全 文 ：健物杖术通报
· 技术与方法 · 刀了口了百日刀乙口 年增刊
利用 分子标记技术对芍药属植物栽培
品种的分类鉴定方法
索 ,志立
中国科学院植物研究所 系统与进化植物学国家重点实验室 , 北京 《 〕
摘 要 以利用 ! 分子标记逐级区分品种为主要研究目标 , 通过 引物的设计与实验筛选 , 取
得了进展 。 该方法类似于经典的植物形态检索表式的分类策略 , 不 同之处在于利 用基因组 分子性状作为品
种分类的依据 , 即“ 引物结合位 汽”与 “ 片段长度差异” 的组合信息。 该 方法不仅可 以有效鉴定 品
种 , 而且可 以很容易地生成富含遗传变异信息的 、 矩阵 , 通过运算揭示品种间的遗传关系与演化规律。 该方法
成本低廉、操作便捷 , 对于建立客观 、科学的牡丹及芍药品种分类体系 , 对于芍药属品种种质资源的保存 、评价与合
理利用具有重要价值 。 应该加大支持力度推进其实际应用 。
关键词 牡丹 芍药 栽培品种 标记 鉴定
勿
少玩乙 叮 肠 动 叮 叮 , 以 叮 ,
哪 、 , 咭 刃
肛 嗯 邵 却
, ,
甲 , 群 ,
, , !∀ ∀# ∃∀%∀∀ &∋ ()) ∗+ , − ∀, .% / / ∋∀ ,∀ % ∀∀ &∋ .− +0 ∋ ∀/ 1 2 3 ()) ∗ ∋, .脚entlength .This teehni卿e 15 notonly ab le to m ake efe etive identifiea-tion Of eultivat ed peony vari eties , b u t al s o e a s y t o g e n e ra t e a 0 an d 1 m a t ri x e o n t a i n i n g ri e h g e n e t i e v a ri a t i o n i
nfo
rm
a t
i
o n
fo
r
e o
m p
u t
i
n
g
a n
d re
v e a
l i
n
g
e v o
l
u t
i
o n 叼 re lationships among eultivat ed peony varieties. It15low 一e o s t a n d e a s y t o b e o p e ra t e d ,
an d h as
a n
i m P
o rt a n t v a
l
u e
i
n a s
p
e e t s o
f
e s t
ab l i
s
h i
n
g
o
bj
e e t
i
v e a n
d
s e
i
e n t
i fi
e s
y
s t e m fo
r
p
e o n
y
e u
l
t
i
v
ar
e
l as
s
i fi
e a t
i
o n a s w e
l l
a s e o n s e
rv at i
o n , a s s e s s
m
e n t
an d re
a s o n
ab l
e u t
i l i
z a t
i
o n o
f
e u
l
t
i
v
ar 罗rm Plas m resourees in 罗n us Pa eon ia L二 Th is ac h ie v e -
m e n t o u gh t to b e su p卯rted finaneial ly at a la铭er seale fo r tra nsfo rm ation into apPlieation .
