全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
B IO TECHNOLO GY　BULL ETIN 2009年第 9期
环介导等温扩增技术原理及其在检测诊断
病原微生物中的应用
焦文强　殷相平　柳纪省
(中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部畜禽病毒学重点开放
实验室 农业部草食动物疫病重点开放实验室 ,兰州 730046)
　　摘 　要 : 　环介导等温扩增技术 ( loop2mediated isothermal amp lification, LAMP)是近年来发展出来的一种核酸扩增技术。
通过设计识别目的片段 6个序列的 4个特异引物 ,整个反应可以在恒温 (60～65℃)条件下 1 h内完成 ,由于采用 4个引物 ,与
传统的核酸扩增技术相比 ,它具有敏感、特异的特点 ;且产物中有大量的副产物 ———白色焦磷酸镁沉淀 ,扩增产物可通过肉眼
观察或浊度计即可判定结果 ;反应不需要精密控温设备和高级复杂的分析仪器 ,对操作人员的熟练度和专业水平要求不高 ,
因此该方法特别适合基层或者实验条件较差的试验室进行病原微生物的快速检测。就其原理及其在病原微生物的检测中的
应用做一综述。
关键词 : 　环介导等温扩增 　原理 　应用
Pr inc iple and Application of Reverse Transcr iption Loop2mediated
Isothermal Amplif ication for Detection of Pa thogen ic m icroorgan ism s
J iao W enqiang　Yin Xiangp ing　L iu J ixing
(S tate Key Laboratory of Veteninary Etiological B iology, Key Laboratory of Anim al V irology of M inistry of Agriculture, Key Laboratory of Grazing
Anim al D iseases of M inistry of Agriculture, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academ y of Agriultural Science, Lanzhou 730046)
　　Abs trac t: 　A new method of gene amp lification called Loop2mediated isothermal amp lification (LAMP) has been developed in re2
cent years. The amp lification could be finished in 60 m in ender isothermal condition at 60～65℃ by emp loying a set of four p rimers rec2
ognizing the target gene. Compared with traditional gene amp lification method such as PCR, RT2PCR, LAMP suggests higher sensitivity,
efficiency and specificity. Meanwhile, a large amount of by2p roduct, pyrophosphatetion , can be p roduced yielding a white p recip itate of
magnesium pyrophosphate in the reaction m icture. The p resence or absence of this white p recip itate allows easy detection of the amp lifi2
cation of target gene, and the amp lification p roduct can also be tested by turbidimeter. Therefore, as LAMP does not require expensive
device , nor does it require skilled workers, LAMP is suitable for the diagnosis of Pathogenic m icroorganism s in clinical. In this article ,
the p rincip le and app lication of LAMP was discussed.
Key wo rds: 　LAMP　Princip le　App lication
收稿日期 : 2009204207
基金项目 :国家“863”计划 (2006AA10AA204)
作者简介 :焦文强 (19822) ,男 ,河南新乡人 ,在读研究生 ,研究方向 :病原分子生物学
