全 文 ：
研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 9期
甘蔗液泡 ATP酶 C亚基基因克隆及序列分析
许志宇1, 2
王俊刚 1
杨本鹏 1
张树珍 1
( 1中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带生物技术重点开放实验室,海口 571101; 2海南大学农学院,海口 570228)


摘
要:
根据筛选文库时获得的 EST序列信息, 利用 RACE技术分离了一个甘蔗 ATP酶 C亚基基因, 命名为 ShVHA
C。
该基因 cDNA全长 1 312 bp, 含有 1 056 bp的完整阅读框架,编码 351个氨基酸。序列比对及结构预测分析表明, ShVHA
C编
码的氨基酸序列与水稻、小麦、苜蓿、绿豆和蓖麻中相应基因氨基酸序列的一致性分别达到 94
10%、93
22%、91
15%、
91
15%和 91
74% , 与水稻一致性最高。在整个二级结构中, 含有 233个

螺旋 ( a lpha he lix), 占 66
38% ; 含有 5个延伸链
( ex tended strand),占 1
42% ;含有 113个无规则卷曲 ( random co il) ,占 32
19%。此蛋白不具有导肽。整个多肽链表现为亲水
性, 没有明显的疏水区域,初步认为甘蔗 ShVHA
C编码蛋白是亲水性蛋白。
关键词:
甘蔗 糖分积累 V
ATPase RACE 序列分析
C loning and Sequence Analysis of Vacuolar ATPase
Subunit C Gene from Saccharum off icinarum L.
Xu Zh iyu
1, 2
W ang Jungang
1
Yang Benpeng
1
Zhang Shuzhen
1
(
1
K ey Laboratory ofM inistry of A griculture for T ropicalB iotechnology, Institute of T ropical Biosciences and B io technology, Chinese
A cademy of T rop icalAgricultural Sciences,H aikou 571101;
2
College of Agriculture,H ainan University,H aikou 570228)


Abstrac:t
Based on EST sequence from an ethphon
induced latex SSH cDNA library ofSaccharum officinarum L. , a fu ll
leng th cD

NA encodingH+
ATPaseC subunit, designated as ShVHA
C, w as cloned from Saccharum off icinarum L. by RACE
PCR, wh ich has a tota l
length of 1 312 bp w ith an open read ing frame( ORF ) of 1 056 bp and encodes 351 am ino ac id residues. The deduced am ino ac id sequence
showed h igh identity of 94
10%, 93
22% , 91
15% , 91
15% and 91
74% to those o fVHA
C fromOry za sativa Japon ica G roup inc lud ing
T riticum aestivum,M edicago truncatula, V igna rad iate, R icinus communis and r ice, and the h ighest consistenting w ith the rice. Throughout
the secondary structure, therew ere 233

helix, accounted for 66
38% , 5 extended strand, accounted for 1
42% , 113 random co i,l accoun

ted fo r 32
19% . Therew as not a lead peptide in this prote in. The entire po lypeptide cha in perform ance hydroph ilic, and therewas no obv i

ous hydrophobic reg ion can be considered. Sugarcane ShVHA
C encoded pro teins w ere hydroph ilic pro teins by pre lim inaring v iew.
Key words:
Saccharum off icinarum L. Accumu lation of suger V
ATPase RACE Sequence analysis
收稿日期: 2010
03
04
基金项目:现代农业产业技术体系建设专项资金 ( nycytx
24),国家自然科学基金 (30560081),中央级公益科研院所基本科研业务费 ( ITBBZD1022) ,农业
部
948
项目 ( 2010
C21 )
作者简介:许志宇,男,硕士研究生,研究方向:甘蔗生物技术; E
m ai:l zorro1102 cn@ 163
com
王俊刚,男,并列第一作者,助理研究员,硕士,研究方向:甘蔗分子克隆; E
m ai:l wangjungang16@ 163
com
通讯作者:张树珍,女,研究员,研究方向:甘蔗细胞工程; E
m ai:l zhangsz@ pub lic
hk
hi
cn
V型氢离子三磷酸腺苷转运酶 ( vacuolar H +