K ey w o rd s : T ree peony H erbaeeou s p eony C u ltivated vari ety ISS R m arker Iden tifi eati on
牡丹为芍药科(paeoniaeeae ) 芍药属 (几eonia
L.)牡丹组 (Se ct . Mo ut an )落叶灌木 , 芍药是芍药属
(几eonia L.)芍药组(Seet. Pa eon衍)的多年生草本
植物 , 均为重要的城市园林绿化观赏植物和资源植
基金项目:国家自然科学基金项目(304 7017 ) 、中国科学院知识创新工程重要方向性项目(Ks cxZ 一 s w 一 10 8 ) 、国家科技支撑项 目“ 林木 、花卉
基因资源发掘与种质创新利用研究” ( Z o 6 B A D1 3 BD 7 ) 、林业科技支撑计划专题项 目(2以拓 B A D2 6 BD 101 )及北京市科技新星计
划(20 5 B32 )
作者简介:索志立( 1964 一 ) , 男 , 博士 , 主要从事园艺植物学 、系统与进化植物学研究 (E 一 m al : 击uo @ ibc as .ac .。n )
生物技 术通报 B 勿te ch n 口勿舒 2008 年增刊
物〔‘一 ’4 〕。 目前约有 16% 个 中国牡丹观赏品种和
40 0 多个芍药品种 , 在 2 0 0余年的人工栽培和观赏
利用过程中产生了丰富的遗传变异 , 一 ’9] 。 但实际
商业流通中只有约 20 个品种 。 主要原因在于品种
资源缺乏整理 , 或由于经济条件所限得不到大量繁
殖 , 形不成产销规模 。 品种的来源记载不详、品种间
相似性较高以及同物异名和同名异物现象等 , 导致
了市场的不规范 , 影响了牡丹 、芍药花卉市场的正常
交易和经济规模的增长 。 为了适应 国际市场需求 ,
迫切 需 要 品种 鉴 定 的标准化 、 规 范化 和 国际
化[3一 , 〕。
在 D N A 水平上的分类和遗传多样化研究方面 ,
利用核基因 IT S 、叶绿体基因 Ina tK 、 A dh 以及核基因
编码 、 叶绿体表达 的三磷酸甘油 酸酞基转移酶
G PA T ( glyeerol一3 一p h o s p h at e a e y l t ra n s fe r a s e g e n e ) 基
因序列 、 非编码区 Ps bA 一t m H 和 trn L 一t o F 间隔区
D N A 序列 , 研究芍药科野生种的系统发育关系的工
作已有报道〔’0 , 川 。 然而 , 上述基因序列和非编码区
D N A 序列在芍药属内种间的分化已经很小 , 在品种
水平上没有分辨率。 而 D N A 指纹技术(如 RA PD 、
A F 廿 、 Is s R 分子标记技术)在种和种下分类等级上
非常有效[”〕。 H o s o k i 等(2997 )和邹喻苹等(1999 )
利用 R A PD 标记技术对牡丹品种和野生种进行了尝
试性分析[” , ’4 〕。 朱红霞(2004 ) 利用 A FLP 标记对
牡丹 、芍药品种分类进行了探索【川 。 王森等(20 7 )
讨论了芍药品种的IS R 一 P c R 反应条件【’6 ] 。 利用花
粉形 态特征 的研究 主要 局限 于芍药属 的野生
种〔” , ’8 〕。 由于取样量少或性状本身变异较小 ,仍处
于研究手段的探索阶段 , 尚难以全面地揭示品种间
的遗传关系和演化规律【”〕。 本项 目组利用 DN A Is -
sR (Inter一s i m p l 。 s e q u e n e e R e p e a t S ) 分子标记技术分
析了 8 个中国牡丹品种 , 比较了叶形态性状和 D N A
Is sR 分子性状生成的两类品种间遗传关 系的异
同[z9 〕, 在 D N A 分子水平上证实存在紫斑牡丹 Pa co -nta ro ekii(5. G . H aw & L. A . La uener) T. H ong et
J. J. Liex D . Y . H ong 和凤丹 ( 杨IJ 牡丹 ) p . os -
tiiT . H ong & J. X . zhang 参与中原牡丹品种起源
的途径 [’o , ” l , 设计和筛选了新的 xssR 引物〔” ] 。 本
