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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(7):214-219
收稿日期 ： 2014-11-03
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31160193），云南省教育厅科学研究基金项目（2010Y398），云南省应用基础研究面上项目（2010ZC055 ；
2012FB135）
作者简介 ：冯梦蝶，女，硕士研究生，研究方向 ：病原微生物 ；E-mail ：fengmengdier@163.com
通讯作者 ：曾韦锟，男，博士，研究方向 ：病原微生物 ；E-mail ：zengweikun@gmail.com
LSPA1 早期基因 gp22 细菌双杂交诱饵载体与
筛选文库的建立
冯梦蝶1 毛普加1 洪愉2 许泽仰1 赵继华2 杨洪文2 宋武战2
黄芬1 井申荣1 曾韦锟1，3
（1. 昆明理工大学医学院，昆明 650500 ；2. 成都军区昆明总医院核医学科，昆明 650032 ；3. 昆明学院 医学院临床检验教研室，
昆明 650214）
摘 要 ： 构建细菌双杂交系统中的诱饵载体 pKT25-gp22 和甲型副伤寒沙门氏菌基因文库以便后续的筛选实验。PCR 扩增
获得 gp22 基因，插入 pKT25 构成诱饵质粒 pKT25-gp22。提取甲型副伤寒沙门氏菌基因组 DNA，经 Sau3A Ⅰ部分酶切后连接到
pUT18C 质粒的 BamH Ⅰ位点，获得基因组 DNA 表达文库。用化转的方法将诱饵质粒与 pUT18C 共转入 BTH101，检测诱饵质粒自
激活作用，并检测诱饵蛋白对宿主菌的毒性。将文库质粒电转至 JM109 感受态，PCR 鉴定文库的多样性。诱饵载体 pKT25-gp22 无
自激活报告基因的能力且对细菌的生长无毒性。所构建的副甲基因组文库覆盖基因组达 8 倍，满足文库筛选需要。成功构建细菌
双杂交系统中诱饵载体 pKT25-gp22，筛选文库质量良好，可应用于细菌双杂交实验。
关键词 ： 细菌双杂交 ；诱饵载体 ；基因组文库 ；早期基因 ；甲型副伤寒沙门氏菌
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.033
Construction of LSPA1 Early Gene gp22 Bacterial Two-hybrid Bait
Vector and Screening Library
Feng Mengdie1 Mao Pujia1 Hong Yu2 Xu Zeyang1 Zhao Jihua2 Yang Hongwen2 Song Wuzhan2
Huang Fen1 Jing Shenrong1 Zeng Weikun1，3
（1. Medical Faculty，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500 ；2. Department of Nuclear Medicine，Kunming
General Hospital of Chengdu Military Command，Kunming 650032 ；3. Department of Clinical Laboratory of Medical Faculty，Kunming
University，Kunming 650214）
Abstract: This study aims to construct a bait vector pKT25-gp22 and the gene library of Salmonella paratyphi A in bacterial two-hybrid
system for further screening study. The gp22 gene was obtained by PCR amplification and then cloned into pKT25 to constitute the bait plasmid
pKT25-gp22. The genomic DNA of S. paratyphi A was extracted and partially digested with Sau3A Ⅰ . The fragments between 250 to1 500 bp
were re-natured and ligated to BamH Ⅰ site of pUT18C plasmid, and the genomic DNA library was obtained. The bait plasmid pKT25-gp22
and pUT18C were co-transformed to BTH101, and the self-activation of bait plasmid pKT25-gp22 and the toxicity of bait protein to the host
bacteria were detected. The library plasmids were transformed to JM109 competence and the library diversity was identified by PCR. The results
revealed that the bait vector was successfully constructed without self-activation of the transcription of reporter gene and non-toxic to the growth
of bacteria. The genomic library covering 8 times of S. paratyphi A genome met the requirements of screening. In conclusion, the bait plasmid
pKT25-gp22 and the genomic DNA library of S. paratyphi A were successfully constructed, which can be utilized in bacterial two-hybrid study.
