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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
双向 BN /SDS-PAGE分离鉴定痢疾杆菌福氏
5 型 M90T株毒力相关膜蛋白复合物
龚益熊1 廖翔2 朱力2 吴兰1 周晓巍2 梁龙2 黄培堂2
(1南昌大学食品工程与生命科学学院，南昌 330047;2军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071)
摘 要: 通过蓝色非变性凝胶电泳(BN-PAGE)比较痢疾杆菌福氏 5 型野生株 M90T和大质粒缺失株 M90TΔT的膜蛋白
复合物，发现一个野生株特有的复合物，其分子量约为 290 kD，命名为 M90T-290。通过第二向 SDS-PAGE 分离 M90T-290 得
到 6 个蛋白亚基，质谱鉴定为:一个由大质粒编码的毒力蛋白 Apyrase(ATP-二磷酸水解酶)和 5 个染色体编码的蛋白，这些蛋
白可能以膜复合物的形式影响毒力蛋白 IcsA的单极性分布和痢疾杆菌在细胞间的扩散。这个新发现的毒力相关膜复合物在
痢疾杆菌的致病过程中可能发挥重要作用。
关键词: 痢疾杆菌 蓝色非变性凝胶电泳 膜蛋白复合物 毒力 ATP-二磷酸水解酶
Identification of Virulence-related Membrane Protein Complex from
Shigella flexneri 5a M90T by BN /SDS-PAGE
Gong Yixiong1 Liao Xiang2 Zhu Li2 Wu Lan1 Zhou Xiaowei2 Liang Long2 Huang Peitang2
(1School of Life Sciences and Food Engineering，Nanchang University，Nanchang 330047;
Institute of Biotechnology，Academy of Military Medical Science，Beijing 100071)
Abstract: Virulence-related membrane protein complexes is very important for Shigella’s pathogenesis，such as type III secretion
system． Here we describe an efficient method to isolate membrane protein complexes from S． flexneri 5a wild type strain M90T and its
large plasmid cured mutant M90TΔT． A wild type specific band was found in complexes samples of M90T by Blue Native PAGE(BN-
PAGE)separation and comparison，which is about 290 kD and so named M90T-290． M90T-290 was then dissociated into subunits by
second dimensional SDS-PAGE and identified by MALDI-TOF MS． Six subunit proteins were identified，including a virulence large plas-
mid encoded protein(apyrase)and several chromosome encoded proteins． These proteins may formed a novel membrane complex which
is involved in unipolar distribution of IcsA and intracellular spread of Shigella，and play an important role in pathogenesis of Shigella．
Key words: Shigella flexneri BN-PAGE Membrane protein complexes Virulence Apyrase
收稿日期:2011-03-15
基金项目:国家自然科学基金项目(30970122)
作者简介:龚益熊，男，硕士研究生，研究方向:微生物学;E-mail:gyx7810@ 163． com;
并列第一作者:廖翔，男，博士，助理研究员，研究方向:病原微生物蛋白质组学;E-mail:liaox@ nic． bmi． ac． cn
