全 文 ：热带亚热带植物学报 2006，14(6)：460-466
Journal ofTropical and SubtropicalBotany
表达 一亚麻酸的无筛选标记转基因大豆的鉴定
张秀春 ，林俊扬2，彭 明 ，郭丽琼 1】 ，林俊芳
(1．中国热带农业科学院热带作物生物技术研究所，海口571101；2．福建省莆田市农业科学研究所，福建莆田351100
3．华南农业大学食品学院生物工程系，广州510640)
摘要：对所获得的9株无筛选标记基因的 T 代莆豆 8008转基因大豆的T：代进行了分析。PCR和 Southern杂交检测
表明标记基因已不存在于转基因株系中，同时 目的基因以纯合或者杂合状态存在于部分株系中，除草剂抗性分析也表
明这些转基因株系已不再具有抗除草剂的能力。Northern杂交检测表明△ ．脂肪酸脱氢酶基因在转基因株系中可以转
录。GC分析表明其中 6个转基因植株富含 GLA。
关键词：大豆；△ ．脂肪酸脱氢酶基因；无标记基因；^y．亚麻酸：Southernblot；Northernblot；GC
中图分类号：Q943．2 文献标识码 ：A 文章编号 ：1005—3395(2006)06—0460—07
Characterization of M arker—free Transgenic Soybeans with A6-fatty
Acid Desaturase Gene Expressing —linolenic Acid
ZHANG XiU-chun ， LIN Jun—yang ， PENG Ming ， GUO Li—qiong ，一， LIN Jun—fang ，
(1．Chinese Acodemy ofTropical agricultural Sciences，Haikou 571101，China；2．Putian City’S Institute ofAgricultural Sciences，Putian 351100
China：3．Department ofBioengineering,Colege ofFood Sciences，South China agricultural University，Guangzhou 510640，China)
Abstract： Nine lines of T2 generation of marker-flee transgenic soybeans of Pudou 8008 with A6-fatty acid
desaturase gene were characterized．PCR and Southern blot indicated that the selective marker gene(bar)had been
removed flom some transgenic soybean progenies， while A6-fatty acid desaturase gene was still in some progenies
of these transgenic soybean lines．Northern blot showed that the A6-fatty acid desaturase gene could be transcribed
in the marker-flee transgenic soybean lines．Gas chromatographic analysis showed that six transgenic soybean
lines could producey^—linolenic acid．
Key words：Marker-flee transgenic soybean；A6-fatty acid desaturase；y^—linolenic acid；Southern blot；Northern
blot；GC
y^一亚麻酸(^y—linolenic acid，GLA)是一种多不饱
和脂肪酸，分子式 C。 H加O ，化学名称为 6,9，12一十
八碳三烯酸，在碳链的第 6、9、12位各有一个双键。
由于 y^一亚麻酸对人体的激素调节和在人体脂肪酸
代谢中发挥的重要生理作用，特别是对治疗心血管
疾病、糖尿病以及癌症等疾病具有药用价值，因此，
近年来 y^一亚麻酸已成为学术界研究的热点之-[1 ]。
△6-脂肪酸脱氢 酶 (△6-faty acid desaturase．D6D)
收稿 日期 ：2006—05—24 接受 日期 ：2006—08—28
基金项目：广东省科技攻关项目(2005B20101009)资助
通讯作者 Coresponding author
是 y^一亚麻酸生物合成的关键酶，它以亚油酸为底
