全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第1期
收稿日期:2007-07-31
基金项目:本工作得到云南省自然科学基金面上项目(批准号:2006c0079M)和西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室的资助
作者简介:刘杰(1982-),女,在读硕士研究生,研究方向:分子生物学
通讯作者:何德,博士,副教授;E-mail:hedexiner@yahoo.com.cn
前言
遗传图谱(geneticlinkagemap)是指通过遗传
重组分析得到的基因或专一的多态性遗传标记
(marker)在染色体上线性排列顺序图,其间的距离
通常用遗传重组值来表示。构建遗传图谱,一是需
要适当的分离群体(作图群体)和家系,二是需要大
量能揭示亲本多态性的遗传标记[1]。利用 DNA标记
构建分子连锁图谱的原理与构建传统遗传图谱一
样,都是以染色体重组与交换为基础,其基本步骤
包括①选择适合作图的 DNA标记;②根据遗传材
料之间的 DNA多态性,选择用于建立作图群体的
亲本组合;③建立具有大量 DNA标记处于分离状
态的分离群体或衍生系;④测定作图群体中不同个
体或株系的标记基因型:⑤对标记基因型数据进行
连锁分析,构建标记连锁图[2~3]。由于分子标记的迅
速发展大大促进了遗传连锁图的构建,至今为止,
已构建了许多植物的高密度分子标记连锁图遗传
图谱已成为植物遗传育种学家的有力工具,利用遗
传图谱可为植物重要经济性状、生物胁迫和非生物
胁迫的基因进行数量性状定位和质量性状定位,为
分子标记辅助选择奠定基础,使植物早期选择成为
可能。而对于林木,由于其自身世代长、高度杂合、
遗传负荷大等遗传特性,致使林木遗传学及遗传图
谱研究工作远远落后于其他植物物种[4]。而构建林
木遗传图谱却是有重要的理论价值和潜在的应用
价值的,特别是分子标记的出现促进了高密度遗传
林木遗传图谱构建的研究进展
刘杰 何德 李永红
(西南林学院,昆明 650224)
摘 要: 高密度分子遗传连锁图谱对分析植物遗传变异、标记目标性状、数量性状定位和分子辅助选择改良性状
均具重要价值。由于林木具有世代长、高度杂合、遗传负荷大等遗传特性,使其遗传图谱研究不同于其他物种,其遗传连
锁图谱的构建相对复杂。目前,一些林木的遗传连锁图谱已经产生。简要综述了林木遗传图谱研究现状和策略,并对构建
高质量林木遗传图谱作了展望。
关键词: 高密度分子遗传连锁图谱 分子标记 数量性状定位和质量性状定位 辅助选择育种 基因克隆
ResearchProgressinConstructionoftheGeneticLinkageMaps
ofForest
LiuJie HeDe LiYonghong
(SouthWesternForestryColege,Kunming650224)
Abstract: Ahighdensitymolecularlinkagemapwilbeputahighvalueonstudiesdesignedtoanalyzegenetic
variation,toidentifyqualitativecharacter,tolocatequantitativecharacterloci,andtoperform marker-asistedselectionin
plants.Duetolonggeneration,highheterozygosityandgeneticloadoftrees,itwasrathercomplicatedtoconstructtheir
geneticlinkagemaps.Atpresent,somegeneticlinkagemapsoftreeshavebeenconstructed.Thispapersummarizedthe
presentconditionsandstrategyinconstructingthegeneticlinkagemapsoftrees,andmakeprospectforconstructingthe
highdensitygeneticmapsoftrees.