ATPase或 V
ATPase)是一种膜结合初级质子转运
体,在结构上分为两大亚复合体,即膜外周球颈结构
的 V 1和膜内部的 V0, 其中 V 1由 A、B、C、D、E、F、G
和 H亚基组成,主要功能是催化 ATP水解; 而 V0由
a、c、c
、c
、d和 e亚基组成, 主要的功能是跨内膜形
成质子通道 [ 1- 3]。在植物中, V
ATPase广泛分布于
液泡、质膜、高尔基体、内质网和微囊体等内膜系
统上, 在液泡膜上高度富集, 约占液泡膜蛋白的
6
5% - 35
0% [ 4, 5] , 主要功能是催化水解 ATP, 跨
细胞内膜系统建立质子电化学梯度, 为次级转运
提供动力, 推动相关离子和小分子代谢产物进行
跨膜转运 [ 6] , 并通过活性调节和表达调节对逆境
作出响应 [ 7]。
2010年第 9期 许志宇等 :甘蔗液泡 ATP酶 C亚基基因克隆及序列分析
甘蔗 ( Saccharum off icinarum L. )是我国最为重
要的糖料作物和能源作物, 盛产于热带、亚热带地
区,是一种高光效的 C4植物, 其成熟茎节中积累高
浓度蔗糖的机制已经成为了研究的热点。为了研究
影响甘蔗糖分积累的主要因素,构建了甘蔗糖分积
累差异抑制削减文库, 并获得了一批 EST序列, 其
中 NO. 365EST编码的蛋白和其它植物中的 V
AT

Pase C亚基具有较高的同源性。蔗糖进入液泡逆浓
度运输过程需要 ATP提供能量, 而 ATPase活性可
以调节甘蔗液泡蔗糖积累的效率。本研究对该 EST
进行了全基因序列的扩增,并对其 cDNA序列和氨
基酸序列进行了分析, 也对其可能的功能进行了预
测,可作为深入了解其影响蔗糖积累的参考。
1
材料和方法
1
1
植物材料
甘蔗 (Saccharum off icinarum L. )品种新台糖 22
号种植在中国热带农业科学院实验基地, 选取生长
11个月的甘蔗茎杆作为试验材料。
1
2
试剂
E. Z. N. A plant RNA K it购自 OMEGA公司; 3


FullRACE Core SetV er. 2. 0 K it、TA克隆载体 pMD18

T、大肠杆菌 (E scherichia co li )菌株 DH5
感受态、Pfu
DNA聚合酶购自 TaKaRa公司, 5
RACE System for
Rapid Amplificat ion o f cDNA Ends, Version 2
0 K it购
自 Inv itrogen公司、胶回收试剂盒购自 B IOM IGA公
司,其它生化试剂和常规试剂均为超纯和分析纯。
1
3
ShVHA
C基因的克隆
提取甘蔗茎杆 RNA按照 OMEGA公司的 E. Z.
N. A plant RNA K it的说明进行。根据我们实验室获
得的 NO. 365EST设计 3
RACE特异性引物 365outer:
AACATGCGTGAGCTTTATAGACTG, 365inner: ACTG

GCCCCTTACTTCTCAGAGTGCATT分别与 TaKaRa试
剂盒接头引物: outer: TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT,
inner: CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAG 配
对,以巢式 PCR进行 3
端的扩增,具体操作参照 TaKa

Ra公司的 3

FullRACE Core Set Ver. 2
0 K it说明书。
再设计 5
RACE特异性引物 365gsp1: GTCCCAGTTA

CAATAAGG, 365gsp2a: CCCAGTTACAATAAGGACAAC,
365gsp2b: CGTAGATAGTGGTTCAGTGGC, 其中 365gsp2a、
365gsp2b分别与 Introv igen试剂盒接头引物: Aap: GGC

CACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGG IIGGGIIG, AUAP:
GGCCACGCGTCGACTAGTAC配对, 以巢式 PCR进
行 5
端扩增,具体操作参照 Inv itrogen公司的 5
RACE
System for Rap id Amplificat ion of cDNA Ends, Version
2
0 K it说明书进行。分别把 3
和 5
端扩增出的
DNA连接到 pMD18
T载体上进行序列测定。对
所获得的序列和已有的 EST序列进行拼接, 为了
保证分离出的片段来自同一个基因, 在 5
端起始
密码子的上游和 3
端终止密码子的下游分别设计
特异引物 365s: CGATGTACGGGTGGGAGATGCT,
365a: CGGCGGCTAACAAGAGGG
AATG进行全长
cDNA的扩增, 然后将扩增的 DNA片段连接到
pMD18
T载体送上海生工测序, 将测序结果与拼
接结果进行比较分析。
1
4
核酸及氨基酸序列及空间结构分析
用 ORF Finder软件 ( http: / /www. ncb.i nlm.
n ih
gov /gorf /go rf
h tm l)对克隆片段进行翻译, 用
B last软件 ( h ttp: / /www
ncb i
nlm
nih
gov /BLAST / )
进行同源性分析。利用 DNAMAN软件进行系统进
化树构建。在网站 http: / /www
cbs
dtu
dk /serv

ices /S ignalP /进行导肽分析。在 ExPASy用 Pro tScale
程序 ( http: / /www
expasy
org / cg i
bin /protsca le
p l)
进行疏水性分析。利用网络工具 http: / /npsa

pb il
ibcp
fr /cg i
b in /npsa _ automat
p?l page = /
NPSA /npsa_seccons
htm l分析氨基酸序列二级结构
特征。用 ScanProsite软件 ( h ttp: / /www
expasy
ch /
prosite / )分析蛋白质的功能域。
2
结果与分析
2
1
基因的克隆
通过对已有的 NO. 365EST序列进行分析发现,
该序列与其它植物中的 V
ATPase C亚基一致性较
高, 在此基础上设计 RACE引物对基因 3
、5
端进行
扩增,分别获得 800 bp和 300 bp左右片段。测序后
证实: 3
扩增片段 834 bp(图 1
A ), 5
扩增片段 324
bp(图 1
B)。用 ORF Finder软件对克隆片段进行分
析, 获得了一个含有完整阅读框架的 cDNA序列。
又在 5
端起始密码子的上游和 3
端终止密码子的
下游分别设计特异引物, 对基因的全长 cDNA序列
进行扩增验证 (图 1
C ), 测序结果与拼接结果一致,
表明获得了基因的全长 cDNA序列。
83
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 9期
M. DNA m ark er; A
3
端扩增结果; B
5
端扩增结果;
C.编码区扩增结果
图 1 ShVHA
C基因 3
端、5
端及其
编码区的 PCR扩增
2
2
核酸及氨基酸序列的组成成分分析
序列分析结果 (图 2)表明, ShVHA
C基因全长
1 312 bp, 在 3 bp处有起始密码子 ATG,在 1 056 bp
处有终止密码子 TGA。该基因内部含有一个 1 056
bp的开放阅读框, 编码 351个氨基酸, 其编码蛋白
预测等电点 pI为 4
62。
2
3
氨基酸序列的比对及进化树构建
在 GenBank中检索发现, 该序列编码的氨基酸
序列与已经报道的其它高等植物: 水稻 (日本栽培
种 ) [ Oryza sativa ( japon ica cultivar
group ), NP _
001043429
1]、小麦 (Triticum aestivum, ABG23315
1)、
苜蓿 (M ed icago truncatula, ABN08957
1)、绿豆 ( Vigna
rad iata, AC J05375
1)、蓖麻 (R icinus communis XP_
002521559
1) ,微生物: 盘基网柄菌 AX4( D ictyo s

telium d isco ideum AX4 XP_644445
1)、乳酸克鲁维
斯酵母 (K luyveromyces lactis, XP453258)、轮生细胞
粘 菌 ( PN500 Poly sphondy lium pallidum PN 500
EFA 83304
1) , 以及动物: 埃及伊蚊 (A edes aegyp ti
XP_001661299
1)、体虱 ( P ed icu lu s humanus corpo

ris XP _ 002428920
1 )、斑马鱼 ( Danio rerio NP _
955914
1)的 V
ATPase C亚基具有较高的一致性,
其中与水稻、小麦、苜蓿、绿豆和蓖麻的一致性分别
达 到 94
10%、 93
22%、 91
15%、 91
15% 和
91
74%, 与微生物和动物的一致性也在 48%以上。
系统进化分析结果 (图 3)表明, ShVHA
C与水稻、
小麦亲缘关系最近, 与以上植物、动物、微生物 V