Key words: bacterial two-hybrid system ；bait vector ；genomic library ；early gene ；Salmonella paratyphi A
2015,31(7) 215冯梦蝶等 ：LSPA1 早期基因 gp22 细菌双杂交诱饵载体与筛选文库的建立
甲型副伤寒沙门菌（副甲）是人兽共患病甲型
副伤寒的致病菌。全球每年约有 2 165 万人感染伤
寒或副伤寒菌，造成 21.5 万人死亡，其中每 4 例中
就有 1 例是由甲型副伤寒沙门菌引起的［1］。在医疗
环境恶劣、食品和水不安全的东南亚和中南亚，尤
其在儿童和青少年人群中，副伤寒仍然是引起疾病
和死亡的重要原因［2］。
噬菌体是生物圈中最多的微生物，对微生态环
境和宿主菌进化有重要的影响［3］。噬菌体作为特异
性细菌病毒，尤其是在病原菌的治疗和诊断方面越
来越受到重视［4］。噬菌体侵染细菌后，噬菌体与宿
主间存在广泛的相互作用，但具体是噬菌体的哪个
基因发挥作用，目前对这方面的研究甚少。
噬菌体 LSPA1 是本实验室前期分离的甲型副伤
寒沙门菌烈性噬菌体［5］，该噬菌体基因组注释提示
gp22 基因是噬菌体的早期基因之一，而早期基因往
往在噬菌体感染细菌过程中起着至关重要的作用［6］。
因此，本实验拟选取 LPSA1 早期基因 gp22 构建细
菌双杂交诱饵载体，通过 Sau3AI 酶切甲型副伤寒沙
门菌基因组，构建甲型副伤寒沙门菌基因文库，通
过文库鉴定及诱饵自激活等验证该细菌双杂交系统
可行性，旨为进一步利用该系统探索噬菌体与宿主
相互作用、更深入研究其生命活动奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与载体 副甲 CMCC50973、甲型副伤寒
沙门氏菌噬菌体 LSPA1、大肠杆菌 JM109 为昆明理
工的大学基因工程与制药实验室保存。载体 pBR-
gp22 由昆明理工大学基因工程与制药实验室构建并
保存。细菌双杂交系统购自 Uromedex 公司，其中
BTH101 ：F-，cya-99，araD139，galE15，galK16，
rpsL1，hsdR2，mcrA1，mcrB1，为细菌双杂交的宿
主菌，链霉素抗性。pKT25 包含 T25 基因片段，该
片段编码 CyaA 1-224 氨基酸，用于构建诱饵质粒
的载体（图 1），pUT18C 包含 T18 基因片段，编码
CyaA 225-399 氨基酸，用于构建文库质粒（图 2）。
pKT25-zip 和 pUT18C-zip 为阳性对照质粒，分别编
码 T25-zip 和 T18-zip 融 合 蛋 白， 在 pKT25-zip 和
pUT18C-zip 共转入宿主菌时 BTH101 时，恢复 Cya+。
1.1.2 工具酶与主要试剂 限制性内切酶（Pst Ⅰ、
Xho Ⅰ ）、DNAmarker DL2000、DNAmarker DL5000、
T4 DNA 连接酶、pMD18-T，均购自宝生物工程（大连）
有限公司。质粒 DNA 小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶
回收试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公
司。RNaseA 购自生工生物工程（上海）股份有限公
司。蛋白酶 K 购自 Fermentas 公司。TaqDNA 聚合酶
I 购自天根生化科技（北京）有限公司。LB 培养基：
酵母粉 5 g，胰蛋白胨 10 g，NaCl 10 g，定容至 1 L（固
体加 2％的琼脂）。IPTG、X-gal、卡那霉素、氨苄青
霉素、链霉素均购自生工生物工程（上海）股份有
限公司。实验所用引物见表 1，由上海捷瑞生物工
程有限公司合成。
T25plac
Pst I Sal I*
Xba I
BamH I
Sma I Kpn I EcoR I
pKT25 3442 bp
MCS Ori p15AKanR
..T25 orf.. GCT
... A A G S L E D P R V P K stopT
GCA GGG TCGACT CTA GAG GAT CCC CGG GTA CCTAAG CTATAA AGAATT C....
