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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 4期
两种缢蛏线粒体基因全序列扩增方法的比较
郑润玲  李家乐  牛东红
(上海海洋大学水产与生命学院,上海 200090 )
  摘  要:  介绍了应用长 PCR技术扩增缢蛏线粒体全序列的两种方法, 并进行了比较。一种方法是使用通用引物扩增
COI基因和 16S基因并测序后,在两基因的两端分别设计两对引物扩增两基因中间的大片段,分别得到了 9
7 kb和 7
3 kb的
扩增产物。另一种方法是在 COI基因序列两端设计一对引物,扩增整个线粒体全序列, 得到了 17
1 kb的扩增产物。两种方
法在缢蛏的研究中进行比较后发现,前一种方法在操作实用性和后期测序方面都比后者好。
关键词:  长 PCR 缢蛏  线粒体全序列
Comparison of TwoMethods Involved in Amplification of Sinonovacula
constricta CompleteM itochondrialGenomes
Zheng Runling L i J iale N iu Donghong
(College of F isheries and Life Science, Shanghai O cean University, Shanghai 200090)
  Abstrac:t  The Razor C lam ( S inonovacula constricta ) is one o f the m ost w ide ly cultured and valuable she llfishes
Two m ethods
w ere introduced and compared to am plify the comp le tem itochondr ia l genomes o f the Razo r C lam using LAPCR
One me thod was to
amp lify and sequence the genes of 16S and COI w ith un iversa l pr im ers
The tw o products o f am plification were ob tained, the leng th of
wh ich w ere 9
7 kb and 7
3 kb respec tive ly
The otherm ethod w as to design one pa ir of pr im ersw hich am plified thewho lem itochondr i
a l genom es
The length of the amp lification product was 17
1 kb
The first me thod was bette r in the practical operation and the se
quence w ork than the other one

Key words:  LAPCR S inonovacula constricta Comp le tem itochondria l genom e
收稿日期: 20081106
基金项目:国家 863!计划项目 ( 2006AA10A410) ,上海市重点学科建设项目资助 (Y1101) ,福建省海洋与渔业局重点项目 (闽海渔 2007015)
作者简介:郑润玲 ( 1985 ) ,女,山东临沂人,硕士研究生,专业方向为水产动物种质资源与种苗工程; Em ai:l rlzheng@ stm ail
shou
edu
cn
通讯作者:李家乐, Em ai:l jll@i shou
edu
cn
  长 PCR技术 ( LAPCR )克服了传统 PCR技术扩
增片段短、保真性低的缺陷, 可扩增 5~ 42 kb长的大
片段并且具有高保真性的特点,被应用于扩增线粒体
基因组 [ 1~ 3]。国内外学者应用长 PCR技术扩增出了
哺乳类 [ 4]、鸟类 [ 5]、爬行类 [ 6~ 8]、鱼类 [ 9~ 11]、节肢动
物 [ 12~ 15]等线粒体基因全序列,但有关软体动物仅见
国外学者有报道 [ 16~ 18]。
缢蛏 ( S inonovacula constricta )是具有重要经济
价值的海产软体动物,是我国四大养殖贝类之一,近
年来对缢蛏的分子生物学研究逐渐引起人们的重
视。前几年,对缢蛏分子生物学的研究方法主要集
中在同工酶电泳技术 [ 19, 20]和 RAPD技术 [ 21, 22 ]。随
着技术的进步, 线粒体 16S基因技术 [ 23]、COI基因
技术 [ 24]和微卫星技术 [ 25]等逐渐在缢蛏的分子生物
学研究中得到一些应用, 但主要集中在小分子作为
标记上。本文首次报道了应用长 PCR技术扩增缢
蛏线粒体基因组全序列的两种方法, 并对这两种方
法进行了比较,以填补国内用长 PCR技术研究软体
动物线粒体基因的空白。
1 材料与方法
1
1 细胞线粒体 DNA的提取
利用经改进的高盐沉淀法 [ 26]获得尽量完整的
环状线粒体 DNA。线粒体 DNA制备过程中尽量温
和混匀,避免环状线粒体 DNA的断裂。制备好的线
