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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 1期
不同 N端序列长度匍枝根霉
6
脂肪酸
脱氢酶重组子的表达
陆合1 张碧波 2
( 1重庆医科大学微生物教研室,重庆 400016; 2重庆文理学院生命科学系,重庆 402168)


摘
要:
克隆并在酵母中表达两个不同 N段序列长度的匍枝根霉
6
脂肪酸脱氢酶重组子, 其中长序列的重组子
LYRnD6D是从匍枝根霉中克隆的
6
脂肪酸脱氢酶基因, 编码 459个氨基酸, N端序列为 M STLDRQS IFT IKELESISQR IHDG

DEEAMKFIII;短序列重组子 SYRnD6D是预测的匍枝根霉
6
脂肪酸脱氢酶基因的 ORF序列, N端序列为 MKFIIIDKKVY,编
码 430个氨基酸;两个重组子均具有
6
脂肪酸脱氢酶保守的组氨酸序列和 HPGG序列,长序列的 N端比短序列长 29个氨基
酸残基 ( MSTLDRQSIFT IKELESISQRIHDGDE
EA)。两个重组子在缺陷型酵母中均得到了的表达,产生了

亚麻酸。利用酶的
相对活力比较两个重组子在同一温度下的稳定性,长序列重组子的酶在 15
下反应 4 h后相对活力仍有 74% ,而短序列酶的
相对活力只有 43% , 所以长序列重组子酶在低温下比短序列酶稳定性高, 是因为长序列多出的氨基酸序列增加了酶的稳
定性。
关键词:
序列长度
6
脂肪酸脱氢酶 匍枝根霉 表达 稳定性
Expression of Recombinant
6
fatty Acid Desaturase from
Rhizopus stolonifer w ith D ifferent N
term inal Sequence Length
LuH e
1
Zhang B ibo
2
(
1
D epar tment of M icrobiology, ChongqingM edical University, Chongq ing 400016;
2
College of L ife Science,
Chongqing University of A rts and Sciences, Chongqing 402168)


Abstrac:t
Tw o recomb inantR hiz opus stolonif er
6
fa tty ac id desa turase enzym es w ith d iffe rent leng th N
term ini were c loned and
expressed in Saccharomyces cerev isiae strain INVSc.l LYRnD6D beg ins w ith the sequence o f the N
te rm ina l o f the Rhizopus stolonif er

6
fa tty ac id desaturase na tive, encoding a deduced polypeptide o f 459 am ino ac ids ( MSTLDRQSIFT IKELESISQRIHDGDEE

AMKFIII), wh ich is longer than SYRnD6D by 29 am ino ac ids (M STLDRQSIFT IKELESISQRIHDGDEEA). SYRnD6D beg ins w ith the
am ino acid sequence o f the N
te rm inus, w hich is Rhizopus stolonif er
6
fatty ac id desatu rase cDNA o f the predicted ORF encoding a
deduced po lypeptide o f 430 am ino acids ( MKFIIIDKKVY) . B io inform a tics analysis character ized the two recom binant of
6
fa tty acid
desaturase enzym es w ith d ifferent length N
te rm in,i inc lud ing three conserved histidine
r ich m otifs, hydropathy profile and one cyto

chrom e b5
like dom ain in the N
term inus. When the cod ing sequencew as expressed in Saccharom yces cerev isiae stra in INVSc,l the cod

ing produced RnD6D exh ib ited
6
fa tty acid desaturase ac tiv ity, lead ing to a nove l peak co rresponding to

lino len ic ac id( GLA ) m eth

y l ester standards, wh ich was detec ted w ith the sam e reten tion tim e. The residual ac tiv ity w as 74% o f LYRnD6D at 15
fo r 4 h and
43% o f SYRnD6D. It ind icated that purified recom binant LYRnD6D was m ore stable than SYRnD6D, due to theN
term ina l ex tension.
Key words:
Sequence leng th
6
fa tty ac id desa turase gene Rhizopus sto lon ifer Expression Stability
收稿日期: 2009
09
24
基金项目:国家
948项目
( 2003Q04)
作者简介:陆合,男,硕士,讲师,从事分子微生物研究; E
m a i:l lh luhe@ 126. com


 6
脂肪酸脱氢酶是一类在脂肪酸长链中引入
双键靠羧基定向的脱氢酶,对维持生物体内脂肪酸的
正常代谢、生物膜的正确结构和正常的生理功能具有
重要的作用 [ 1] ,在提高生物的抗寒能力上也具有重要
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 1期
的作用。目前,国内外一些实验室通过 cDNA文库、
cDNA末端扩增等方法已经从多种生物中克隆了
6

