全 文 ：菌 物 学 报 24（1）：48~52, 2005
Mycosystema
松口蘑与假松口蘑 ITS序列测定和分析比较
沙 涛 1 丁骅孙 2 李 觅 2 张汉波 1, 2
程立忠 2 赵之伟 1 张亚平 1,3
（1云南大学生物资源保护与利用国家重点实验室培育基地 昆明 650091；2 云南大学生物学系 昆明 650091；
3中国科学院昆明动物研究所 昆明 650223）
摘 要：对松口蘑和假松口蘑进行 ITS序列测序，通过 DNAStar软件比较分析，发现松口蘑与
假松口蘑的 5.8S rDNA序列完全一致，ITS1和 ITS2呈现不同程度的多态性。松口蘑 ITS序列
长度为 601bp，假松口蘑 ITS序列长度为 563bp。设计了扩增松口蘑和假松口蘑 ITS1的特异性
引物，能够快速地区别松口蘑与假松口蘑。
关键词：多态性，序列长度，特异性引物
中图分类号：Q936 文献标识码：A 文章编号：1672-6472（2005）01-0048-0052

口蘑属 Tricholoma 迄今为止全球共报道 200 余种,我国记载约 40 余种（卯晓岚，1998）,
云南市场常见 4 种：松口蘑 Tricholoma matsutake (S. Ito et S. Imai) Singer 、青冈松口蘑
Tricholoma quercicola M. Zang、假松口蘑 Tricholoma bakamatsutake Hongo 和粗壮口蘑
Tricholoma robustum (Alb. et Schwein. : Fr.) Ricken。这其中以松口蘑价格最为昂贵，为云南主
要创外汇菌种（于富强等，2002）。我国从 80 年代后期开始向日本出口松口蘑，年出口量约
6000～7000 t，为国家创汇达数十亿美元（弓明钦等，2000）。目前，松口蘑尚不能人工培
养，进行松口蘑半人工栽培和原产地的林地保育是国内外松口蘑保护利用的一条有效途径。
由于在全人工条件内松口蘑不能完成其整个生活史，即不能培养出子实体，仅靠菌丝体形态
学、营养学特征则难于准确认分离物是否是松口蘑纯菌种，因而也难于进一步扩大培养和进
行松口蘑的半人工栽培。DNA 作为遗传物质能客观和真实地反映物种之间的亲缘关系，对于
菌种鉴定和系统分类则是一种更有力的依据和补充（罗信昌，2001）。
ITS，内转录间隔区（internal transcribed spacer）是 18S-26S 核糖体 DNA（rDNA）被
5.8S分为 ITS1和 ITS2两部分，5.8S、18S、26S进化速率慢 ,常用于探讨科级和科级以上等级
的系统发育问题。而间隔区如 ITS区进化速率较编码区快, 一般用于研究较低等级如属间、种
间甚至居群间的系统关系（赵志礼等，2000）。Kikuchi 等（2000）曾用松口蘑 ITS特异性引
物直接对外生菌根真菌进行扩增，来确定外生菌根中松口蘑的存在，发现在松口蘑居群内 ITS
不存在多态性。基于此，Guerin-Lagette 等（2002）进一步通过 IGS1 的特征分析把日本松口
蘑分为 8个 IGS1-RFLP酶切类型。本文通过对松口蘑 Tricholoma matsutake及松口蘑的近缘种
假松口蘑 Tricholoma bakamatsutake的 ITS序列结构分析比较，为 ITS序列在松口蘑群分子系
统学及分子进化研究中的潜在地位和菌种鉴定提供依据和补充。