Keywords: Highdensitymolecularlinkagemap MolecularmarkersQTLsMAS Genecloning
2008年第1期
图谱的建立和发展,林木分子遗传图谱的研究工作
也随之开展了起来,迄今已有许多树种建立了分子
遗传图谱,使人们可以借助图谱上的分子标记对目
标基因进行定位和分离对林木的抗性等进行早期
测定,并开展分子标记辅助选择育种。因此,林木遗
传图谱的构建已成为当前林木遗传学领域中的一
个热点[1,5]。简要综述了林木遗传图谱研究的现状
和新策略,对构建高质量林木遗传图谱做了展望。
1 林木遗传图谱研究的历史与现状
1.1 初期的林木遗传图谱的构建
林木遗传图谱构建研究最早是从火炬松开始
的[6],1981年 Conlde等使用 43个同工酶标记对 6种
针叶树种进行遗传图谱研究,但是只是对部分基因
组进行了作图[7]。其后,随着分子标记技术的发展
和一些针对林木作图策略的提出,林木的遗传图谱
构建开始取得进展。20世纪 90年代 Lomas等报道
了用白云杉单倍体胚乳,61个 RADP分子标记构
建了第一张含有 47个标记和 12个连锁群的分子
遗传图谱,连锁图长 660cM。随后 Gratapaglia等[8]
报道用拟测交群体构建了桉树的遗传图谱,虽然连
锁图的长度有所增加,标记的位点数也增多,但还
远不够完善,连锁群的数目与林木染色体的数目远
不相符。实际上,初期的所谓林木遗传连锁图只是
一些含有分子标记的遗传连锁片断,标记数目稀
少,连锁图长度也十分有限。
1.2 多种分子标记的高密度遗传图谱的构建
随着实验技术的改进和发展,各种分子标记被
广泛应用于林木遗传图谱构建工作中,主要有
RFLP(限制片段长度多态性),RAPD(随机扩增多
态型 DNA),AFLP(扩增片断长度多态型),SSR(简
单序列重复),STS(序列标记位点)等[9]。在已建立
的遗传连锁图中,RADP是常用的分子标记。其所
用的引物的碱基序列是随机排列的,无需专门设
计,虽然每个引物可检测的 DNA多态性是有限的,
但是可用的引物数量众多,理论上能覆盖整个基因
组;对 DNA质量和数量的要求低,无需事先分析基
因组 DNA序列,也不需要克隆 DNA探针,可以在
没有任何分子生物学研究背景下就可分析 DNA多
态性[10]。这些特点使 RAPD技术的操作比较简单,
实验成本也较低,成为目前在林木遗传图谱构建中
应用最为广泛的一种标记技术[11]。但 RAPD易受各
种实验因素,如模板 DNA、引物、Tag酶、dNTP、Mg+2
浓度,反应温度等影响,导致了它稳定性和重复性
差,这就要求必须通过严格控制反应条件,规范操
作,使反应标准化;此外 RAPD技术是显性标记,不
能区分纯合子和杂合子,而且错配机率较大,导致
假带比例增加,影响扩增结果[10]。于是,那些多态性
丰富、可重复性强、稳定性好的标记(如 AFLP等)
逐渐添加到已有或新构建的遗传连锁图中。
近年来发表的林木遗传连锁图的标记位点数
不断增加,连锁群趋于完整,连锁图对全基因组的
覆盖率增加,标记间的平均距离减少。标记位点数
的增加,这些有利于基因的精细定位。目前用分子
标记构建了毛果杨×美洲黑杨的遗传图[12],标记达
343个,产生了 19个连锁群,覆盖长度是 1527.3cM,
约占杨树基因组总长度的一半;而短叶红豆杉,仅
有 41个,覆盖基因组 305.8cM。欧洲云杉图谱总图
距长度达 3584cM,作图群体是 F1,共产生了 96个
标记,解释了 185个 DNA多态性,分配到 17个连
锁群中,平均图距是 22cM[13]。
1.3 多种作图群体遗传图谱的构建
由于林木的生物学特点使其作图群体与其他
物种有所不同,目前林木的作图群体主要有:单株
树的大配子体(单倍体胚乳群体)、回交二代群体、
拟测交群体、F1群体、F2群体等。例如:(1)针叶树
属裸子植物,其大配子体(胚乳)是单倍体,其分离
和重组交换不受近交和开放家系影响,因此单株树