文报道利用 D NA IS R 分子标记鉴定牡丹和芍药品
种的最新研究进展 。
1 材料与方法
1.1 材料
以遗传上有代表性的牡丹和芍药品种为供试材
料 , 以牡丹和芍药的野生种作为对照材料 。 图 1 中
的泳道号与表 1中的芍药品种样品号对应 。 图 2 中
的牡丹样品名称与本项 目组 2006 年发表的文献[”〕
中的表 1对应 。
表 1 图 1 中对应的32 个芍药品种样品
样品号 名 称
冰山紫玉 p . lact 尹ora ‘ B i n s h a n 2 1 Y u ’
苍龙 尸. 阮t如ra ‘ C an g 助ng ’
晨曦 p. lac t沙ra ‘ C h e n x i ’
垂头红 p . lact沁ra ‘ C h u i T a O H o n g ’
春晓 p. lac :沁ra ‘ C h u n x i a 。’
大富贵 p. lac t尹。ra ‘ D a F u G ui ’
东方红 p . lac r尹ora ‘ D o n g F an g H o n g ’
粉盘藏珠 p. lac t尹ora ‘ F e n p an C a n g z h u ’
粉珠盘 p . la ct沁ra ‘ Fe n zh u P an ’
凤羽落金池 p. lac r如ra ‘ r e n g Y u L u 。 J in e h i ’
富贵红 p . lact 沙ra ‘ F u G u i H o n g ’
红绩赤金 p . lac t和ra ‘ H o n g L i n g e h i J i n ’
湖水荡霞 尸. lac t沙ra ‘ H u sh ul D an g 兀a ’
蝴蝶戏金花 p. laer沙ra ‘ H u D i e x i J i n H u a ’
锦旗耀银辉 p. lact和ra ‘J i n g Q i Y a o Y i n H u i ’
玲珑玉 尸. 1二t沙ra ‘ Li ng 肠ng Y u ’
美人面 p . lac t尹ora ‘ M e i R e n M i a n ’
平顶红 P . laC r和ra ‘ P i n g D i n g H o n g ’
奇花露霜 p .阮t尹ora ‘ Q i H u a L u S h u an g ’
巧灵 P . laC 忿必ra ‘ Q i a o L i n g ’
庆云红 p. l二t亦ra ‘ Q i n g Y u n H o n g ’
沙金贯顶 p . lac t如ra ‘ S h a J i n G u a n D i n g ’
双红楼 p. lac r必ra ‘ S h u an g H o n g Lo u ’
桃花飞雪 p. lact 咖ra ‘ T a 。 H u a F e i x u e ’
团叶红 尸· la ct 尹。ra ‘ T u an Y e H on g ’
乌龙集盛(俗名 :铁秆紫) 尸. lac :尹ora
‘
W
u 肠ng Ji Sheng’ ( o r ‘ T i e G a n 2 1 ’ )
向阳红 p . la e忿和ra ‘ 芜an g Y an g H ong ’
杨妃出浴 尸. la ct和ra ‘ Y an g Fe i c h u y u ’
银线绣红袍 p. lact 沁ra ‘ Y i n X i a n x i u H o n g P a 。 ’
枣红 p . lac r诉ora ‘ z ao H o n g ’
赵园红 p . lac t尹ora ‘ z h a o Y u an H o n g ’
种生粉 p , l ac t沙ra ‘ z h o n g S h e n g F e n ’
123465798101234巧6
了0901,乙,勺白一丹、门
注 :表1 中的芍药品种均来自菏泽 。 赵孝庆 、孙文海 、赵弟敏 、孙
学良协助鉴定品种名称 , 陈富飞 、孙朋也参加了调查和样品材料的采
集
1.2 方法
利用天根生物技术公司(Tiangen Bioteeh (Bei-
年增千IJ 索志立:利用 D N A IS R 分子标记技术对芍药属植物栽培品种的分类鉴定方法 1 11
jin g ) C o. Lt d ) 的植物基 因组 D N A 提取试 剂盒
(D P3 05 )从硅胶干燥好的叶片中提取各供试样品的