粒体 DNA用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测, - 70∀ 存
储备用。
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2009年第 4期
1
2 COI基因和 16S rRNA 基因的 PCR反应及
测序
用于 COI基因片段扩增的引物: CO IL1490 ( 5#
GGTCAACAAATCATAAAGATATTG3#和 COIH2198
( 5#TAAACTTCAGGGTGACCAAAAA ATCA3#) [ 27 ] ;
用于 16S rRNA基因片段扩增的引物为: 16SARL
( 5#GCCTGTTTATCAAAAACAT3#)和 16SARH ( 5#
CCGGTCTG AACTCAGATCACGT 3#) [ 28]。反应的模
板 DNA约为 100 ng,反应体系总体积为 50
,l其中
10 ∃ Ex Taq Buffer 5
,l dNTPs 2
l(各 2
5 mmo l/
L ), 引物各 1
l( 20
mo l/L ), Ex Taq酶 0
5
l( 2
U )。PCR反应条件: 94∀ 预变性 3m in; 94∀ 变性 30
s, 54∀ 退火 30 s, 72∀ 延伸 1 m in, 35个循环; 最后
72∀ 延伸 10m in。扩增产物经 1%的琼脂糖凝胶电
泳检测。PCR产物由上海英俊生物技术有限公司纯
化后双向测序。
1
3 引物设计
根据线粒体 DNA环状结构, 采用 Prem ier Prim
er 5
0软件包设计扩增全序列的引物。
1
3
1 在 COI基因与 16S rRNA基因两处分别设计
两对引物,扩增两基因之间的两个长片段  方法一遵
循引物设计原则,在 COI基因与 16S rRNA基因两处
分别设计引物。首先以 16S rRNA基因为起始端, 以
COI基因为末尾端设计一对引物 LBL ( 5#GTTT
GCGACCTCGATGTTGGATTAA3#); LBH ( 5#ATTTC
CAAACCCGCCTACCATCA3#);然后以 COI基因为起
始端,以 16S rRNA基因为末尾端设计一对引物 LCL
( 5#CAGGGTTAGTTGGGACAAGG TTA3#) ; LCH ( 5#
ATCACCGAGACAGATACTAC CACG3#)。
1
3
2 在 COI基因两端设计引物扩增整个线粒体
 方法二遵循引物设计原则, 在 COI基因两端设计
引物对 LCO IL ( 5#TGTTAGCGATGCCAGTTT3#) ;
LCO IH ( 5#AAGGAAGCAGCCAAAATC3#)。所设
计引物由上海生工合成。
1
4 长 PCR扩增反应
分别使用两种设计方法所得的引物扩增长
PCR。用于 PCR反应的酶选择 TaKaRa公司的 LA
Taq酶。反应体系: TaK aRa LA Taq ( 5 U /
l) 0
5

,l 10 ∃ LA PCR Buffer% ( M g2+ Plus) 5
,l dNTP
M ix true(各 2
5 mM ) 8
,l模板 DNA 2
5 ng, 引物
( 20
M )各 1
,l最后加灭菌蒸馏水至 50
l。反应
条件如下: 94∀ 1 m in, 30个循环为 98∀ 10 s, 引物
退火温度: LB为 66
5∀ ; LC为 60
2∀ ; LCO I为
52
0∀ , 30 s, 68∀ 15 m in。最后总延伸为 72∀ 10
m in。长 PCR反应产物用 0
8%的琼脂糖凝胶电泳
检测,在紫外透射仪下观察电泳结果。
2 结果
2
1 两对引物扩增所得缢蛏 COI基因与 16S rRNA
基因之间长片段
 1
引物为 LBL与 LBH 的 PCR产物; 2
引物为 LCL与 LCH的
PCR扩增产物。
图 1 两对引物扩增所得缢蛏 COI基因与
16S rRNA基因之间的长片段
在缢蛏的 COI基因与 16S rRNA基因两处分别
设计两对引物,扩增所得两基因之间的两个长片段,
结果如图 1所示。 0
8%琼脂糖凝胶电泳检测显示,
引物 LBL 与 LBH 扩增得到 PCR产物 1, 长度为
9
7 kb;引物 LCL与 LCH扩增 PCR产物 2,长度为
7
3 kb。
2
2 一对引物扩增所得缢蛏线粒体全序列长片段
在缢蛏的 COI基因两端设计引物扩增几乎整
个线粒体全基因组,结果如图 2所示。 0
8%琼脂糖
凝胶电泳检测显示,引物 LCOIL与 LCO IH扩增所
得长 PCR产物,长度为 17
1 kb。
图 2 引物 LCOIL与 LCOIH扩增所得缢蛏线
粒体几乎全基因组长片段
120
2009年第 4期 郑润玲等:两种缢蛏线粒体基因全序列扩增方法的比较
3 讨论
软体动物的线粒体全基因组研究起始于 1992
年 Ho ffmann等 [ 29]所做的紫贻贝 (Mytilus edulis )线
粒体的研究, 由于当时还没有长 PCR技术,只能使
用酶切后克隆测序的方法对全序列进行测序 。随
着 PCR技术的不断进步, 尤其是 LAPCR的出现,
使得近年来研究人员采用长 PCR方法扩增线粒体
全基因组成为可能。
本研究根据缢蛏线粒体环形结构的特点, 首先
使用某几个基因的通用引物扩增得到这几个保守性
较强的基因片段,双向测序后得到基因的碱基序列;
然后在这几个基因的两端碱基部分分别设计几对引
物,扩增这几个保守基因之间的未知片段。相关研