通讯作者:吴兰，女，博士，副教授，研究方向:微生物学;E-mail:wl690902@ hotmail. com
梁龙，男，博士，研究员，研究方向:病原微生物毒力与进化;E-mail:ll@ nic． bmi． ac． cn
痢疾是全球性人类健康问题的隐患，据 1999 年
的文献显示［1］，每年约有 1. 6 亿人感染痢疾，其中
99%发生于发展中国家。流行病调查结果表明，在
发展中国家，福式痢疾杆菌(S． flexneri)感染占
60%［2］，在我国则占到 70%;因此，福式痢疾杆菌的
基础研究对我国卫生防疫工作显得尤为重要。
痢疾杆菌是一种革兰氏阴性病原菌，通过各种
分泌系统将毒力蛋白分泌到外部环境或者直接注入
宿主细胞。迄今已经发现 I 型到 VI 型共 6 种类型
分泌系统，它们的分泌对象和分泌方式虽然各不相
同，但都是由单个蛋白或者大分子复合物形成一个
跨越细菌细胞膜的通道［3］。由于膜蛋白复合物结
构复杂、疏水性强，难以从疏水的细胞膜脂双层中完
整地分离纯化，因此长期以来对其研究局限于尽可
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
能的将结构蛋白一个个单独进行结构和功能研究，
缺乏整体性。近年来由 Shaegger 和 Wittig 等［4，5］建
立并逐渐成熟的蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
(blue native polyAcrylamide gel electrophoresis，BN-
PAGE)为复合物研究带来新的突破。BN-PAGE 以
非变性聚丙烯酰胺梯度凝胶为介质，由结合于蛋
白复合物的考马斯亮蓝 G-250 提供的负电荷在电
场作用下向阳极迁移，当到达凝胶孔径等于其颗
粒大小时停止移动，从而完成不同大小复合物的
分离。
在痢疾杆菌的进化过程中，毒力大质粒的获得
是痢疾杆菌从非致病性大肠杆菌变为致病菌的第一
步也是最重要的一步。毒力大质粒编码许多侵袭相
关蛋白，例如 III型分泌系统复合物及其分泌的毒力
因子，它的缺失会导致痢疾杆菌毒性的丧失。痢疾
杆菌细胞膜上除 III型分泌系统复合物之外，还有 5
种类型分泌系统复合物未被分离鉴定，还可能有其
他一些完全未知的复合物。本研究拟建立高效的痢
疾杆菌膜蛋白复合物制备方法，并利用 BN /SDS-
PAGE技术比较福氏痢疾杆菌 5 型野生株 M90T 和
其毒力大质粒缺失株 M90TΔT 的膜蛋白复合物，分
离鉴定到一个野生株特有的毒力相关膜蛋白复合
物，鉴定出复合物的组成蛋白亚基包含一个毒力大
质粒编码的蛋白 Apyrase 和几个染色体编码的蛋
白。我们分离和发现的这个毒力相关膜蛋白复合物
为后续结构和功能研究奠定了良好的基础，并为药
物及疫苗研究提供新的靶标和思路。
1 材料与方法
1. 1 材料
福氏志贺菌 5 型野生株 M90T和毒力大质粒缺
失株 M90TΔT(军事医学科学院生物工程研究所王
恒樑实验室) ;TSA(胰蛋白酶黄豆琼脂)和 TSB(胰
蛋白酶黄豆肉汤)购自 Becton Dickinson 公司;丙烯
酰胺甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、甘油、乙二胺四乙
酸四钠盐、TEMED、硫酸铵购自 Merck 公司;磷酸盐
缓冲液、溶菌酶、硫代硫酸钠、甘氨酸、SDS、考马斯
亮蓝 G-250、Tris、Bis-tris、Tricine 购自 Amresco 公
司;毛地黄皂苷购自 Apollo;Triton X-100 购自 Sig-
ma;核酸酶(DNaseⅠ)购自 Promega 公司;蛋白酶抑
制剂混合片剂购自 Roche 公司;高分子量蛋白标志
物(货号 17044501)、2-D Quant kit、SG-100 梯度混合
仪和蠕动泵购自 GE公司;ProteanTMⅡXi 型电泳仪、
电泳槽购自 Bio-Rad;冰乙酸、无水甲醇、正丁醇为国
产分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 膜蛋白复合物的制备 用 200 mL TSB培养
基 37℃振荡培养 M90T和 M90TΔT至 OD600 = 1. 0 －
1. 5，5 000 × g 4℃离心 10 min 收集菌体。以 5 mL
20%蔗糖重悬菌体，然后依次加入 0. 5 mL 1 mol /L
Tris-HCl pH8. 0、20 μL 0. 5 mol /L EDTA pH8. 0、1 /2
片蛋白酶抑制剂和 40 mg 溶菌酶，37℃温育 2 h 制
备成原生质体。12 000 × g 4℃离心 10 min，弃上清，
以 1 mL 20% 蔗糖重悬原生质体，然后快速加入
50 mL 水低渗裂解原生质体，再加入 0. 5 mL 1 mol /L
MgCl2、1 /4 片蛋白酶抑制剂、10 ku DNase I，冰浴