图 1 pKT25 图谱
图 2 pUT18C 图谱
T18plac
Pst I
Sal I
Xba I
BamH I
Sma I
Kpn I
pUT18C 3017 bp
MCS Ori Col E1AmpR
..T18 ...CAC TGC
... H C R S L E D P R V P S S N S S I stopT
AGG TCG ACT CTA GAG GAT CCC CGG CCGGTA AGC TCG AAT ATATCGTCA TAA CTA AGT AAT...
Sac I
EcoR I
Cla I
表 1 引物
引物名称 引物序列（5-3） 酶切位点
1 ：gp22-F1-2 aaactgcagggacaaataaatacaac
cgcacaatg
Pst Ⅰ
2 ：gp22-R1 ctagtctagattactcatcaatattgcttc
ggtatt
Xba Ⅰ
3 ：cexu-F（for pKT25） gtgaccagcggcgattcg 无
4 ：cexu-R（for pKT25） gttgggtaacgccagggttt 无
5 ：cexu-F（for pUT18C） gtcacccggattgcggcg 无
6 ：cexu-R（for pUT18C） ggctggcttaactatgcggc 无
注 ：下划线为酶切位点
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7216
1.2 方法
1.2.1 副甲噬菌体早期基因 gp22 扩增 以副甲噬
菌体 LSPA1 基因组为模板，使用引物 1 和引物 2 扩
增目的片段 gp22。PCR 参数 ：94℃预变性 5 min ；
94℃变性 30 s ；55℃复性 30 s、72℃延伸 30 s，循
环 35 次 ；72℃总延伸 5 min。采用 1.5% 琼脂糖凝胶
电泳检测 PCR 产物，小量琼脂糖凝胶试剂盒纯化目
的片段。T-A 克隆至 pMD18-T，获得 pMD18T-gp22，
用 Pst Ⅰ和 Xba Ⅰ双酶切鉴定，并送上海生工生物
工程有限公司测序。
1.2.2 诱 饵 载 体 的 构 建 Pst Ⅰ 和 Xba Ⅰ 双 酶 切
pMD18T-gp22 载体回收 gp22 片段，pKT25 载体用相
同酶双酶切，胶回收载体大片段。将两者用 T4 DNA
连接酶连接，转化 E.coli DH5α，kan 抗性平板筛选。
随机挑选平板上长出的单个菌落接种于 LB 液体培
养基过夜培养后提质粒，进行 PCR 和双酶切鉴定。
1.2.3 电转化感受态 JM109 的制备 取出冻存的大
肠杆菌 JM109 接种于 5 mL LB 液体培养基中，37℃
过夜培养。再按 1% 接种量转接至 100 mL 新鲜的
LB 液体培养基中，37℃振荡培养至 OD595 为 0.6。将
100 mL 培养物分装至 50 mL 离心管中，4℃ 6 000×g
离心 7 min 收集菌体。菌体用 50 mL 预冷的去离子
水重悬后收集菌体，重复上述步骤 3 次后，菌体
用 500 μL 预冷的 10% 甘油重悬后分装，每支 50 μL
于 -80℃保存。
1.2.4 基 因 组 文 库 的 构 建 与 鉴 定 将 含 有 质 粒
pUT18C 的 大 肠 杆 菌 JM109 接 种 于 含 有 100 μg/mL
Amp+ 的 LB 液 体 培 养 基 中，37℃ 振 荡 培 养 过 夜，
按 照 质 粒 提 取 试 剂 盒 提 取 质 粒。pUT18C 载 体 用
BamH Ⅰ酶切、去磷酸化，凝胶电泳回收。对副甲