脱氢酶基因,并在烟草、油菜、大豆等生物中获得功能
表达 [ 2
6] ,有效地增加了这些作物的抗寒性。对已报
道的
6
脂肪酸脱氢酶比较发现,
6
脂肪酸脱氢酶
具有 3个保守的组氨酸区 ( h istidine
rich reg ion ), 即
H isI、H isII、H isIII和一个存在于 N端类似细胞色素
b5的血红素结合区 HPGG[ 7]。在已报道的低温酶中,
延长氨基酸序列长度有利于提高低温酶的稳定性 [ 8] ,
但有关 N端长度对
6
脂肪酸脱氢酶在低温下的稳
定性影响确没有相关报道。
匍枝根霉 A s 3
38(Rhizopus stolonifer)能产

亚
麻酸, 通过 RACE克隆到该菌株的
6
脂肪酸脱氢
酶基因和基因组序列, G enB ank注册的序列号分别
为 AY795076和 AY795075。生物信息学分析发现
该基因的基因组内有 4个内含子, 其中第一个内含
子在 ATG后 10个碱基处出现, 既第一个外显子仅
编码 4个氨基酸后就出现内含子, 这种现象在真菌
中很少见。利用软件预测到一个长 1 293 bp的
ORF,软件分析发现所预测的 ORF具有
6
脂肪酸
脱氢酶基因的 3个组氨酸保守序列和类似细胞色素
b5结构的 HPGG序列。为研究 N端序列长短对

6
脂肪酸脱氢酶在低温下的稳定性影响, 构建相
应的酵母表达载体,转入缺陷型酵母中进行表达,其
中长基因序列的重组子命名为 LYRnD6D,是直接从
匍枝根霉中克隆的
6
脂肪酸脱氢酶基因的 ORF
序列, N端序列为 MSTLDRQSIFT IKELES ISQR IHDG

DEEA;短序列重组子 SYRnD6D是预测的匍枝根
霉
6
脂肪酸脱氢酶基因 ORF序列, N端序列为
MKFIIIDKKVY。
1
材料与方法
1
1 材料
真菌菌株为本实验室通过 GC筛选到的产

亚
麻酸的匍枝根霉 A s 3
38(Rhizopus sto lonifer )。酵母
表达载体 pY es2
0和营养缺陷型酵母菌株 INVScl
购自美国 Inv itrogen生物技术公司, 胶回收试剂盒从
上海华舜公司购买, Taq DNA聚合酶、dNTP、亚油
酸、限制性内切酶从上海生工公司购买, PCR引物
和测序由上海博亚完成, 大肠杆菌 DH5
为本室保
存,

亚麻酸甲酯标品、NP40购于美国 S igm a生物
公司。半乳糖、棉籽糖购自上海试剂二厂。
1
2 方法
1
2
1
短序列重组表达载体的构建 取本室构建
的含有匍枝根霉
6
脂肪酸脱氢酶基因自然序列
的重组质粒 LYRnD6D为模板 [ 9 ] ,根据序列分析得
到的短序列 ORF构建 PCR扩增引物,并在引物序
列中分别引入 E coR I和 Xho I限制性酶切位点 (下
划线部分 )。
上游引物: 5

TACGGTGAATTCATGAAGTTCA

TTATTATCGACAAG
3

下游引物: 5

ACCTGCCTCGAGTTAAAACGAC

T TTTTGCTTAATTGC
3

将扩增得到的序列 RnD6和酵母表达载体 pY

ES2
0分别用 E coR I和 Xho I限制性内切酶进行双
酶切,回收后连接, 并转化大肠杆菌 DH5
。所有的
分子操作均按常规的分子生物学实验进行。重组并
经测序检验后的表达载体命名为 SYRnD6D, 区别于
自然序列的重组质粒 LYRnD6D。
1
2
2
酵母细胞的转化与诱导表达 酵母细胞的
转化和诱导表达参照从美国 Invitrogen生物技术公
司所购买载体 pYES2
0的操作手册和毛小红报
道 [ 10]的方法进行。
1
2
3
脂肪酸分析 酵母细胞总脂肪酸的甲酯化
和气相色谱的分析参照刘莉等 [ 11]的方法进行。
1
2
4
酶的制备与温度对酶稳定性的影响 酶的
制备与脱氢反应体系参照咸漠等 [ 12]的方法: 当转化
酵母细胞 OD600 = 1
0时, 离心收集酵母细胞, 磷酸
缓冲液冲洗 3次, 超声波处理 10 s, 5
下研磨后离
心, 取上清液冷冻干燥后, 加入含有辅酶 A、辐酶 II
( NADPH)、底物亚油酸等物质的反应体系中, 15

下反应 4 h。每间隔 1 h,取反应液,室温下利用分光
光度计在 340 nm处测定 NADPH 的增加量来定义
酶的活力。酶每分钟催化产生 1
mo l的 NADPH所
需酶量为 1个酶单位, 以初始反应活力为 100%计
算相对活力。
2 结果和分析
2
1
短序列表达重组载体 SYRnD6D的构建和检测
根据序列分析的结果,预测到一个 1 296 bp的
ORF框, 同时具有
6
脂肪酸脱氢酶基因保守的组
氨酸和 HPGG序列。依据短序列设计引物, 并引入
108
2010年第 1期