gD NA 。 Is s R 一Pc R 扩增实验条件同本项 目组以前的
报道〔, , 一 ’2 ] 。 I s s R 引物 (eT )sR e (Tm = 50℃ )由魏
伟老师通过刘文胜博士馈赠 , 是加拿大的不列颠哥
伦比亚大学 ( The U nivers ity of Bd tish Colum bia )公
布的 U BC ISSR prim er 845# 。 引物 (G GC )2 (A C )7
(Tm 二 53 ℃ )为自己设计。 上海生工公司合成引物 。
利用 Q uantity o ne 软件计算 ISSR 条带分子量 。
图 l 引物(C T )SRG 得到的 32
gD NA 扩增结果
图 l 、2 中的 M 是同样的 10 帅 DNA
个芍药品种的
图 2 引物(G G C ) 2 (A C ) 7 得到的32 个牡丹
样品的 gD NA 扩增结果(转引自文献〔32〕)
2 结果与讨论
在前期工作的基础上 , 将利用 D N A IS R 分子
标记逐级区分芍药属栽培品种确定为主要研究 目
标 。 通过 IS R 引物的设计与实验筛选 , 取得了进
展 , 实验证实 IS R 分子标记是研究芍药属品种分类
鉴定的难得的有效工具 。
在图 l 中 , 引物 (CT )SRG 产生的 l00() bp 长度
的 IS SR 片段标记将 ‘种生粉 ’ 从其它芍药品种中区
分了出来 , 7 0 帅 长度的 IS R 片段标记将其余的 31
个芍药品种分为两大群:第一大群包括 28 个芍药品
种 , 即 1 = ‘冰山紫玉 ’ 、 2 = ‘苍龙 ’ 、 3 = ‘晨曦 ’ 、 4 二
‘垂头红 ’ 、 5 二 ‘春晓 ’ 、 7 = ‘东方红 ’ 、 8 二 ‘粉盘藏
珠 ’ 、9 二 ‘粉珠盘 ’ 、 ro = ‘凤羽落金池 ’ 、 H = ‘ 富贵
红 ’ 、 12 = ‘红续赤金 ’ 、 13 = ‘湖水荡霞 ’ 、 14 = ‘蝴蝶
戏金花 ’ 、巧 = ‘锦旗耀银辉 ’ 、 16 二 ‘玲珑玉 ’ 、 17 =
‘美人面 ’ 、 18 二 ‘平顶红 ’ 、 19 = ‘奇花露霜 ’ 、 20 二
‘巧灵 ’ 、21 = ‘庆云红 ’ 、 23 二 ‘双红楼 ’ 、 24 二 ‘桃花
飞雪 ’ 、25 = ‘团叶红 ’ 、27 = ‘ 向阳红 ’ 、28 = ‘杨妃出
浴 ’ 、29 = ‘银线绣红袍 ’ 、 30 = ‘枣红 ’和 31 = ‘赵园
红 ’ ; 第二大群包括3 个芍药品种 , 即 6 = ‘ 大富贵 ’ 、
2 2 =
‘沙金贯顶 ’和 26 = ‘乌龙集盛 ’ 。 该引物产生
的 65 0bp 长度的ISSR 片段标记将第一大群的 28 个
芍药品种进一步分为两个小群:第一小群包含 8 个
芍药品种 , 即 1 = ‘冰山紫玉 ’ 、 2 二 ‘苍龙 ’ 、 5 = ‘春
晓 ’ 、 1 = ‘富贵红 ’ 、 15 = ‘锦旗耀银辉 ’ 、 17 = ‘美人
面 ’ 、2 4 = ‘桃花飞雪 ’和 25 二 ‘ 团叶红 ’ ; 第二小群
包含 20 个芍药品种 , 即3 二 ‘晨曦 ’ 、4 = ‘垂头红 ’ 、 7
二 ‘东方红 ’ 、8 = ‘ 粉盘藏珠 ’ 、 9 二 ‘粉珠盘 ’ 、 10 =
‘凤羽落金池 ’ 、 12 = ‘红绩赤金 ’ 、 13 = ‘湖水荡霞 ’ 、
14
= ‘蝴蝶戏金花 ’ 、 16 = ‘玲珑玉 ’ 、 18 二 ‘平顶红 ’ 、
19
二 ‘奇花露霜 ’ 、20 = ‘巧灵 ’ 、 21 二 ‘庆云红 ’ 、23 =
‘双红楼 ’ 、 27 二 ‘ 向阳红 ’ 、 28 = ‘ 杨妃出浴 ’ 、 29 =
‘银线绣红袍 ’ 、 30 = ‘枣红 ’和 31 = ‘赵园红 ’ 。 引
物 (CT )SR G 产生的这三个 IS R 标记精确地对 32
个芍药品种初步进行了逐级区分 。 全部区分所有的
芍药品种只需要增加具有类似分辨效果的 IS R 引
物类型的数量 。
图 2 中的牡丹样品号与本项 目组 2006 年发表
的文献 〔’2〕中的表 1 的牡丹名称对应 。 在图 2 中 , 引
物 (G G C ) 2 (A C ) 7 产生的 270bp 长度的 ISSR 片