基因组的提取及最佳酶切条件的摸索，并在最佳酶
切条件下大量酶切并回收 250-1 500 bp 片段［7］。采
用 T4 DNA 连接酶将去磷酸化的载体与副甲噬菌体
基因组随机片段按摩尔比为 1∶4 的比例 16℃连接
过夜，产物电转化 JM109 感受态中，涂布于 Amp
抗性平板筛选得到重组克隆，构成文库质粒。随机
挑选 20 个菌落，以引物 5 和引物 6 进行 PCR 扩增
DNA 片段，鉴定插入片段的大小与分布。PCR 反应
参数 ：94℃预变性 10 min ；94℃变性 30 s ；55℃复
性 30 s、72℃延伸 90 s，循环 35 次 ；72℃总延伸 10
min。将 PCR 产物在 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳，用凝
胶成像仪分析。
1.2.5 重组诱饵载体的毒性鉴定 取鉴定正确的诱
饵质粒 pKT25-gp22 及空载质粒 pKT25 菌液，稀释
后涂布卡那霉素（50 μg/mL）抗性平板，37℃培养
12 h 后，观察两个平板上菌落的大小及外观 ；选取
大小相近的两种菌的单克隆于 LB 培养基中，37℃
培养，每隔 30 min 取 300 μL 菌液，以新鲜的 LB 培
养基为空白对照，测定 OD595，绘制生长曲线，评定
重组诱饵质粒表达产物对细菌细胞生长有无毒性。
1.2.6 细菌双杂交中诱饵质粒的自激活检验 取诱
饵质粒 pKT25-gp22、pKT25-gp22 与空载 pUT18C 分
别转化至宿主菌 BTH101，转化产物涂布于含 100
μg/mL 氨苄青霉素、50 μg/mL 卡那霉素、40 μg /mL
X-gal、0.5 mmol/L IPTG、100 μg/mL 链霉素的 LB 平
板上，30℃培养 24-72 h。以 pKT25-zip 与 pUT18C-
zip 共转至 BTH101 作为阳性对照检验诱饵蛋白是否
具有自激活现象。
2 结果
2.1 gp22扩增及亚克隆构建
利用设计的 PCR 引物 1、2，以副甲噬菌体基
因组为模板进行 PCR 扩增，扩增产物经 1.5% 琼脂
糖凝胶电泳检测，大小约为 231 bp（图 3），其 TA
克隆质粒经 Pst Ⅰ和 Xba Ⅰ酶切能切出约 231 bp 目
的片段。重组质粒测序结果提示插入片段与原始序
列一致。
2000
1 M1
1000
750
500
250
100
2000
3000
5000
2 3 M2
1000
1500
750
500
250
100
（A）1 ：PCR 扩增 gp22 ；M1 ：DNAmarker DL2000 ；（B）2 ：原质粒 pMD18-
T-gp22 ；3 ：Pst Ⅰ /Xba Ⅰ双切鉴定 pMD18-T-gp22 ；M2 ：DNAmarker DL5000
图 3 PCR 扩增目的基因 gp22 及亚克隆载体酶切鉴定
2015,31(7) 217冯梦蝶等 ：LSPA1 早期基因 gp22 细菌双杂交诱饵载体与筛选文库的建立
2.2 诱饵质粒的构建与鉴定
从鉴定正确的亚克隆载体上 PstⅠ和 XbaⅠ双酶
切回收 gp22 后插入 pKT25 质粒的 PstⅠ/XbaⅠ位点，
转化 JM109 感受态，得到重组质粒，PCR 及双酶
切鉴定均有相应大小的目的条带出现，结果如图 4
所示。
2.4 诱饵质粒毒性检测
以 pKT25/BTH101 细 菌 为 对 照，pKT25-gp22/
BTH101 细菌为实验组进行诱饵质粒毒性检测。结果
表明，实验组和对照组中菌落数及菌落大小均无明