基金项目：“十五”国家科技攻关计划“生物资源与生物安全技术研究开发”项目（批准号：No.2001BA707B01）；中
央级科研院所科技基础性工作专项——重要野生食用真菌种质资源收集与保藏研究
收原稿日期：2004-08-25，收修改稿日期：2004-11-15
DOI:10.13346/j.mycosystema.2005.01.010
1期 沙 涛等：松口蘑与假松口蘑 ITS序列测定和分析比较 49
1 材料与方法
1.1 样品
松口蘑 Tricholoma matsutake TF25与云南松共生的子实体采于云南省楚雄州禄丰县舍资镇
元永井；假松口蘑 Tricholoma bakamatsutake TF9 采于昆明市西山区芹菜塘。
1.2 DNA提取
采用曾东方等（2001）的方法。
1.3 PCR扩增
1.3.1 ITS 引物（ ITS4-ITS5）： ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC； ITS5 GGAAGTAA
AAGTCGTAACAAGG（White等，1990）。
1.3.2 ITS1 引物（ ITS5－ ITS1s） : ITS1s CATTTCGCTGCGTTCTTCAT； ITS5 GGAA
GTAAAAGTCGTAACAAGG。以上引物均由上海博亚生物技术有限公司合成。
1.3.3 50µl反应体系包括：50µl PCR反应体系包括 10×buffer 5µl, dNTP 2µl（25mM），引物
2µl，Taq 酶 0.25µl（大连宝生物工程有限公司）, DNA 模板 1µl，无菌去离子水补足 50µl，
Mineral oil覆盖。扩增程序：94℃ 2min；94℃ 40s，52℃ 1min，72℃ 1min，40个循环；72
℃ 5min。PCR扩增产物用 1.25%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色观察。
1.4 从琼脂糖凝胶中回收 DNA片段：扩增特异的 DNA谱带用割胶铲从琼脂糖凝胶中割下，采
用上海华舜生物工程有限公司的柱离心式小量胶回收试剂盒进行 DNA回收纯化。
1.5 ITS 序列测序测序：ITS 通用引物扩增的目的片段用 WATSON 胶回收试剂盒回收并纯化
DNA，用 ABI DNA3700 分析仪测序。获得的序列用 NCBI 的 BLAST 进行序列搜索，用
DNAStar软件进行序列比较。
表 1 松口蘑与假松口蘑 ITS分布长度及同源性比较
Table1 Comparison of the ITS and rDNAs length variation and homologies in T. matsutake and T. bakamatsutake
ITS长度（bp）及区域
Localization and length(bp) of ITS region
松口蘑与假松口蘑
同源性比较(％)
Homology between
T. matsutake and
T. bakamatsutake (%)
DNA
松口蘑 Tricholoma matsutake
TF25
假松口蘑 Tricholoma
bakamatsutake TF9

ITS 601 563
ITS1 spacer 245 199 75.9
5.8S rDNA 157 157 100
ITS2 spacer 199 207 89.4
2 结果
2.1 ITS序列长度
应用 ITS 通用引物 ITS4/ITS5 对松口蘑及假松口蘑进行了 PCR 扩增，扩增产物用
WATSON胶回收试剂盒回收纯化 DNA，经测序反应、异丙醇纯化后用 ABI DNA3700 分析仪
测序，得到松口蘑及假松口蘑序列 GenBank 登记号（AY391711，AY484515），分别为：638bp
和 616bp，其中松口蘑 18S rDNA 5bp，ITS1 spacer 245bp，5.8S rDNA 157bp，ITS2 spacer
199bp，28S rDNA 32bp；假松口蘑 18S rDNA 19bp，ITS1 spacer 199bp，5.8S rDNA 157bp，
ITS2 spacer 207bp，28S rDNA 34bp见表 1。
2.2 G+C含量
从表 2可以看出松口蘑和假松口蘑的 5.8S rDNA的 G+C含量完全一样，只有 ITS1、ITS2
50 菌 物 学 报 24卷
的 G+C 含量百分比存在着明显的差异。总 ITS 的 G+C 含量百分比差不多，分别为松口蘑
43.93％、假松口蘑 40.85％，说明它们的亲缘关系有可能非常相近。
2.3 ITS序列分析比较
松口蘑与假松口蘑的 5.8S rDNA具有 100％的同源性，而 ITS1和 ITS2表现出种间的多态
性。其中，ITS1有 75.9％的同源性，ITS2 有 89.4％的同源性（表 1、表 2、图 1），ITS1更
具多态性。
表 2 松口蘑与假松口蘑 G+C含量分布情况
Table 2 Comparison of the G+C content in T. matsutake and T. bakamatsutake
ITS(%) ITS1 (%) 5.8S rDNA (%) ITS2 (%)
松口蘑 Tricholoma matsutake TF25 43.93 44.90 45.86 41.21
假松口蘑 Tricholoma bakamatsutake TF9 40.85 38.19 45.86 39.61