段标记 , 将牡丹组肉质花盘亚组 sub sec t. De la va ya -
na e Stern 的大花黄牡丹 P. ludlo、11 ( S te rn & T 叮lor)
D · Y . H o n g 和滇牡丹 p. delavayi Franeh 与革质花
盘亚组 sub se ct . 伦gina ta o St ern 的牡丹野生种和品
种区分为两大类 , 与形态分类结果一致 ;该引物产生
的 240bp 长度的 ISSR 片段标记将牡丹品种 ‘枫叶
红 ’从革质花盘亚组的牡丹样 品中单独区分了出
来 , 逐级分辨效果十分显著 。
上述这样的 IS R 引物种类数量足够多时 , 不仅
健物技术通报 B 勿te ch no 勿gy B “le 血 2008年增刊
可以有效鉴定品种 , 而且可以很容易地利用软件计
算电泳条带分子量 , 生成富含遗传变异信息的 0 、 1
矩阵 , 通过运算可揭示品种间的遗传关系与演化规
律 。 为了获得可信的分析结果 , 电泳胶图中目测判
读没有把握或没有区分能力的 IS R 片段应该全部
舍弃。 该分类方法类似于经典的植物形态检索表式
的分类策略 , 不同之处在于利用基因组 D NA 分子性
状 , 即“ I S R 引物结合位点”与“ D N A I S R 片段长度
差异 ” 的组合信息 。
牡丹和芍药品种分类鉴定用 D NA IS R 指纹图
谱一旦建立 , 将是一个成本低廉、操作便捷的品种鉴
定系统 。 该方法对于建立客观 、科学的牡丹和芍药
品种分类体系 , 对于芍药属品种种质资源的保存 、评
价与合理利用具有重要价值 , 应该加大支持力度 , 推
进其实际应用 。
感谢 :本项 目亦为与山 东省菏泽市牡丹 区人民政府协作项 目
的一部分 , 在实施过程中, 得到菏泽市各级有关领导的关心
和大力支持。 菏泽市曹州牡丹园、 曹州百花园以及兰州和平
牡丹园的领导和技术人员对本项 目给予了鼎力协助 。 赵建
朋 、赵孝崇、赵弟杰 、赵弟占、刘爱青 、赵信勇、王汝昌 、赵弟超
等牡丹技术员指导鉴定曹州牡丹园的牡丹 品种并协助调查
和采集叶片材料。 孙景玉 、孙文海指导鉴定曹州百花园的牡
丹品种 。 陈德忠指导鉴定兰州和平牡丹园的牡丹样品材料 ,
陈富飞 、 陈富慧、陈德仁 、 陈德义 、施林军等协助调查和采集
叶片材料 。 中科院植物研究所邹喻苹研究员、周世良博士 、
鲁迎青博士 、魏伟博士热情指导 IS R 实验并慷慨债蜡 IS R
引物等供实验筛选 , 李利华主任、 张治 明研究员、钱伟博士 、
张富民博士以及中科院北京华大基因研究中心孙海波 、丛丽
娟老师对本项 目给予热情支持 , 张志宪老师 、冯灵博士 、温洁
博士 、刘 文胜博士对本项 目给予热情协助 。
参 考 文 献
H ong DY , P 田1 K Y , N
J
Th
rl
a n
d
.
Sc
i
e n e e 阮55, B e ij i n g/ M i s s o u ri
B
o t a n i
e
al G ar d
e n
P
r e s s ,
S t
. 助uis , 2 (X) 1 , 6 : 2 7 一 1 3 0 .
H o n g D Y , P an K Y
,
NJ Tu
rl an d
.
Sc i
e n e e
P re
s s ,
B
e
ij
i
n
g/
M i
s s o 硕
Botanieal Gald en Pre ss, S t . 肠uis , 2 (X) 3 , 6 : 1 1 8 一 1 2 2 .
王莲英. 中国牡丹品种图志 (中国花卉协会牡丹芍药分会). 北
京:中国林业出版社 , 1 9 7 , 1 一 21 4 .
王莲英 , 袁涛. 中国牡丹与芍药.北京:金盾出版社 , 1 9 更〕, 1 一 79 ·
李嘉压. 中国牡丹与芍药. 北京 :中国林业出版社 , 1 9 9 , 1 -
2 6 1
.
李嘉压. 中国牡丹品种图志 (西北 · 西南 · 江南卷 ). 北京:中
国林业出版社 , 2 0 5 , l 一 2 06 .
7 韩建新 (主编).菏泽牡丹大鉴. 北京:光明日报出版社 , 2 0 3 , 1
~
4
9.
8 洛阳市地方史志编纂委员会. 洛阳市志第 16 卷 牡丹志. 郑州:
中州古籍出版社出版 , 19 98 , 1 一 2 8 4.