显差异且菌落外观无差异。分别挑选 1 个单克隆测
定其生长曲线，结果如图 6 所示，两种菌的生长曲
线大致相同，说明重组质粒 pKT25-gp22 表达产物对
BTH101 无毒性。
2000
M1 1 M2 2 3
1000
750
500
250
100
2000
3000
5000
1000
1500
750
500
250
100
M1 ：DNAmarker DL2000 ；1 ：PCR 鉴定重组子 ；M2 ：DNA marker DL5000 ；
2 ：原质粒 pKT25-gp22 ；3 ：PstⅠ/XbaⅠ双切鉴定 pKT25-gp22
图 4 诱饵载体 pKT25-gp22 的鉴定
2.3 副甲基因文库的构建与初步鉴定
在最佳酶切条件下大量酶切基因组，回收 250-
1 500 bp 片段与 BamH Ⅰ酶切并去磷酸化的 pUT18C
载体连接，转化 JM109，涂布于氨苄青霉素抗性平板，
37℃培养后统计菌落的个数，共获得 3.4×105 个阳
性克隆。选取 20 个阳性克隆，用 pUT18C 质粒多克
隆两侧的测序引物进行菌落 PCR 扩增，扩增产物用
1.5% 琼脂糖电泳，从图 5 中可以看出，20 个阳性克
隆中插入片段达 99%，片段大小随机性良好，集中
在 250-1 500 bp。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M
5000
3000
2000
1500
1000
750
500
250
100
1-20 ：PCR 产物 ；M ：DNAmarker DL5000
图 5 PCR 鉴定基因组文库
1.0
0.8
0.6
pKT25/BTH101
pKT25-gp22/BTH101
0.4
O
D
59
5
0.2
0.0
0 60 120 ᰦ䰤min180 240 300 360 420 480 540
图 6 诱饵质粒对宿主菌毒性的检测（OD595 为 x
-
±s）
2.5 诱饵质粒自激活作用的鉴定
检 测 结 果 如 图 7 所 示，pKT25-gp22 单 转 及
pKT25-gp22+pUT18C 质粒共转至 BTH101，在 LB/X-
gal 平 板 上 菌 落 呈 白 色（ 图 7-A，7-B）， 而 pKT25-
zip+pUT18C-zip 质 粒 共 转 至 BTH101 后 在 LB/X-gal
平板上菌落呈蓝色（图 7-C）。分别在上述 3 个平板
上挑选大小合适的菌落在相同的平板上划线，重复
传代 3 次后，前二者菌落均为白色（图 7-D，7-E），
而后者仍为蓝色（图 7-F）。说明重组诱饵质粒无自
激活作用。
3 讨论
随着抗菌药物在临床的广泛应用，耐药菌在全
球范围内迅速增加。对于严重的沙门氏菌感染，氟
喹诺酮类、三代头孢菌素是唯一可用的抗生素，且
易造成耐药性的发生［8］，因此急需寻找抗生素的替
代物。噬菌体能杀死细菌，但能否作为抗生素替代
物而备受关注，有效侵染宿主菌是噬菌体治疗的关
键［9］。噬菌体侵染并消灭宿主菌是个复杂的过程，
但归根结底是噬菌体蛋白和宿主蛋白之间的相互
作用。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7218
蛋白质与蛋白质之间相互作用的研究方法主要
有噬菌体展示技术、免疫共沉淀、酵母双杂交，还
有在酵母双杂交基础上衍生出的细菌双杂交。细菌
双杂交具有快速、高通量筛选的优点，对于筛选与
已知蛋白相互作用的未知蛋白更为有效［10］。本研究
采用的是腺苷酸环化酶细菌双杂交系统［11］，其原
理如图 8 所示。将 gp22 与 T25 融合，构成诱饵质