物，在 C6和 C7位之间脱氢形成 y^一亚麻酸，然后通
过碳链延长和进一步脱氢作用形成花生四烯酸、前
列腺素类和白三烯类生物活性物质。
大豆是最重要的油料作物和粮食作物之一，是
世界上食用油和植物蛋白的主要来源，既可以直接
食用，也可以用于榨油和加工成许多豆类食品。大
豆种子含有大约 40％ 的蛋白质和 20％的油脂，大
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第 6期 张秀春等：表达Y一亚麻酸的无筛选标记转基因大豆的鉴定 461
豆油脂富含亚油酸，但不含 y^一亚麻酸或其含量极低嘲。
研究结果表明由于大豆中含有丰富的亚油酸，所以
当△ 一脂肪酸脱氢酶基因转入大豆植株后，能够利
用大豆中的亚油酸进行脂肪酸代谢。通过对转基因
大豆种子的 GC分析，检测到了△ 一脂肪酸脱氢酶
基因的代谢产物 y^一亚麻酸，说明转入的外源基因获
得了功能性表达【6]。
由于转基因作物中筛选标记基因可能带来潜
在的安全性问题，所以，培育无选择标记的转基因
作物可以提高生物安全性，是保证转基因技术安全
发展的有效办法之一，且已成为农作物基因工程育
种的重要目标[7-1 0]。目前，培育无抗性标记基因的转
基因植物的方法主要有三种系统：共转化系统、特
异重组酶转化系统及转座子系统。共转化系统是采
用两个质粒或一个含有两套 T—DNA表达盒的表达
载体共同转化植物，其中一套表达盒含有抗性选择
标记基因，另一套表达盒含有目的基因。它们转化
植物后可能整合到植物基因组的不同染色体或同
一 染色体的不同位置上，在减数分裂过程中，标记
基因和 目的基因有可能发生分离，从而有可能在转
基因后代中筛选到只含有目的基因而不含有选择
标记基因的个体。Komari首先运用这种方法转化植
物获得无抗性标记基因的转基因植物[71。特异重组
酶转化系统是由位点特异重组酶和其靶序列组成，
从而剔除位于靶序列之间的标记基因。转座子系统
的原理是植物中可移动的转座子系统能分解为不
移动的转座酶基因和可移动的末端重复序列，它几
乎能在所有的异源植物寄主细胞中自由转座。有时
转座作用并不伴随再次插入而是该转座子丢失。基
于以上原理，转座子系统被开发用于转化系统来培
育安全的、无标记基因的转基因植株[n]。
本研究在前期研究的基础上[ ”]，对所获得的9
株无标记 T 代莆豆 8008转基因大豆的T：代进行
除 草剂 抗 性 分 析 、PCR 检 测 、Southern 杂 交 、
Northern杂交检测以及脂肪酸的气相色谱分析，以
鉴定富含 GLA(~／一linolenic acid)的无筛选标记转基
因大豆。
1材料和方法
植物材料 无标记 T，代莆豆 8008转基因大
豆来自本实验室的先期工作所得[ 。即利用含有筛
选标记基因和 目的基因 △ 一脂肪酸脱氢酶基因的
双 T—DNA共 转化表 达载体 pLIN61，经农杆 菌
EHA101介导，采用子叶节转化法转化大豆，使用除
草剂 Glufosinate作为筛选剂，获得了一批携带有玻
璃苣△ 一脂肪酸脱氢酶基因的T。转基因大豆。T。转
基因大豆自交产生的T 代种子播种后，利用 PCR
和 Southem杂交检测了 161株转 △ 一脂肪酸脱氢酶
基因 (D6D)的 T 代植株，初步筛选出只含有功能
基因fD6D)~：i不含有筛选标记基因(6 的转基因大
豆植株 9株。
PCR检测 采用 CTAB法提取大豆叶片基
因组 DNA。
目的基 因 D6D 的 PCR扩增 引物为 DesatF
(5’一TTT TTC ATC CAT GGC TGC TCA从 T C一3’)
和 DesatR(5’一TTT TTT CTA GAT TAA CCA TGA
GTG TGA AGA GC一3’)。PCR反应条件：95℃预变
性 5 min，94oC 40 S，52℃40 S，72oC 60 S，33个循环，
72℃延伸 10 min。扩增的片断大小为 l 370 bp。
选择标记基因 bar的 PCR扩增引物为 ZH1
(5’一ATG AGC CCA GAA CGA CGC一3’)和 ZH2
(5’一TCA GAT CTC GGT GAC GGG CA一3’)，PCR
反应条件：95℃预变性 5 min，94oC 40 S，57℃40 S，
72℃50 S，33个循环，72 延伸 10min。扩增的片断
大小为456bp。
转基因植株的 Southern杂交检测 取 1O g
大豆基因组 DNA，EcoRI酶切后在 1％的琼脂糖凝
胶上电泳分离，植物共转化表达载体pLIN61用 PstI
单酶切。采用向下毛细管印迹法将凝胶上的 DNA
转移到尼龙膜上，采用 Roche公司产的地高辛标记
检测试剂盒进行 Southern杂交。目的基因 D6D及