究,如 G rande等 [ 30]在研究一种腹足类动物 (Roboas
tra europaea )的线粒体全基因组时,使用的保守基因
为 16S rRNA基因和 12S rRNA基因, 分别得到两个
长度为 7
0 kb的 PCR产物。本研究获得的缢蛏线
粒体两个长片段产物 9
7 kb和 7
0 kb均比 Roboas
tra europaea的长,是不同物种的线粒体本身长度不
同,以及选取的保守基因不同造成的。
后一种方法是在缢蛏线粒体中的一个保守基因
两端碱基部分设计一对引物,扩增几乎整个线粒体
全基因组。 Serb等 [ 16]在研究淡水双壳贝 ( Lamp silis
ornata)的线粒体时使用 COI基因设计一对引物扩
增整个线粒体基因组,得到了长达 16
0 kb的产物。
Boore等 [ 17]研究掘足纲动物 (G rap tacm e eborea )的线
粒体时也使用了同样的方法,得到了长度为 14
5 kb
的产物。缢蛏整个线粒体全基因组的长度 ( 17
1
kb) ,与国外学者的研究结果相比较,显示双壳贝缢
蛏 ( S inonovacula constricta )与淡水双壳贝 ( Lamp silis
ornata)
[ 16]长度近似, 而与掘足纲动物 ( Grap tacm e
eborea )长度差距较大, 这是否表明双壳贝类的线粒
体基因组较掘足纲动物长,还需要进一步研究。
对长 PCR扩增线粒体全基因组的两种方法进
行比较后发现,两者都是使用通用引物扩增某个或
几个基因短片段,测序后在这个或这几个基因的两
侧设计引物,用来扩增全基因组。后一种方法虽然
只设计一对引物, 并且长 PCR反应也只进行一次,
与前一种方法相比减少了实验操作步骤, 但是在后
期的测序过程中, 长片段会比短片段要困难的多。
Boore
[ 31 ]认为使用较多的引物扩增短片段获得 2~ 3
个重叠区域会比一次性扩增整个线粒体序列要好的
多。而在缢蛏线粒体全基因组扩增的具体操作过程
中, 低于 10 kb的较短片在 PCR扩增时较易得到。
综合以上几种因素后认为, 使用长 PCR进行大片段
扩增时,进行几个片段的扩增而获得重叠区域会比
扩增整个线粒体序列要好些。
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21 李成华, 李太武, 宋林生, 等
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22 李成华,李太武,苏秀榕,等
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(下转第 134页 )
121
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2009年第 4期
0
6M NaC l渗透压稳定剂中, 4∀ 可保存 3 d左右, 3
d后发现原生质体悬浮液中出现粘性沉淀,镜检发
现原生质体已基本全部破碎,即使是没有破碎的原
生质体,其性状也与新鲜配制的有所不同,原生质体
的外膜变薄,内容物变混浊,所以用于转化的原生质
体必须新鲜配制。同时由于原生质体仅由双层脂膜
包裹, 易受到外界环境破坏,在再生过程中琼脂含量
应尽量低,以降低培养基对原生质体造成的机械损
伤 [ 9]。琼脂含量小于 0
6%时, 培养基过于稀软,常
温下难以凝固。因此, 最终采用 0
6%的琼脂含量
对原生质体进行再生。
参 考 文 献
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9 王建华,赵学慧.工业微生物, 2007, 37( 2) : 49~ 51

(上接第 121页 )
23 牛东红, 李家乐, 汪贵玲, 等
上海水产大学学报, 2007, 16
( 1 ): 1~ 6

24 牛东红, 李家乐, 沈和定, 等
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25 N iu DH, Li JL, L iu DB
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26 胡义德
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27 Folm er O, B lack M, H oeh W, et al
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28 S im on C, Frati F, Beckenbach A, et al
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29 H offm ann RJ, B oore JL, Brown WM
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30 G rande C, Tem p lado J, C ervera JL, et al
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31 Boore JL, M acey JR, M ed ina M
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134