的大配子体可作为针叶树种的遗传图谱研究群体,
结合分子标记技术可以快速作图,该方法广泛用于
针叶树的遗传图谱构建;(2)许多树种自交不亲和,
因此较难获得多世代作图群体,但是由于长期异
交,使其遗传组成高度杂合,大量的基因位点 F1代
便出现分离,因此 F1群体可用于遗传图谱构建。另
外有一部分树种容易进行无性繁殖,所以 F1群体
可作为永久性群体长期利用;(3)许多林木改良的
材料来自自由授粉的半同胞家系,林木育种学家已
经建立了大量的半同胞子代测定林,也可作为遗传
作图材料,这就拓宽了林木遗传图谱研究的作图群
体来源。扩大作图群体、选择高度保守的标记系统
以及研究适合林木作图的理论和方法将有助于林
刘杰等:林木遗传图谱构建的研究进展 39
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
木基因组研究向纵深发展。
1.4 新型算法应用遗传作图
对于特定的一个杂交组合所构建的作图群体,
其相邻标记的分离类型不是简单的 Aa×Aa,而是
包含了 7种类型,可能的分离比有 1:1:1:1、1:2:
1、3:1和 1:1,有些标记具有完全信息,如 ab×cd
(4个等位基因),而所有显性标记具有不完全信
息,因此使用近交物种的 F2或回交 (“拟测交”策
略)模型无疑将损失大量的遗传信息。如此之多分离
类型的分子标记之间重组值 (recombinationfraction)
和标记顺序的估计是目前林木遗传图谱研究所急
需解决的问题。现在 Wu等在 EM算法的基础上引
入了一种新的算法,可同时对来自异交物种全同胞
家系内 4种不同的标记分离类型之间的重组分数
进行估算[14];并充分考虑到了两个亲本之间的重组差
异,因此能够判断对称交配类型(symmetricalCROSS
type)标记间的连锁相,而传统的算法是假设双亲
具有完全一致的重组率,显然无法做到这一点[15]。
因此该算法在林木等异交物种的遗传作图中将有
广泛的应用前景。
1.5 多个树种进行了遗传图的构建
目前已在几十个树种上构建了遗传图谱,主要
集中在几类重要的经济树种,其中针叶树种主要有
松属、云杉属、落叶松属等树种。阔叶树种主要集中
在杨属和桉属等树种。Tulsieram等[16]于 1992年利
用 RAPD标记和单株树的大配子体构建了白云杉
的分子标记连锁图谱,首次作出了林木的分子标记
连锁图。至今国内外已完成了杨属[17~19]、松属、云杉
属、落叶松属[16,20~22]、桉属[23,24]、花旗松属、杉木属、
红豆杉属、柳杉属、黄杉属、栎属等 10多个属中的
30个树种的遗传连锁图谱的绘制[25]。我国林木遗传
连锁图谱构建相对较晚,但发展较为迅速,目前已
对松属、杉属、桉属以及杨属的多个品种的经济林
木及其他一些果树品种等建立了遗传图谱。但是对
于常绿阔叶林优势树种(例如樟树、楠木等)的遗传
图谱国内外尚未见报道,相信应该会很快开展起来
并得到不断的完善。
2 林木遗传图谱的应用
2.1 数量性状基因位点的定位和分析
林木的许多重要性状是受多基因控制的数量
性状,且易受环境因素的影响。利用传统的数量遗
传学研究方法,不能说明控制数量性状基因的数
目、数量性状基因位点在染色体上的位置和各位点
的贡献大小,以及基因间的相互关系。林木遗传图
谱构建的一个重要方面就是将数量性状分解成多
个 QTL(数量性状位点),再将这些 QTL定位到染
色体的精确位点上,并计算每一 QTL对表型的贡
献率以及各个相对 QTL间的相互作用方式 (如加
性效应、显性效应和隐性效应等)及不同 QTL之间
的互助关系。这不仅可以阐明复杂的多基因控制的
数量性状的遗传基础,而且可以根据 QTL相邻的
分子标记及 QTL对表型的贡献大小,实现对数量
性状的分子标记辅助选择。如:Nelson[26]报道了利用
湿地松遗传图谱进行抗松锈病 QTLs的研究;
Bradshaw等[27]利用232个RFLP标记和111个RAPD
标记,构建杨树的遗传图谱,进行了重要数量性状