选择标记基因 bar的探针标记、尼龙膜预杂交和杂
交显影等具体步骤参见试剂盒使用说明书。
Northern检测 提取 PCR和 Southem杂交
鉴定为阳性的转基因植株和未转基因植株幼嫩种
子的总 RNA，取大约 15 g在 1％甲醛变性胶上进
行电泳分离，转膜后与D6D基因探针进行 Northem
杂交检测，具体实验步骤见 Roche公司产的地高辛
标记检测试剂盒使用说明书。
转基因大豆的气相色谱分析 取转基因大
豆 T：代种子，5Oc烘干，研碎后用索氏提取器抽提
3 h；加入 1 g无水硫酸钠，10 000 rpm离心 20 min：
取上清液，蒸发乙醚；取 0．1 ml上述提取的油，加
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l ml 2：1乙醚 ． 乙烷帚I 1 ml 59~KOH r】障．反
10 min，加水定容 】0 ml；取 『．展进盯气竹l笆黹分
折或 4 倮仔蔷川．以Sigma公 可t ：的 GLA l 7i
为标准品：正己烷 溶剂：仪器为岛滓GC一9A：牲 r
SE一52／25 l1；城 L N 50 m／inin。； t化筝泄度 280 ：：
拄 2l0 ：：氯火焰离子化椅洲器；分析软fl：：也
_L f1： -，津瑞 公司，
2结果利分析
2．1 代转基因植株的除草剂抗性鉴定和 PCR扩增
将 标记蕻 的T．1 转 - 林的种 ．!『j T：
代橘利 ，叶 滁抹除 剂gIulbsinate 1 00 tug L ．i17第
7天 察，发现均 -1q7C除 ：剂 glufosinate【衣 lj
提取微 DNA，讣州川 desaF、desaR f¨ ZIIl、
ZH2阿对引物进行_If向 D6D l千u选择标记坫【划
bar的 PCR捡删 删结聚 (是 1 J表圳：9株
记壤 的T 代转 鞋出梢株的T 代 l11选择怀 辕
bar PCR均为蛳 ．，与除‘’L刺g[utbsinate抗 实
验结果 致．进 步Iil J返9个杯系是
的转肇 I人 ． 分缔粜见 l、2【 样-。 对·j】
物 PCR r 物等鞋溉匀后J_样 Ji H仃5个株系旧
T 后代的[1的鉴 J D6D技 分离 植株能
⋯lj旧 段，仃 植株不能 增ili}i的片段 罔
】)： 4个株 系的 T!后代c‘ 1]f匀 【 D6D没仃发
表 I
1dbi
转基 园 r_代的 障草剂 抗性及 基因型 井析
ransgenic soyhean l ’m T cseeds
+：¨引什 Positive：一：⋯ 林 Negalive：s：埘防n荆蛾
：#Sensitive
七分离，所有枇株均能{r增⋯|1IYJ”段 (图 2) 这
没仃分离的4个林系的捎株I J能 鳍
是 D6D旗 纯 介系．
2．2 T!代转基因植株的 Southern blot检测
随 "l耿 1 迷 l I J； 没 f¨分 离n0 7-8、1I—l0
9—7的 T 代fIi株 5株．凡 ．提墩 j． 组 DNA
li J限制 l～ 哺 En RI进 哺bJ 转 ．Ir—i 光J
desaF相J desaR{·’增 顷 t pLIN61 J 物 LIl：J J E
剖 l 9十正h． L 杜乐【l!J T f 伯PcR -￡
Fig 1 R analys~s ofthe DNA 1lmm T J1 1cs derived from 9 m arker—I：rec transgenic soybean Iinl2s
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In一10：杜最 1l 20—22：怀最q-9：23—27：悻 喜7- ：8 32：怀彖7一I6：33—37：托彖 l】一l0 一j：¨、采u．．
M ：Marker D_20(10：CK ；PIasnlid pLIN6I：W T： Wild—type suybeam Lanes1—5。1 progemesfiom line 7 n：【 nes
6一』0。T progeniesfix,inline 7-9：Laile~11一l ：r progcnl 疗 m Linel1 5：Lanes I^ 一I q T prtL,2enic~． nn1line ll一9：
Lanes 20—22：T progenies丹㈣ )line 0-9． Lanes 23—27：I，progenies fmUl hne 7-H [aly：-2 一32：T progenie~from line
— I6，l a『1 33-j T，progenies忤。n1 Linel】一1lI Lanes 3 一4 ．丁 progemes1ro11line g-?