2.4 ITS1 PCR图谱比较
根据松口蘑与假松口蘑的 ITS1的差异，我们设计了 ITS1s引物。ITS1s与 ITS5搭配为一
对引物来扩增 ITS1（图 1），从 ITS1 PCR 产物可以明显地看出假松口蘑(TF9)比松口蘑
（TF25）的片断短。
3 讨论
ITS 序列是真菌菌种和分离物鉴定的可靠依据(Schmidt
& Moreth, 2002)，在不同属的真菌之间 ITS1区域的多态性
程度变化比较大。有报道表明在小核菌属（Sclerotium）种
之间，在长 200bp的 ITS1 序列内，差异少于 2%，但在刺
盘孢菌属（Colletotrichum）种之间，该区域长 170bp，差
异却达到了 16.5%(Wipe et al., 1996)。
本研究结果表明松口蘑与假松口蘑的 ITS1 和 ITS2 序
列之间也存在明显差异，碱基替代率分别达到了 27.3%和
11.0%。因此，ITS 可以作为松口蘑与假松口蘑的种间鉴
定。根据松口蘑与假松口蘑的 ITS1的长短差异，笔者特意
设计了 ITS1s 引物，并与 ITS5 一起进行 PCR 扩增可以快
速地将松口蘑与假松口蘑区别开。
由于 18S、5.8S、25~28S rDNA的序列非常保守，有利
于通用引物的设计。松口蘑群的 ITS 序列一般片断较小
（500~700bp 左右）。因此，ITS 序列是该类群核酸分子探
针的良好分子标记，可以作为松口蘑与假松口蘑的种间鉴
定。
致 谢：本文得到云南大学省生物资源保护与利用重点实验
室—省部共建国家重点实验室培育基地 M. Palanichamy 博
士和中国科学院昆明动物研究所分子遗传学开放实验室全体人员的帮助，实验中还得到了云
南大学生物学系 2000级钱勇同学的协助，在此一并致谢。



图 1 松口蘑 TF25与假松口蘑
TF25的 ITS1片断比较
Fig1 Comparison of the ITS1
length of T. matsutake TF25 and
T. bakamatsutake TF9
1期 沙 涛等：松口蘑与假松口蘑 ITS序列测定和分析比较 51
18S rDNA ITS1 spacer
1 A C C T G C G G A A G G A T C A T T A T T G A A T A G A G C A T G G T T G G G T TF9
1 - - - - - - - - - - - - - - C A T T A T T G A A T A A A G C T T G G T T A G G T TF25

41 T G T A G T T A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C C C G A T G C A A A TF9
41 T G T C G C T G G C T C T C C G G G G C A T G T G C A C G C C T G A C G C C A A TF25

81 C T T T T T C A T C A C C T G T G C A C T G T T T G T A G A C T T G G G T A A G TF9
81 T C T T T T C A C C A C C T G T G C A C A T T T T G T A G G C T T G G A T A A A TF25

121 - - - - - - - - - - G A A A G C T T A G T T T - - - - - - - - - - - - - - T G C TF9
121 T A T G T C T C G A G G A A G C T C G G T T T G A G G A C T G C C G T G C T G C TF25

161 A T A A T C T - G G T T T T C C T T G C A T T T T - C T G G T C T A C G T A T T TF9
161 A A A A G C C A G G C T T T C C T T G T A T T T T T C C A G C C T A T G C A T T TF25