(树高、胸径、材积、十形和分枝角)的 QTLs位,还
进一步研究了控制数量性状的多基因数及单基因
的作用效应等。
2.2 基于遗传图谱的基因克隆
克隆基因是分子遗传图谱构建最重要的应用
之一。基于遗传图谱的基因克隆也叫定位克隆
(Positionalcloning),又称图位克隆(Map-basedcloning)。
随着高密度遗传图谱和物理图谱的构建,基因定位
和克隆已成为可能。其过程为首先利用分子遗传图
谱,在目标基因的侧翼得到连锁非常紧密的标记;
然后由这些标记去筛选大片段 DNA文库,鉴定出
与标记有关的克隆,继之以亚克隆和染色体步移
(Chromosomewalking)获得含有目的基因的克隆片
段,最终再辅之以转化和互补测验加以验证。近年
来,运用基于图谱的克隆技术已分离得到了大量的
植物基因,尤其是与抗病有关的基因。林木图位克
隆研究也取得了很大进展,加拿大哥伦比亚大学对
白云杉进行遗传作图,并对抗松树象鼻虫的 QTLs
在遗传连锁群中的位置进行了定位。
2.3 比较基因组研究
比较基因组研究主要是利用相同的 DNA分子
标记在相关物种之间进行遗传或物理作图,比较这
些标记在不同物种基因组中的分布特点,揭示染色
体或染色体片段上的基因及其排列顺序的相同(共
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线性)或相似性(同线性),并由此对相关物种的基
因组结构和起源进化进行分析。比较基因组研究除
了对进化研究领域有重大影响外,还可显著增加各
种植物可供利用的遗传标记的数量,这对遗传研究
较为滞后的植物尤为重要,对林木的研究更有指导
意义。目前,一些生物的基因组全序列测序已经完
成(如拟南芥等),比较基因组研究也随之步入了一
个新的时代,即可直接在 DNA序列水平上对不同
生物基因组进行分析,从而对生物的遗传本质达到
更深刻的了解。
2.4 分子标记辅助选择育种(MAS)
MAS是通过对与目标性状(基因)紧密连锁的
分子标记的检测达到对目标性状的控制。而只有有
了完整的、高密度的遗传图谱,MAS才有可能。MAS
可直接从 DNA水平检测目的基因的有无,不受植
株生长、性状表现与否(如隐性基因的表达问题)的
影响,真实可靠。MAS的优越性主要体现在以下几
个方面:可克服性状基因型鉴定的困难;可克服性
状表现型鉴定的困难;可以在早期进行选择;可以
进行更广泛和强度更大的选择;可进行非破坏性性
状评价和选择;可提高回交育种效率。可见对于林
木这种生长周期长的物种,通过 MAS进行选择育
种是非常有力的[28]。
3 问题与展望
构建遗传连锁图谱是基因克隆的基础,也是遗
传育种工作的前提。图谱质量的高低取决于图谱的
通用性和饱和度。构建连锁图谱的目的是用一定大
小的作图群体进行主基因的定位,其平均间隔要求
在 10～20cM。而用于 QTL定位的连锁图,其标记的
平均间隔要求在 10cM以下。但是林木生长周期
长,且多为异交物种,遗传组成高度杂合,这些都为
林木遗传图谱的构建增加了难度。目前,林木遗传
图谱构建所用的群体一般在 100个单株左右,样本
数目少,这样虽然有的林木遗传图谱标记数达到
1000个以上,但是连锁群中仍包含有大段的间隙
区,饱和度还远远不够;且所用标记中通用性标记
所占比例较少,不利于图谱整合工作的开展。因此
对林木遗传图谱的研究有待进一步深入。
随着分子生物学技术和林木作图统计方法的
发展,基于大规模测序获得的 EST标记和 SNP标
记在图谱中应用越来越广泛。有关林木 BAC文库
的建立,比较基因组学的研究最近才陆续被报道,
这些研究的继续深入将为林木遗传图谱在林木育
种和基因组结构与功能的研究中发挥更大的作用。
更多的林木高密度遗传图谱的不断产生将大大促
进林木遗传育种研究的深入,对目标基因的克隆、
性状改良、新品种的培育等具有重大意义。
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