陆合等:不同 N端序列长度匍枝根霉
6
脂肪酸脱氢酶重组子的表达
限制性酶切位点。以重组质粒 LYRnD6D为模板进
行 PCR扩增。扩增出的条带大小为 1 300 bp与预
期的相符合, 命名为 RnD6(图 1)。测序鉴定后,将
PCR产物和载体双酶切后进行连接, 构建短序列的
表达载体 SYRnD6D, 连接好的短序列表达载体
SYRnD6D转化到大肠杆菌 DH5
中,从 LB平板中
随机挑出转化子, 进行双酶切和菌液 PCR检测; 将
筛选到的转化子送到生物公司测序, 酶切和测序验
证一致 (图 2), 表明短序列的 ORF框已经插入到载
体 pYES2
0中。
2
2
不同重组子表达载体在酵母中的表达
将测序验证后的表达载体 LYRnD6D和 SYR

nD6D转入缺陷型酵母 S
cerevisiae INVSc l中进行功
能表达,半乳糖的诱导和添加底物亚油酸后,分别提
取酵母细胞和发酵液的总脂肪酸, 甲酯化处理后进
行 GC分析。发酵液内没有发现相应的

亚麻酸,
表明
6
脂肪酸脱氢酶与预测一致,是一个膜结合
酶。在转入表达载体 LYRnD6D和 SYRnD6D的缺
陷型酵母脂肪酸提取液中发现与

亚麻酸甲酯化
标样出峰时间一致的一个新峰, 这表明所导入的
两个序列均在酵母内得到表达, 可将底物亚油酸
转化为

亚麻酸,其中 LYRnD6D重组子新产生的


亚麻酸含量占总脂肪酸的 12
25% , SYRnD6D
重组子新产生的

亚麻酸含量仅占总脂肪酸的 3
45%
(图 3)。
M. M ark er; 1, 2.重组质粒 LYRnD6D的 PCR扩增产物; 3.阴性对照
图 1
RnD6序列的电泳图
2
3 温度对酶的影响
当酵母细胞的 OD600 = 1
0时, 离心收集细胞,
提取重组子合成的酶,进行相应的脱氢反应。在相
同温度下,长序列重组子比短序列重组子产生的


亚麻酸产量高。在其它条件不变, 反应温度固定为
15
反应时,随着反应时间的增加,酶的相对活力均
在下降, 但 SYRnD6D 重组子下降得非常多, 而
LYRnD6D重组子在 4 h后酶活力仍有 74% (图 4),
表明增加 N端序列的长度, 能够使重组酶在低温下
的稳定性得到加强。
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 1期
图 4
两个重组子在低温下的稳定
3 讨论
影响酶稳定性的因素有很多, 研究时可以通过
比较同功酶分析影响酶稳定性的因素, 也可通过自
然或人工诱变的方法来获得影响稳定的氨基酸序
列,而酶的稳定性可以通过熔化温度 Tm、相对活力、
变性剂浓度等方法进行测定。重组子 LYRnD6D和
SYRnD6D虽有不同长度的 N端序列, 但均具有
6

脂肪酸脱氢酶所特有的类细胞色素 b5结构 HPGG
和 3个保守的组氨酸序列。GC分析可见两序列均
能在缺陷型酵母体内表达, 但二者的稳定性有较大
的差异。相对活力的测定表明在常温下重组子
LYRnD6D表达的酶比 SYRnD6D稳定性要高,而两
个重组子间除 LYRnD6D比 SYRnD6D的 N端长 29
个氨基酸外,其它均相同, 所以影响两者低温下的稳
定性因素主要是增加的 N端序列, 这与 H elianti
等 [ 13]报道增加氨基酸 N端长度能增加酶的稳定性
一致。Fe ller等 [ 14]认为带负电荷氨基酸的增加,特
别是天冬氨酸的增加可以增强蛋白质表面的亲水性
降低蛋白外层的紧密度,提高蛋白质的柔韧度,进而
增加其稳定性。重组子 LYRnD6D增加的 29个氨基
酸中,有 3个是天冬氨酸,这可能也是重组子 LYRnD6D
稳定性比 SYRnD6D高的另外一个原因。但二者比
较起来, 增加 N端序列的长度应该是提高
6
脂肪
酸脱氢酶稳定性的主要原因。
对
6
脂肪酸脱氢酶基因的利用目前主要集中
在基因工程生产

亚麻酸和调整植物的脂肪酸代
谢上, 对酶的特性研究还没见报道, 这与大多数的

6
脂肪酸脱氢酶是一类与膜结合的酶有关。延长
酶的序列长度,可以增加其低温下的稳定性,但增加
的氨基酸序列是如何维持蛋白质的稳定性, 以及

6
脂肪酸脱氢酶作为一类低温酶其相应的低温适
应机制如何还需进一步的研究。所以进一步深入研
究
6
脂肪酸脱氢酶不仅能进一步增加低温酶的应
用, 而且可以为研究低温酶的冷适应机制提供新的
理论基础。
参 考 文 献
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