9 陈德忠. 中国紫斑牡丹. 北京 :金盾出版社 , 2 0 3 , 1 一 9 6 .
ro 陈德忠 , 索志立 , 陈富飞 , 等.武汉植物学研究 , 2 以场 , 24 ( 6 ) :
5 5 1
一 5 5 8
.
n 中国牡丹全书编纂委员会. 中国牡丹全书. 北京:中国科学技
术出版社 , 2 0 2 , 1 一 106 3 .
12 陈让廉. 铜陵牡丹. 北京:中国林业出版社 , 2 (X) 4 , 1 一 1 3 2.
13 秦魁杰 , 李嘉压 . 芍药. 上海:上海科学技术出版社 , 2 0 (X) , 1 -
1 2 5
.
14 索志立 , 李利华 , 赵孝庆 , 等. 云南农业大学学报 (自然科学
版) , 2 (X) 6 , 2 1 ( 3 A ) : 1 5 1 一 l 6() .
巧 喻衡 (编著). 中国名花丛书一牡丹 (余树勋主编).上海:上海
科学技术出版社 , 1 9 98 , 1 一 1 09 .
16 陈富慧 , 索志立 , 赵孝庆 , 等. 东北林业大学学报 , 2 0 5 , 3
(
6
)
:
5 5
一 6 1
.
17 郭先锋. 中国芍药分类学研究进展. 北京林业大学学报 , 2 0 2 ,
24 (
3
)
:
9 9
一 1 0 2
.
1 8 S u o , 2
.
L
. ,
X
.
Q
.
Zh ao
,
J
.
Y
.
S
u n , et al
.
H
o rt
sc i
e n e e ,
2 《叉)6 , 4 1
(
7 )
:
1 5 2 9
一 1 5 3 0
.
1 9 S u o , 2
.
L
. ,
X
.
Q
.
Z h ao
,
J
.
P Z h ao
,
e
t
al
.
H
o
rts
e
i
e n e e
,
2
(X)
8
,
4 3
(
2
)
:
5 3 2
一 5 3 4
.
2 0 赵宣 , 周志钦 , 林启冰 , 等. 植物分类学报 , 2 0( 拼 , 4 2 ( 3 ) : 2 36
~
2
4
.
2 1 P an J
,
Z h an g D M
,
S
an
g T A m
e r
J B
o t
,
2
(X)
7
,
9 3
:
4
(X)
一
4(} 8
.
2 2 邹喻苹 , 葛颂 , 王晓东. 系统与进化植物学中的分子标记. 北
京:科学出版社 , 2 (X) 1 , 1 一 2 6 .
2 3 H o so k i T , 儿m ura D , H as e g a w a R , e t al . J . J a p an e s e S oc . H o rt i -
e u
l t
u r
al S
e
i
. ,
1 9 9 7
,
6 (
2
)
:
3 9 3
一 4 0
.
24 邹喻苹 , 蔡美琳 , 王子平. 植物分类学报 , 1望列〕, 37 ( 4) : 2 双) 一刀7.
25 朱红霞. 牡丹 、芍药品种 D N A 指纹图谱绘制的初步研究. 北京
林业大学硕士论文 , 2 以抖 , 1 一 68 .
26 王森 , 于恒秀 , 龚志云 , 等. 扬州大学学报 (农业与生命科学
版) , 2 (X) 7 , 2 8 ( 2 ) : 7 8 一 8 2 .
27 席以珍.植物学报 , 1 9 84 , 26 : 2 41 一 24 6 .
2 8 袁涛 , 王莲英.北京林业大学学报 , 2 0 2 , 2 4 ( l ) : 5 一 1 .
2 9 Z h i一1 1 S u o ,
We
n
一
y i n g L i
,
J
u a n
Y ao
, e t al
.
H
o rt
sc i
e n e e ,
2
(X)
5
,
4 0
(
2 )
:
3 2 9
一 3 3 4
.
3 0 索志立 , 周世良 , 张会金 , 等. 林业科学研究 , 2 0 0 4 , 17 ( 6 ) :
7 (洲〕一 7 0 5 .
31 索志立 , 张会金 , 张治明 , 等 , 云南植物研究 , 2 0 5 , 2 7 ( 1 ) : 42
~
4 8
、
3 2 索志立 .牡丹品种鉴定用 IsS R 引物的筛选与开发. 生物技术通
报 , 2 (X) 6 , 增刊:342 一 3 4 6 .