通讯作者 :柳纪省 , E2mail: liujixing@ hotmail. com　　目前 ,基于核酸扩增的分子生物学诊断技术如PCR、RT2PCR、实时荧光定量 RT2PCR等在病原微生物的检测以及疫病诊断方面发挥着重大作用 ,但这些方法或者需要精密控温设备和高级复杂的分析仪器 ,或者对操作人员的熟练度和专业水平要求比较高 ,且反应时间长 ,不利于现场样品的检测 ,不利于 在基层推广 ,无法满足简单、快速、准确诊断的要求 ;而疫病的防控和治疗的关键在于对病原微生物的快速、准确、及早的检测并确诊。因此 ,建立一种快速、准确的新型诊断技术对于疫病的诊断就显得尤为重要。
2009年第 9期 　　　　焦文强等 :环介导等温扩增技术原理及其在检测诊断病原微生物中的应用
1　环介导等温扩增技术简介
环介导等温扩增技术是由 NOTOM I等于 2000
年报道的一种新型核酸扩增技术 ,它针对目的基因
的 6个区域设计 4条引物 ,利用一种链置换 DNA聚
合酶 (B st DNA polymerase)在等温 (60～65℃)的条
件下高效、特异、快速的扩增目的基因 [ 1 ]。有报道
称通过设计两条环引物可加快反应速度 ,使反应时
间缩短 1 /3～1 /2[ 2 ] ;扩增结果可直接对扩增副产物
焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断。由于操作简便 ,
反应时间短 ,易于判断结果等 , LAMP在基层疾病诊
断中有着广阔的应用前景。
111　LAMP原理
环介导等温扩增技术是在恒温条件下使用
DNA聚合酶引发的自动链循环取代反应 ,反应可分
为两个部分 :环状扩增起始物的形成以及链置换反
应阶段。
11111　环状扩增起始物的形成 　如图 1所示 ,双
链 DNA在 65℃左右处于动态平衡状态 , LAM P的
一条引物与双链中的一条互链中的靶 DNA结合 ,
通过 DNA聚合酶的链置换活性启动 DNA合成 ,取
代并释放另一条单链 DNA。 F IP ( fordward inner
p rimer)中 F2的 3′端合成与模板 DNA互补的 DNA
链。F3引物与靶 DNA的 F3c部位结合 ,并启动链
置换 DNA合成 ,同时释放 F IP连接的互补链。 F3
引物和模板 DNA合成一条 DNA链 ,然后形成一条
互补的双链 DNA结构。由于 F3引物合成的 DNA
链的置换作用 , F IP结合的互补链被释放出来。同
时由于 F1c和 F1互补 ,这条被释放的单链在 5′端
形成茎环结构。随后 B IP ( backward inner p rimer)
的 3′端与先前合成的 DNA 链退火结合合成互补
DNA链。B3引物通过 DNA聚合酶的活性和 B IP
外部复性从 3′结合 ,从 B IP合成的 DNA被取代并
在 B3引物引发 DNA 合成之前释放形成单链。
B IP结合的互补链在两个末端都形成了茎环结构 ,
看起来像哑铃结构。
11112　链置换反应阶段 　如图 2所示 , F IP与茎环
结构中的单链互补区域复性结合 ,并引发链置换
DNA合成 ,同时释放先前合成的链。由于 B1c和
B1的互补关系 ,这条释放的单链在 3′端形成了茎环
结构。接着 ,从 B1的 3′端开始 , DNA开始使用自己
结构来合成 DNA。由于两端有互补区域 F12F1c和
B12B1c,这条释放的互补链形成哑铃状结构 , B IP同
B2c复性结合并启动链置换 DNA ,释放 B1启动合
成的 DNA链。目的基因被合成为各种不同大小的
片段。这样的循环反应继续进行 ,到最后可以在 1 h
内把目的片段扩增到 109。终产物不仅有目的基因
的几个颠倒的目的基因重复序列的茎环结构 DNA,
还有多个由可颠倒重复的目的片段构成的菜花样
结构 [ 3 ]。
A～H1环状扩增起始物的形成 :起始阶段 ,链置换型 DNA聚合酶帮
助 F IP起始的互补 DNA链的合成 ,外引物 F3取代 F IP的互补链 ,并
在茎环结构的 5′端形成茎环结构
图 1　LAM P原理 (引自 : E iken Chem ica l
Co. L td. Japan)
I2L1采用内部引物的哑铃状茎环结构的指数式扩增。产物由目的序
列交换重复片段组成的不同尺寸的复合物 ,产生了一个菜花样结构
图 2　环状扩增步 　(引自 E iken Chem ica l
Co. L td. Japan, 2005)
15
生物技术通报 B io techno logy　B u lle tin 2009年第 9期
112　扩增结果判定
扩增结果的判定方法有 3种 : ( 1)琼脂糖电泳
后 ,用 EB或 SYBR Green I染色检验 ; (2)产物中加
入 Mg2 + ,肉眼观测副产物焦磷酸镁沉淀 ,产物呈阳
性的反应 ,管内液体浑浊 ; (3)产物中加 SYBR Green
I,肉眼观察颜色反应 ,呈绿色的为阳性反应 [ 4 ]。
2　LAM P在病原微生物诊断中的应用
211　LAMP在细菌诊断中的应用
易海华等 [ 5 ]使用环状引物的 LAM P反应可在
015 h内完成 ,总共分析时间不超过 1h, LAM P检
测技术的灵敏度比经典 PCR技术高 100倍左右 ,
并且具有与实时 PCR (Real2time PCR )技术相同的
特异度。徐芊等 [ 6 ]发现采用 LAM P检测副溶血弧
