,以 M13通用引物 PCR扩增 ,电泳
检测插入片段大小及计算文库重组率。
11217 测序 随机挑选 3 288个克隆送华大基因
进行测序。
2 结果
211 总 RNA提取及 mRNA分离
用 RDP试剂提取的总 RNA经 1%琼脂糖电泳
检测 (图 1) , 18S rRNA和 28S rRNA两条带清晰 ,说
明总 RNA没有降解 ,质量较好 ;经 O ligotex试剂盒
对 mRNA分离纯化后 (图 2) , mRNA在较大范围内
弥散分布 , 28S和 18S rRNA已基本上被去除 , mRNA
大小适于构建文库。
212 双链 cDNA的合成
cDNA第一链经过 18个循环扩增合成双链 ,取
适量 PCR产物电泳检测 ,结果显示双链 cDNA片段
主要分布在 012～4 kb左右 (图 3) ,并有一些清晰
的特异性条带 ,应为高丰度基因。
213 cDNA均一化
DSN酶切后的均一化 cDNA 经过两轮抑制性
PCR扩增后 ,取适量 PCR产物电泳检测 ,与均一化
前相比 ,条带弥散分布更加均匀 ,无特异条带出现
(图 4)。
214 文库库容及质量
经测定 ,文库库容未 413 ×106 CFU /m l;随机挑选
48个克隆 ,以载体特异的 M13正向引物和 M13反向
引物进行 PCR扩增 ,插入片段大小为 015～2 kb (图
5) ,说明该文库质量较好 ,重组率为 9719%。
图 5 48个随机克隆 PCR检测文库质量
215 测序
从文库中随机挑选了 3 288个克隆进行测序 ,
得到 3 048个高质量 EST序列 ,其中有 370条 Con2
tigs, 2 103条 Singlets, Unigenes共 2 473条 ,冗余率
只有 18186%。
3 讨论
近年来 ,应用 SMART( switching mechanism at 5′
end of RNA transcrip t)技术构建全长 cDNA文库 ,从
而筛选和克隆相关功能基因的报道越来越多 ,在水
产动物中 ,应用 SMART技术已经成功构建了多个
物种的全长 cDNA文库 [ 29～32 ]。利用该技术可以有
效避免经典 cDNA文库构建时的一些技术缺陷 ,如
反转录效率低 ,不能有效合成全长 cDNA 第一链 ;
cDNA全长克隆一般表达较弱 ,需多轮筛选才可能
得到全长其序列等 [ 33 ]。本研究中所得到的 cDNA
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2009年第 11期 贾锡伟等 :三丁基锡暴露条件下杂色鲍肝胰腺均一化 cDNA文库的构建
片段主要分布在 500 bp～3 kb,随机测序结果发现
大多数克隆可以找到 polyA尾 ,表明文库构建很成
功 ,为进一步筛选相关功能基因提供了便利。
在真核生物中 ,基因转录水平可以分为高、中、低
3种 ,基因拷贝数可以从几万到几个乃至单拷贝不
等 ,一般来说 ,每个细胞中约表达 10～20个高丰度基
因 (每个基因数千拷贝 ) ,数百个中等丰度基因 (每个
基因数百拷贝 ) ,几千个稀有基因 (每个基因单拷贝
到几十拷贝 ) [34 ]。由此可知 ,从普通 cDNA文库中直
接测序寻找稀有基因非常低效 ,因为高丰度和中等丰
度表达基因将被大量重复测序。均一化 cDNA文库的
构建可以有效避免上述问题 ,通过均一化可以有效减
少高中丰度表达基因的拷贝数 ,降低文库冗余率 ,极大
的提高了通过随机测序方法得到稀有基因的概率。
目前均一化 cDNA文库的构建主要依据以下两
种原理 :一种是基于基因组 DNA在拷贝数上具有相
对均一化的性质 ,通过 cDNA与基因组 DNA饱和杂
交而降低在文库中高拷贝存在的 cDNA的丰度 ;另一
种是基于复性动力学的原理 ,高丰度的 cDNA在退火
条件下复性的速度快 ,而低丰度的 cDNA复性要较长
时间 ,从而可以通过控制复性时间来降低丰度。第一
种方法易于掌握 ,其缺点是采用基因组 DNA饱和杂交
的方法会因为低拷贝的表达基因拷贝数少而无法被杂
交上 [ 35 ] ;而后一种方法的掌握对技术的要求比较高 ,对
多数人而言需要多次摸索才能找到最适条件。
本研究基于 cDNA复性动力学原理 ,进一步采
用双链特异核酸酶 ( dup lex2specific nuclease, DSN )
酶切技术 [ 36 ] ,特异降解在复性过程中的双链 cDNA,
达到均一化目的。该方法更适用于片段较长 cDNA