ATPase C亚基亲缘关系较高, 可初步判断: 本研究
所克隆的 ShVHA
C是甘蔗液泡 ATPase C亚基。
方框表示起始密码子,下划线和星号表示终止密码子,
下划虚线表示扩增 cDNA的完整编码区所用引物的对
应序列
图 2
甘蔗 VHA
C基因 cDNA序列
和推测的编码区序列
84
2010年第 9期 许志宇等 :甘蔗液泡 ATP酶 C亚基基因克隆及序列分析
图 3
基于 VHA
C蛋白不同物种的进化树分析
2
4
导肽的预测和分析
导肽的预测和分析, 对了解蛋白质的亚细胞定
位与功能作用途径和机制有一定的意义。在 ht

tp: / /www
cbs
dtu
dk /serv ices/SignalP 网站对 Sh

VHA
C编码的氨基酸进行分析的结果 (图 4)表明,
其信号肽分值较低, 无氨基酸残基位点,因此, 此蛋
白可能不存在导肽酶切位点,不具有导肽。
图 4 ShVHA
C蛋白导肽分析
2
5
疏水性的预测和分析
蛋白质疏水性的预测和分析, 是进行蛋白质二
级结构预测以及功能域划分的一个必要过程 [ 8 ]。
用 ProtSca le预测 ShVHA
C编码的氨基酸序列的疏
水性的结果 (图 5)表明, 多肽链的第 235位天冬氨
酸具有最低分值
2
756, 第 113位苏氨酸具有最高
分值 2
544。依据氨基酸分值越低亲水性越强和分
值越高疏水性越强 (参考软件 ProtScale)的规律,可
以看出,在第 235位的亲水性最强,第 113位的疏水
性最强,而就整体来分析, 亲水性氨基酸均匀分布在
整个肽链中,且多于疏水性氨基酸。因此,整个多肽
链表现为亲水性,没有明显的疏水区域,可认为 Sh

VHA
C编码的蛋白是亲水性蛋白。
2
6
氨基酸序列二级结构分析
蛋白质二级结构的预测与分析对其空间结构的
了解有着重要意义。用 http: / /npsa
pbil
ibcp
fr /
cg i
bin /npsa_autom at
p?l page= /NPSA /npsa_secco

ns
h tm l分析 ShVHA
C基因编码的氨基酸二级结构
特征,结果表明, 在整个二级结构中, 含 233个

螺
旋 ( alpha he lix),占 66
38% ;含 5个延伸链 ( ex tended
图 5
ShVHA
C蛋白疏水性分析
strand),占 1
42%; 含 113个无规则卷曲 ( random
co il) ,占 32
19%。
2
7
功能域的预测和分析
在网站 http: / /www
expasy
ch /prosite /分析甘
蔗 ShVHA
C编码的氨基酸序列 (图 6)表明, 预测其
功能域可能含有从第 12- 15、第 36- 39、第 84- 87、
第 130- 133位氨基酸的 EGF _1, 另一个是从第 21
- 23位氨基酸的 2FE2S _FER _1, 还有一个是从第
23- 39、第 26- 43、第 34- 52、第 48- 66位氨基酸
的 VWFC_1,另一个是第 235- 239位氨基酸的 TH I