201 T T T A T T A C A C G C T C A G T C T G T C T T G G A A T G T T A T T T A A C G TF9
201 T T - A T T A T A C A C T C G G T A T G T C A T G G A A T G T T A T T T G G T T TF25
ITS1 spacer 5.8S rDNA
241 G G C T T C A T T G C C T T T A A A T C T T G T A C A A C T T T C A A C A A C G TF9
241 G G C T T A A T T G C C A G T A A A C C T T A T A C A A C T T T C A A C A A C G TF25

281 G A T C T C T T G G C T C T C G C A T C G A T G A A G A A C G C A G C G A A A T TF9
281 G A T C T C T T G G C T C T C G C A T C G A T G A A G A A C G C A G C G A A A T TF25

321 G C G A T A A G T A A T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G TF9
321 G C G A T A A G T A A T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G TF25

361 A A T C T T T G A A C G C A C C T T G C G C T C C T T G G T A T T C C G A G G A TF9
361 A A T C T T T G A A C G C A C C T T G C G C T C C T T G G T A T T C C G A G G A TF25

401 G C A T G C C T G T T T G A G T G T C A T G A A A T T C T C A A C C T T T T C A TF9
401 G C A T G C C T G T T T G A G T G T C A T G A A A T T C T C A A C C T T T T C A TF25
ITS2 spacer
441 G C T T T T - G T T G A T T A G G C T T G G A C T T T G G G A G T T T T T G C A TF9
441 G C T T T T T G T T G A A T A G G C T T G G A T T T T G G G A G T T G T T G C A TF25

481 G G C T T C T C A G T G G T C T G C T C T T C T T A A A T A T A T C A A T G T C TF9
481 G G C T G C T C A G A A G T C T G C T C T C C T T A A A T G T A T T A G - - - C TF25

521 G G G G C C T C C T G T T G T C T A G C A T A T G G T G T G A T A G T T A T C T TF9
521 G G G G C C - C T T G T T G T C T A G C A T T T G G T G T G A T A A T T A T C T TF25

561 A C G C C A T T A C G A A C A A A T G T A A T A A G G A G G C T C A G C T T C T TF9
561 A C G C C A T T G T G A A C A A - T G T A A T A G G - - - - - T C G G C T T C T TF25
ITS2 spacer
601 A A T T G T C T T T T A A - G A G A C A A T C T C T G A C A T T T T T G A C C T TF9
601 A A T C G T C T C G T A A A G A G A C A A T C T C T G A C A T - T T T G A C C - TF25

641 C A A A T C A G G T A G G A C T A C C C C G C G A TF9
641 C A A A T C A G G T A G G A C T A C C C - G T G A A TF25
28S rDNA
图 2 松口蘑与假松口蘑 ITS序列经 DNAStar的MegAlign软件按 ITS1、5.8S、ITS2分别比较分析的情况
Fig2 Sequence alignment of the ITS and rDNAs of T. matsutake and T. bakamatsutake.

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SEQUENCE ANALYSIS OF THE INTERNAL TRANSCRIBED SPACER OF
GENE CODING FOR rRNA IN TRICHOLOMA MATSUTAKE AND
TRICHOLOMA BAKAMATSUTAKE
SHA Tao1 DING Hua-Sun2 LI Mi2 ZHANG Han-Bo1, 2 CHENG Li-Zhong2
ZHAO Zhi-Wei1 ZHANG Ya-Ping1, 3
（1Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-resources, Yunnan University, Kunming 650091；
2Department of Biology, Yunnan University, Kunming 650091; 3Laboratory of Cellular and Molecular Evolution, Kunming
Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223）
ABSTRACT: The Internal Transcribed Spacer of Gene Coding for rRNA was sequenced and analyzed. No
difference was observed between 5.8S rDNA sequences of Tricholoma matsutake and Tricholoma
bakamatsutake, but the length discrepancy and sequence polymorphism of ITS1 and ITS2 were existed between
the two species. The length of entire ITS of Tricholoma matsutake was 601bp, and Tricholoma bakamatsutake,
563bp. Specific primers were designed for PCR ITS1 of the two species. It was easy to distinguish the two
species by use of the specific primers.
KEY WORDS: Polymorphism, length of sequence, specific primers