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靴6 张香 等： ．哑臃陵f 筛选札 转琏 大 们 定
门6，J探 tt j韭 Southern 交 梭测 ， 然 nj剧 岔
0．1％SDS 0 2 mol,LNaOl洗 上 D6D 探针 il}
ZHl 4：1l ZH2扩增 磺粮 pLIN6l／ 物 标 的探 针却
il~lr探引进行 Southern 交 捻删 ， ig 2、
Southern 空擒洲维粜挺it)J：所 转 植株川
D6D椽仆均能 0 J 性 对照 表达救体 pLIN61 I
( 2i{ 们矬『|^CK) 样 i¨小 l；的J 、!D6D n0特
抖 条· ，而没仃转化的 ·『L对J 大 样 il! 没 杂
交f 号Ⅲ ( 2-l·的wTj：1i 所有转琴 栋J_fJ
bor探针均 没有转化f自 Il-埘照久 样一1 ‘样没
有朵史 弓H1现．这进 黟浣叫，我们得奠1 内转基
株j- 代是去睬 -， 基 的纯合系，
2 七hJ C,2i,t-1 转 蛀I ^i 7-8、lI．i【l、9-7fl!J
I 球 Southern
Fig 2 Soulhem hlol analyst ol gc1]OlliC DNA from T plants from
m 厂kc cImnsgenic t vh㈥ linzs 1r7-8
，
II-10 and g-7
A：n6 {l、B： 纠 I一5：7-g IH 舒 ℃转 【一佰摊 6—
10 I 1一】0 ll々 T_fe堪 ‘{竹林：1 I—I5：9- 『 郸打 ft墙 檀
：wT·咐。I 』、． ：CK：蓖让 藏 pLIN6I．Lll!~II 峨 叫
Panel A：Probed v,ilh IJ6[J；Pancl B Probed with Lanes 1—5
r pro genies t n1 line 7-H Lanes 一^1() T progcnl from line I I一1()、
LanesII一1 1 progenies lm line 9-?：W r：W ild—type so~bean：CK
pklN61． I
2．3无标记基因 T：代种子的 Northern杂 交检 测
人最提取经 洲为无 id墒 的T． 针 株所
站嫩 的 RNA．终lL冰，转 后．I』¨ j desaF f¨
463
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翳 姆 ■1 ■，_
l 3 *】 l 琏 蛄 T．f℃f j 、0nh肌l 靠
Fig 3 Nonhem blot ofthe m RN^ fiom ma~-ker-ficc
t ran~gcnic T s s
w 【： j ． t一 傲 打 三^ 逃 h L f一轼 培⋯ L l_
诛采7-6．1一H．7-9 7．I6II．5 I1—9 11—1l1．0-7 9-9 nf J w r：
W lId—type soybean：1,~TI~S I 9：Seeds ufT Iinc~of 7-6 -K ]一 ．
I1 5．11-9．11-10，q一7 and 9—9 respeciivd
desaR扩增质托pLIN6I- 物酥记的探什I=¨ D6D
针进仃Northern 交舱 10，结果 iE 3，球样I
l1—9<泳遒 6)外J 余转 林均 lU J 晌杂交
号．1 术转 批株没仃 ．练 j：．i77述，I．述愉删 j．
1uj：本研彳 已蔹甜厄选择 构转坫【 l k
。 ¨：转求水、r InRNA 卜碍fi』灰达
2．4转基因大豆脂肪酸 的气 相色谱cGC)分析
把经过 PCR、Southcm 千[】Northern j 十 刹0为
I ，并且鉴 为无柏、{ 耩 叫转J．￡f 人 门7-6、
7-8、7-16、9-7、9-9、Il一10所 i T：代种 州索氏提
取浊进 汕脂攫墩．Il 哺化 ． 胁陵fl0 G(’分
析， 分结粜 图4、捉2所示～从l划r ’J ， 川j
凡1 年{J比：1) 杯 转 凡 T f℃御子
I¨ 现 了 个特 蛛峰 -筒 表示)，fI t 1 J分
" 为 8．148、8 204、8 I39、8】46、8．1 36、S l43 rain．
GLA龠最为9．O％的·忻肪陵标玳I I(iLA n i
[Iq问 8．1 37mil( til、上捉 )l剞l埘商 mj求转化葑，I-：
型艄株的种 r-{ 没f_『这 特睐 ．随lI』J 1)61)n 标
表 2 无标 记基 因转基 因大豆 代种子 的脂 防醋的气 相色谱 ㈤ (’)分析
Table 2 Gas~h ronlatographic anal,．~is ut Ihty acid nlclh)Ic．-ici：-ot total lipids