30 min以消化核酸;12 000 × g 4℃离心 10 min 收集
破裂菌体沉淀，用 50 mL 清洗缓冲液(0. 2 mol /L
NaCl，10 mmol /L Tris-HCl pH8. 0)重悬清洗两遍。
最后 4 000 × g 4℃离心 40 min，去除含未破碎菌体
的沉淀，收集含膜碎片的上清。12 000 × g 4℃离
心 60 min沉淀膜碎片;用 200 μL水重悬膜碎片沉
淀，加入 20 μL 2% Triton X-100，冰浴 30 min以溶
解膜碎片中的脂质并释放出游离的蛋白复合物。
20 000 × g 4℃离心 90 min去除不溶性沉淀，收集上
清即为膜蛋白复合物。用 2-D Quit蛋白定量试剂盒
测定样品的蛋白浓度。
1. 2. 2 BN /SDS PAGE分离膜复合物 按 Shaegger
的方法配制各浓度梯度的 BN-PAGE 凝胶［5］。从上
往下灌胶:将一个连有乳胶导管的小尖头插入到玻
璃板上方的缝隙中，乳胶导管通过蠕动泵与梯度混
合仪相连将胶溶液从泵入玻璃板中，用正丁醇封胶;
凝胶聚合约 2 h 后用纯水冲洗干净，再灌入高约
1 cm含上样孔的 5%压缩胶。电泳开始时，在上槽
中加入蓝色阴极电泳缓冲液(15 mmol /L Bis-tris，
50 mmol /L tricine，0. 02% 考马斯亮蓝 G-250) ，下槽
加入阳极电泳缓冲液(50 mmol /L Bis-tris)。恒压
200 V电泳 1 h后，将上槽阴极缓冲液换为不含考马
斯亮蓝的无色阴极电泳缓冲液，400 V 电泳 14 h 结
束。使用胶体考马斯亮蓝染色方法［6］染色过夜，以
水漂洗脱色。
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2011 年第 9 期 龚益熊等:双向 BN /SDS-PAGE分离鉴定痢疾杆菌福氏 5型 M90T株毒力相关膜蛋白复合物
用干净的盖玻片切取 BN-PAGE 凝胶上的目标
条带，放入 1. 5 mL 离心管内，用含 1% DTT 的平衡
缓冲液(50 mmol /L Tris-HCl pH8. 8，6 mol /L 尿素，
30%甘油，2% SDS，痕量溴酚蓝)处理 15 min还原二
硫键，再用含 0. 25% 碘乙酰胺的平衡缓冲液处理
15 min 进行烷基化。然后把处理好的胶块塞入
12. 5% SDS-PAGE 凝胶上样孔，用含溴酚蓝的 1%
琼脂糖封胶。恒压 50 V 电泳 30 min，80V 电泳 2 h
30 min。电泳结束后，使用胶体考马斯亮蓝染色方
法［6］染色过夜，用纯水漂洗脱色。
1. 2. 3 胶内酶切和质谱鉴定 用干净的盖玻片从
SDS-PAGE凝胶上切取目标条带，放入 1. 5 mL 离心
管内，加入 50 μL 脱色液(25 mmol /L 碳酸氢铵 /
50%乙晴) ，室温放置30 min，更换脱色液 2 － 3 次至
胶块无色透明;抽真空干燥直至胶块收缩成白色颗
粒状;加入 3 μL溶于 20 mmol /L碳酸氢铵的胰蛋白
酶(10 ng /μL) ，4℃吸胀 1 h，再加入 3 μL 25 mmol /L
碳酸氢铵溶液，37℃酶切过夜;吸取 1 μL 酶解液到
新的离心管中，送交军事医学科学院仪器分析测试
中心进行 MALDI-TOF质谱鉴定。
2 结果
2. 1 痢疾杆菌膜蛋白复合物样品制备和 BN-PAGE
分离
本试验采用培养至对数中晚期的痢疾杆菌，溶
菌酶处理细胞壁得到原生质体，利用渗透压休克使
细菌充分破裂，通过离心收集膜碎片，经温和的非离
子型变性剂 Triton X-100 溶解得到膜蛋白复合物样
品。整个样品制备过程条件温和，并且全程使用蛋
白酶抑制剂，保证最后得到的复合物结构完整，不会
被降解或者解离。
我们尝试了不同浓度梯度的 BN-PAGE 对膜蛋
白复合物进行分离比较，最后在 10% － 15% BN-
PAGE上发现一个痢疾杆菌野生株 M90T才有、大质
粒缺失株没有的复合物条带(图 1)。通过与非变性
高分子量标志物比较，这个条带的分子量约为
290 kD，于是暂时将之命名为 M90T-290。
2. 2 膜蛋白复合物 M90T-290 的 SDS-PAGE 和组
成蛋白的质谱鉴定
为了鉴定膜蛋白复合物 M90T-290 的蛋白组还
原和乙酰化处理后，塞入 12. 5% SDS-PAGE 凝胶的
上样孔，电泳分离后进行考马斯亮蓝染色;将凝胶上
所有的条带分别切取下来进行胶内酶切，质谱鉴定
出各个条带所含的复合物组成蛋白(图 2)。其中
Apyrase是由毒力大质粒基因 phoN2 编码的蛋白，而
且它影响毒力蛋白 IcsA的功能;另外几个是染色体
编码蛋白，其中 DnaK也与 IcsA的功能有关。因此，
M90T-290 可能是一个新发现的毒力相关膜蛋白复
合物。
箭头所指的是 M90T 特有的复合物条带 M90T-290;M．