菌的最佳反应温度是 60℃,反应时间是 60 m in,在
特异性试验中有 14株副溶血弧菌出现 LAM P特有
的阶梯状条带 ,其他 14株没有出现阶梯状条带 ,
说明特异性强 ;灵敏度试验显示基因组 DNA检测
限约为 90 fg。王敏雅等 [ 7 ]在用 LAM P检测沙门菌
invA基因中发现 28种不同血清型的沙门菌 LAMP
都呈阳性 ,血清模拟试验与菌株直接 DNA 提取
LAMP检测结果一致 ,并得出结论 : LAMP能快速、
特异地检测沙门菌 ,且不需要昂贵的仪器 ,适合基层
检验部门使用。
212　LAMP在病毒诊断中的应用
21211　LAMP在诊断人类病毒中的应用 　Motoko
等 [ 8 ]用 LAMP检测麻疹病毒基因族 ,发现 LAMP比
RT2PCR敏感度高 10倍 ,并且得出结论 LAMP适合
在基层使用。Naoko[ 9 ]用 LAMP方法成功地检测出
流行性腮腺炎病毒 ,从而证明流行性腮腺炎病毒的
再感染不是意见偶然发生的事情。Tomoko等 [ 10 ]研
究发现 RT2LAMP检测部分诺罗病毒的敏感性和传
统的 RT2PCR等量 ,但是在检测某些基因型的时候
RT2LAMP的敏感性比 RT2PCR 精确 ,考虑到 RT2
PCR需要 2 d时间才能显示诊断结果 ,而 LAMP仅
需 1 h,所以 LAMP更适合医院等基层单位诊断使
用。Masanobu U [ 11 ]研究发现 ,采用 RT2LAMP检测
呼吸道合胞病毒 A, B ,其敏感性比巢式 RT2PCR、病
毒分离以及酶联免疫检测法稍高 ,结果显示 RT2
LAMP是一种有潜力的 ,并且和巢式 RT2PCR敏感
性相似的诊断方法 ; Hong等 [ 12 ] 采用 LAMP 检测
SARS病毒 ,其敏感性较传统的 RT2PCR高 100倍 ;
Mori等 [ 13 ]用 LAMP检测风疹病毒发现其灵敏度为
30 PFU /011 m l的细胞培养液 ,风疹病毒 9名感染者
的的检验对比中 , RT2PCR和 RT2LAMP的阳性率分
别为 6617%和 7718% ;李启明等 [ 14 ]采用 RT2LAMP
方法成功检验出丙型肝炎病毒 ,并且其灵敏度在理
论上可达到 10个拷贝的 RNA分子。
21212　LAMP在诊断动物病毒中的应用 　秦智锋
等 [ 15 ]采用 LAMP方法成功的扩增出口蹄疫病毒 ,并
且灵敏度与荧光实时 RT2PCR相当 ;李启明等 [ 16 ]采
用 RT2LAMP成功地检测 H5N1 禽流感病毒中的
HA、NA基因 ,且 RT2LAMP与 Real2time PCR结果呈
现很好的一致性 ;侯佳蕾等 [ 17 ]采用 RT2LAMP方法
成功的扩增出 H5亚型禽流感病毒 ( H52A IV ) ; Cho
等 [ 18 ]采用 RT2LAMP成功的扩增出犬瘟热病毒 ,与
RT2PCR方法相比 , RT2LAMP的敏感性和特异性分
别是 100%和 9313% ;陈豪泰等 [ 19 ]运用 LAMP法检
测 86份猪圆环病毒样品 ,检出率为 9615% ,高于
PCR方法 ; Par等 [ 20 ]用 RT2LAMP检测西尼罗河病
毒 ,发现 RT2LAMP敏感性比常规 RT2PCR高十倍。
21213　LAMP在检测水生动物病毒病中的应用 　
Shivappa等 [ 21 ]运用 LAMP检测鲤春血症病毒 ,发现
LAMP 的敏 感 度 和 RT2PCR 稍 高 ; Gunimaladevi
等 [ 22 ]采用 LAMP检测虹鳟鱼中的传染性造血器官
坏死病毒发现 , RT2LAMP和 LAMP的敏感性相似 ,
但是都比巢式 PCR高 10倍 ; Kiatpathomchai等 [ 23 ]等
利用 RT2LAMP检测引起南美白虾致病的桃拉综合
症病毒的敏感性比 RT2PCR 高 10倍 ,但低于套式
PCR方法检测的敏感性。
213　LAMP在检测寄生虫病中的应用
Iseki等 [ 24 ]通过 LAMP针对牛巴贝虫和双芽巴
贝虫的棒状体蛋白 21基因设计了两套引物 ,并设计
了酶切位点 ,两条引物完成了各自的扩增 ,并且通过
后来的酶切予以区分 ,从而建立了多重 LAMP检测
方法 ,其敏感性分别为传统方法的 103 和 105 ; liu
等 [ 25 ]从 011 pg样品中扩增出目的条带 ,从而证明该
试验的敏感性 ,与反向线点杂交技术 ,敏感性和特异
性分别为 6610%和 9714%。
214　LAMP在检测植物病毒中的应用
Fukuta等 [ 26 ]采用 RT2LAMP成功地从感染薯芋
25
2009年第 9期 　　　　焦文强等 :环介导等温扩增技术原理及其在检测诊断病原微生物中的应用
花叶病毒的植物中的树叶和根部检测到日本薯芋花
叶病毒。
3　展望
LAMP法是一种快捷、高效、特异的基因扩增方
法 ,与 PCR和 Real2time PCR相比不需要特殊的仪
器设备和娴熟的试验技能 ,在食品卫生检验、病原微
生物、动物胚胎性别鉴定等方面已经显示其特点 ,其
作为一种快速有效的基因检测方法已经展现出令人
鼓舞的前景。但是 LAMP的高敏感性可能造成假阳
性 ,这可能使 LAMP的应用受到了限制。相信随着
该技术的不断完善 ,该方法定会在基因检测方面定
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