粒，将副甲噬菌体基因文库克隆至 pUT18C 质粒（氨
苄青霉素抗性），若有适宜的片段编码的多肽与诱
饵蛋白相互作用，则能催化 ATP 分解成 cAMP 从而
激活 cAMP-CAP 启动子启动，使得下游的报告基因
表达。
提交 GENBANK（GI ：676402673），为了进一步研
究 LSPA1 在侵染细菌早期与宿主菌的相互作用蛋
白，通过分析 LSPA1 基因组和检索相关参考文献分
析［12］，选取噬菌体早期基因 gp22 作为研究对象，
并将其克隆至 pKT25 构建诱饵质粒，以期利用细菌
双杂交技术在构建的宿主甲型副伤寒沙门菌基因文
库筛选相互作用的蛋白。
基因文库的容量是衡量文库质量的重要标准，
文库构建时获得的克隆数越多，代表性就越好，但
同时文库的量大又增加了筛选的难度，因此文库的
容 量 要 适 宜。 按 照 公 式 N=ln（1-P）/ln（1-f）［13］，
其中 N 是转化成功的单克隆数，P 是覆盖率，f 是插
入片段平均长度与基因组总长的比值。副甲基因组
全长为 4 608 196 bp，f 为 1.09×10-4，若要求插入
DNA 片段在文库中出现的概率为 99%，所需转化成
功的菌落数约为 41 442 个，本研究构建文库的克隆
数为 340 000 个，覆盖倍数约为 8.2 倍，达到基因文
库的构建要求。
诱饵质粒和甲型副伤寒沙门菌基因文库的成功
构建，是利用细菌双杂交进行筛选并获取与 gp22 相
互作用分子的关键步骤。此外，某些蛋白质在细菌
中表达时对细菌产生的毒性作用及本身就具备结合
转录激活活性的蛋白质而直接激活报告基因的表达，
这些都使得细菌双杂交的结果不可靠，所以对诱饵
蛋白自激活与毒性作用的验证是必要的，以此排除
假阳性和假阴性相互作用，同时也降低了筛选的工
作量与筛选难度。本研究以转化诱饵质粒、共转诱
饵质粒和空载文库质粒，同时以阳性质粒共转为阳
性对照来检测诱饵表达载体是否具有自激活作用。
结果表明，诱饵质粒无自激活报告基因的作用，保
证了实验的可靠性，为下一步研究噬菌体 LPSA1 侵
染宿主菌的机制奠定基础。
4 结论
本研究利用基因工程技术成功地将来源于甲
型副伤寒沙门氏菌噬菌体 LSPA1 的早期基因 gp22
克隆至 pKT25 构建细菌双杂交的诱饵质粒 pKT25-
gp22，并对诱饵质粒进行了毒性及自激活检测。同时
也成功地构建了甲型副伤寒沙门菌基因文库，可用
于后期筛选。
A B C
D E F
A ：pKT25-gp22/BTH101 ；B ：pKT25-gp22+pUT18C/BTH101 ；C ：pKT25-
zip+pUT18C-zip/BTH101 ；D ：A 图中菌落在 LB/X-gal 划线结果 ；E ：B 图中菌
落在 LB/X-gal 划线结果 ；F ：C 图中菌落在 LB/X-gal 划线结果
图 7 诱饵质粒的自激活检测
AMP
ATP
cAMP
cAMP
+
cAMP cAMP
ATP
On
cAMP-CAP Reporter gene lac, mal, etc... promoterCAP CAP cAMP T25X YT18T25T25 T18T18AD B C
图 8 基于 CyaA 片段功能互补细菌双杂交系统的原理
本研究所用的噬菌体 LSPA1 是由本实验室分
离纯化获得的副甲烈性噬菌体，其基因组序列已
2015,31(7) 219冯梦蝶等 ：LSPA1 早期基因 gp22 细菌双杂交诱饵载体与筛选文库的建立
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（责任编辑 李楠）