分子量标准;1．从痢疾杆菌野生株 M90T 制备的膜蛋白
复合物样品;2．从痢疾杆菌大质粒缺失株 M90TΔT制备
的膜蛋白复合物样品
图 1 BN-PAGE分离发现野生株M90T特有的
膜蛋白复合物M90T-290
3 讨论
整个样品制备过程要尽量在冰浴中进行，并且
全程使用蛋白酶抑制剂，以确保膜蛋白不被降解。
同时要尽量用温和的方法裂解细菌，以保持复合物
结构的完整。用含 SDS 的缓冲液裂解细菌绝对不
可取，那将导致复合物彻底变性解离。常用的细菌
裂解方法有反复冻融、机械研磨和原生质体裂解;前
两者共同的缺点是效率不高，而且过度的机械作用
力有可能破坏复合物结构。本试验在含 20%蔗糖
的高渗溶液中用溶菌酶消化细胞壁，制备得到高度
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M．分子量标准;1． M90T-290
图 2 SDS-PAGE分离与质谱鉴定出膜蛋白
复合物M90T-290 的组成蛋白
收缩的原生质体，然后迅速加入大量的低渗溶液，利
用渗透压的瞬间剧变导致原生质体崩解，释放出细胞
质和细胞膜碎片;通过数次清洗和分级离心可以得到
高纯度的细胞膜碎片。该方法对革兰氏阴性菌的裂
解效率高达 90%以上，而且不会对复合物造成机械
或者化学损害。膜蛋白复合物存在于细胞膜碎片中，
为构成细胞膜主体的脂双层所包围。如何选择合适
的非离子型温和去污剂溶解脂双层，释放出游离的膜
蛋白复合物，是样品制备的关键。不同细胞对各种去
污剂的敏感性不同，需要预试验找到适合特定细胞的
去污剂。没有通用的最佳选择。我们比较了 3种常用
于提取膜蛋白复合物的非离子型去污剂 Triton X-100、
正十二烷基麦芽糖苷(DDM)和洋地黄皂苷(digiton-
in)。发现对本试验的痢疾杆菌细胞膜而言，digitonin
的溶解效果较差，Triton X-100 和 DDM的溶解效果都
很好。同样的性能，Triton X-100 的价格比 DDM低得
多，因此我们选用 Triton X-100溶解膜碎片。
BN-PAGE是聚丙烯酰胺浓度梯度胶，随着浓度
从低到高，凝胶孔径由大变小;复合物根据颗粒大小
聚焦于对应的凝胶浓度位置实现分离。低浓度胶适
合分离大分子量复合物，高浓度胶适合分离小分子
量复合物。同样长度的凝胶，浓度梯度范围越大就
能分离的分子量范围就越宽，分辨率则越低(分子
量接近的复合物因靠近重叠无法区分)。为了兼顾
分离范围尽量考察所有的复合物和足够的分辨率，
我们采用两块重叠的窄梯度凝胶，如 8% － 12%和
10% －15%组合，其分离效果比 8% － 15%凝胶效
果好得多。本试验正是从 10% － 15%的凝胶中发
现一个野生株 M90T特有的复合物条带。
本试验从野生株 M90T特有的复合物条带中鉴
定出 6 个组成蛋白。其中 Apyrase 是由毒力大质粒
基因 phoN2 编码的蛋白，具有酸性磷酸酶活性［7，8］。
有研究表明 Apyrase是毒力蛋白 IcsA的极性分布和
细菌跨细胞传递所必需的［9］;这些功能与其磷酸酶
活性无关，具体机制未知。DnaK是染色体编码的分
子伴侣，属于热激活蛋白(Hsp)家族成员［10，11］，最近
有研究表明它也是 IcsA 的极性分布所必需的［12］。
ClpB也是染色体编码的分子伴侣，它与 DnaK 以协
同的方式实现对蛋白聚合体的解聚［13］。综合我们
的试验结果和文献报道，Apyrase、DnaK 和 ClpB 很
可能以复合物的形式共同调控 IcsA的分布和功能。
下一步将验证复合物组成蛋白之间的相互作用关
系，并考察它们对 IcsA 功能以及细菌毒力的影响。
这些研究将加深我们对痢疾杆菌致病机理的了解，
为药物和疫苗研究提供新的思路。
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(下转第 180 页)
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
种方法的对照试验，一种是针刺后接入 1 /2MS 的播
种培养基，另一种就是针刺后直接接入营养土中。
通过观察可以发现，经过培养基培养再移栽到温室
中的针刺苗，生长情况要好于直接接入营养土中的
针刺苗。这可能是因为在培养基中，各种植物生长
所需要的元素配比都比较均衡，培养的条件也是植
物生长的最优条件，更容易促进雪柑苗的形态建成。
这样对于以 PMI基因为选择标记的转化来说，可能
对雪柑苗前期的 PCR检测比较有利。但同样也增
加了试验的成本和时间。如果在检测中不需要无菌
操作，可以直接将针刺苗接入培养土中，使其操作更
简单、快捷。
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(责任编辑 马鑫
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