OLASE_3,最后是第 262 - 275、第 327- 339位氨基
酸的 ANAPHYLATOXIN _1。因此, ShVHA
C蛋白含
有 VHA
C蛋白的主要功能域。
85
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 9期
图 6
VHA
C蛋白功能域分析
3
讨论
甘蔗中蔗糖积累的研究表明, 控制甘蔗茎中蔗
糖高积累的决定因素是存在于发育的茎内部细胞中
蔗糖的跨膜运输能力以及蔗糖糖代谢相关酶活性,
而不是源叶片输出光合产物的能力和韧皮部运输蔗
糖的效率 [ 9] ; 而液泡是甘蔗蔗糖积累的主要细胞
器,决定了甘蔗的品质与质量。蔗糖进入液泡有
H
+
蔗糖反向转运系统介导和易化扩散两种方式。
Echeverria等 [ 10 ]证实甜来檬 ( C itrus limmetio ides )糖
分向液泡的运输是通过易化扩散来完成的, 但是甜
来檬液泡中糖分是以单糖的形式存在而不是蔗糖。
然而 Thom和 Komor[ 11 ]在甘蔗悬浮细胞培养细胞液
泡膜上也已经发现了一种液泡膜 ATP水解酶, 认为
甘蔗蔗糖在液泡的积累过程很可能是通过 H +
蔗糖
反向转运系统介导的。Maeshim a等 [ 12]研究表明,
液泡膜上 H +
ATP水解酶和焦磷酸化酶能维持液泡
内的低 pH,为 H +
蔗糖反向转运系统提供能量。
为了进一步研究甘蔗中蔗糖积累机制, 在先前
的研究中构建了甘蔗蔗糖积累差异抑制削减文库,
并获得一批差异表达的 EST序列,其中 NO
365EST
编码的蛋白和其它植物中的 V
ATPase C亚基具有
较高的同源性。本研究通过扩增该 EST序列所获
得的 ShVHA
C是 H +
ATP酶的 C亚基基因。不同
种属来源的 C亚基之间同源性高达 48% , 甘蔗中
ATPase C亚基居于 V 1的内部,不具有导肽, 是亲水
性蛋白。目前,对于 V
ATPase C亚基在植物中具体
功能还不清楚,但 ATP酶可以水解 ATP为蔗糖逆浓
度运输进入液泡储存提供能量, 维持液泡内 H +浓
度的平衡,使蔗糖在液泡内高浓度的积累得以实现。
因此深入研究液泡 ATP酶各亚基的功能,对于揭示
蔗糖在液泡中的积累有重要意义, 同时对于利用生
物手段改良甘蔗的品质可能有促进作用。
参 考 文 献
[ 1 ] Inoue T, Wang YR, JefferiesKC, et a.l S tructu re and regu lat ion of the
V
ATPases. Jou rnal of B ioenerget ics and B iom em
b ran es, 2005, 37
( 6) : 393
398.
[ 2] JefferiesKC, C ip riano DJ, Forgac M. Function, structu re and regula

tion of the vacuo larH +
ATPases. Arch B iochem B iophys, 2008, 476
( 1) : 33
42.
[ 3] C ip riano DJ, W ang Y, Bond S, et a.l Stru cture and regulation of the
vacuolar ATPases. B ioch im B iophys A cta, 2008, 1777 ( 7
8 ) : 599

604.

[ 4] D ietzK J, Tavakol IN, K luge C, et a.l S ign ifican ce of the V
typ e AT

Pase for the adaptation to stressfu l grow th cond itions and its regula

tion on th e m olecu lar and b iochem ical leve.l J. E xp B io,l 2001, 52
( 363) : 1969
1980.
[ 5] B eyenb ach KW, W ieczorek H. The V
type H + ATPase: m olecu lar
structu re and fun ct ion, physiological roles and regu lation. J Exp B io,l
2006, 209 ( 29) : 577
589.
[ 6] 肖忠意,谭琨岭,胡明瑜, 等.过量表达棉花液泡 H +
ATPase C
亚基基因促进酵母细胞伸长和提高盐胁迫耐受性.遗传, 2008,
30( 4) : 495
500.
[ 7] 朱家红,张全琪,蔡元保,等. 巴西橡胶树液泡 ATP酶 F亚基基
因克隆及表达.西北植物学报, 2009, 29( 6) : 1079
1083.
[ 8] 强毅.植物蔗糖磷酸合成酶的生物信息学分析.现代生物医学进
展, 2007, 7( 4 ): 559.
[ 9 ] UysL, Botha FC, H ofm eyr JHS, et a.l K ineticm odel of sucrose accu

m u lation in m atu ring sugarcan e cu lm tissue. Phytochem istry, 2007,
68( 16
18) : 2375
2392.
[ 10] E cheverria E, Gon zalezPC, B rune A. C haracterizat ion of proton and
sugar transport at the ton op last of sw eet lim e(C itru s limm etioides )
ju ice cells. Phys iol P lan t, 1997, 101 ( 2) : 291
300.
[ 11] Thom M, K om or E. E lectrogen ic p roton tran slocat ion by the ATPase
of sugarcane vacuoles. Plant Physio,l 1985, 77: 329
334.
[ 12] M aesh im aM. Tonop last tran sporters: organ ization and function. An

nu R ev P lant Phys lol P lan tM ol B io,l 2001, 52: 469
497.
86