的均一化 ,其均一化是在 cDNA克隆之前进行 ,而且
不用物理分离单链 DNA和双链 DNA片段 ,因此操
作简便 ;另外 , DSN酶在 55～65℃都有非常好的酶
切活力 ,因此双链 cDNA的酶切可以在较高温度下
进行 ,从而有效降低了由于二级结构的形成和非特
异性杂交引起的转录本缺失。所构建的杂色鲍肝胰
腺均一化 cDNA文库的冗余率仅为 18186% ,大大低
于普通 cDNA文库 [ 37, 38 ] ;与另一种常用的富集稀有
基因的方法差减 cDNA文库构建相比 ,冗余率也相
对较低 [ 39～42 ]。本实验室应用同样方法所构建的两
个均一化 cDNA 文库同样有较低的冗余率 [ 43, 44 ]。
总之 ,本研究所构建的均一化 cDNA 文库的库容
(413 ×106 CFU /m l)和重组率 ( 9719% )都完全符合
文库构建的要求 ,较低的冗余率说明该文库值得继
续使用大规模 ESTs测序的方法寻找相关功能基因 ,
并为进一步使用基因芯片技术研究相关功能基因的
表达谱提供便利。
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现两者的同源性为 87% ,推测这二者编码的蛋白酶
可能是一对同工酶。对获得 EFP cDNA序列分析 ,
认为该序列是一个完整的成熟肽编码框 ,其中 1～
672位核苷酸为成熟肽编码序列 , 673～675位 TAA
是终止密码子 ,共编码 224个氨基酸残基。
该地鳖虫纤溶活性蛋白成熟肽编码序列首先在
大肠杆菌表达系统中进行重组表达 ,结果目的蛋白
大部分以包涵体形式存在 ,且复性后无纤溶活性
(结果未列出 ) ,可能与其未正确糖基化有关 ,遂选
择毕赤酵母表达系统进行重组表达。毕赤酵母是近
年来广泛应用的真核表达系统 ,具有表达效率高、遗
传稳定性好、糖基化适中、表达产物可分泌等多种优
点。已有多种具有纤溶活性的蛋白在该宿主系统中
进行成功表达 [ 6, 7 ]。
地鳖虫纤溶活性蛋白成熟肽编码序列在毕赤酵
母 GS115成功表达 ,且有较高的纤溶活性。作为一
种真核生物 ,毕赤酵母可以进行一系列的翻译后的
修饰 ,如二硫键的形成、蛋白前体的加工 ,以及糖基
化等 [ 8 ]。对 EFP进行糖基化位点在线分析 ( http: / /
www1cbs1dtu1dk / services) ,发现该蛋白含有 6个O2 糖基化位点 ,经 SDS2PAGE电泳分析 , EFP的分子量约为 2812 kD, EFP基因所对应的分子量约为 2416kD ,用大肠杆菌表达的 EFP蛋白除去融合蛋白部分 ,分子量也约为 24 kD (结果未列出 ) ,由于用酵母表达的 EFP能够在糖基化位点上进行正确糖基化 ,所以使表达的蛋白其分子量要比理论上的分子量大 ,这可能也是用大肠杆菌表达重组 EFP无活性而用毕赤酵母表达有活性的原因。参 考 文 献1 李卫星 ,王中枢.生物化学与生物物理学报 , 1989, 21 (4) : 299～306.2 韩雅莉 ,李张伟. 生物工程学报 , 2006, 22 (3) : 230～235.3 Astrup T,Mullertz S. Archs Biochem Biophys, 1952, 40: 346～351.4 W eon2Kyoo You, Young2Doug Sohn, Ki2Yong Kim, et al. Insect B io2chem istry and Molecular B iology, 2004, 34: 239～250.5 Nobuyoshi N,Manabu S, Kohji I. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic, 2003, 23: 191～212.6 Ge T, Sun ZJ, Fu SH, L iang GD. Protein Exp ression and Purifica2tion, 2005, 42 : 20～28.7 Pratap J, Rajamohan G, D ikshit KL. App l M icrobiol B iotechnol,2000, 53 (4) : 469～475.8 Cereghino JL, Cregg JM. FEMS M icrobiol Rev, 2000, 24: 45～66.
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