二^h、 】 ITlfe林乐 一 il r~7,2,l1 l 艘
M ；~rkcr+Free 1ineh O]eici tlv acid
rom Ti planIs ：w／w ％ J
9- 1 54
7-I6 35 96
7-8 38 16
I1一10 35 65
7-6 33 40
9+9 48 59
4q 64
GLA／ ilUl0晖簦 GLA／ f1 r
GL Iatly acid GL．A．／welght ol soybean
way， ， M．肇
27 26 5 2
22 3R { =
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I 5 87 3 2
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热带亚热带植物学报 第 l4卷
记基因转基因大豆 9．7、7．16、7—8、l1．10、7．6、9．9中
获得表达，其表达量在总脂肪酸中的比例分别为
27．26％ 、22_38％ 、19．48％ 、15．87％ 、14．89％ 、5．02％ ：
在大豆中的比例分别为 5．2％、4．2％、3．4％、3．2％、
2．9％、1．0％。从表 2中可知 GLA的出现与亚油酸含
量的降低明显一致，未转化野生型植株的种子中亚
油酸含量为 49．64％，而无标记基因转基因大豆 T，
代种子中，亚油酸含量为 31．54％一48．59％，并且
GLA含量越高，亚油酸含量越低。
综上所述，D6D在无标记基因转基因大豆中成
功表达，产生了预期产物 GLA，获得表达 GLA的无
筛选标记转基因大豆。
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第 6期 张秀春等：表达 Y．亚麻酸的无筛选标记转基因大豆的鉴定 465
3讨论
图4无标记转基因大豆脂肪酸的气相色谱 (GC)分析
Fig．4 Gas chromatographic analysis offatty acid methylesters in seeds ofmarker-free transgenic SOybearl
A：GLA含量为9．0％脂肪酸标准品；B：7-8所结的T 代种子；C：野生型大豆种子。
Panel A：9．0％ -Linolenate standard；Pan el B：Seed ofline 7-8；C：Wild-type SOybean ．
在转基因植物中，剔除选择标记基因将提高转
基因植物的食用安全性和对环境的安全性，更易为
广大消费者所接受，也有利于对同一个植物品种进
行多次转基因操作。共转化方法作为一种剔除标记
基因方法，不需要附加选择标记或切除系统，相对
来说比较简单，但需后代植株经过有性杂交及减数
分裂过程，目的基因和选择标记基因才能被分开，
花费时间较长，不适合于马铃薯、甘蔗等无性繁殖
植物的转化。此外，共转化的效率必须相当高，并且
共转化的DNA要整合在染色体组的非连锁位点
上。将目的基因和选择标记基因插入到同一质粒的
两个相互独立的T—DNA内，农杆菌转化后他们可
能整合到植物不同染色体或同一染色体的不同位
置上，在减数分裂过程中，标记基因和 目的基因将
发生分离，从而可以剔除选择标记基因，通过 PCR
及 Southern检测可以筛选到只含功能基因而不含
标记基因的转基因植株l 。
外源基因能否在转基因植株的后代中稳定遗
传和表达是基因工程技术研究中人们普遍关注的
问题，转基因整合到植物基因组后产生的遗传效应
是多样的，外源基因在受体植株中的遗传行为是非
常复杂的，在许多方面有别于经典的遗传规律。研
究表明，转基因在许多转化体中都能稳定整合，正
常表达，并呈常见的孟德尔遗传规律，也有一些由
于转基因整合的方式和拷贝数不同，或者由于损伤
或丢失导致不规则的遗传 。本研究通过T．代转基
因的PCR检测表明功能基因和选择标记基因并不
符合孟德尔遗传规律，可能是发生了转基因丢失、
截短、重排等过程，也可能是本实验的样本群体太
小不足以进行统计学分析。
本研究对前期获得的 9株无标记基因的转基
因T 代种子进行 Northern分子杂交分析，显示该
基因在无标记基因的转基因植株中的 mRNA水平
得到表达。GC分析在种子中检测到 D6D的产物
GLA，证明该基因在无标记转基因大豆得到了表
达，说明该基因能够稳定的遗传给后代。
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466 热带亚热带植物学报 第 l4卷
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