全 文 ：生物技术通报
· 技术与方法 · 百付口工口 年增干
果树胚挽救技术育种研究进展
高清华 叶正文 殷丽青 郑宏清
上海市农业科学院林木果树研究所 , 上海 上海市设施园艺技术重点实验室 , 上海
摘 要 胚挽救技术在果树育种上的应用研究进展作了综述 , 并对应用中可能出现的问题 , 如胚龄、 培养基
和培养条件等进行了分析 , 初步提出 了胚挽救技术培育果树新种质应用方 面的不足和研究热点 。
关键词 果树 胚挽救 育种
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K ey W o rd s : F ru it E lnb 口0 reseue B re ed ing
植物胚是一个具有全能性的多细胞结构 , 其来
源有两种 :有性的合子胚 , 无性的体细胞胚或不定
胚 。 胚在适宜条件下能完全发育成熟 , 播种后 可直
接长成完整植株 。 但是 , 果树上一些常用的育种方
法如远缘杂交 、 二倍体 (母本)与四倍体(父本)杂
交 、 以早熟品种作杂交母本及柑桔育种中 , 获得的合
子胚常常在发育早期就出现败育或退化的现象。 胚
早期退化现象对于果树栽培来说是一个优良特性 ,
能够获得无籽果实;但对育种而言是一个不 良的特
性 , 会使育种效率降低川 。 通过胚挽救技术使败育
或退化胚 , 经过适宜的培养条件获得再生植株 。 本
文对胚挽救技术在果树育种上的应用作以综述 。
1 胚挽救技术
胚培养与胚挽救二者之间是有区别的 。 胚培养
包括的范围更广 , 如快速成苗 、打破休眠 、检测种子
活力等 。 Tu rk ey 进行的樱桃胚培养工作是果树胚培
养历史上的开端 。 而胚挽救技术是通过对因营养
和/或生理因素造成难以播种成苗或在发育早期就
败育或退化胚进行的早期离体培养 。 胚挽救是胚培
养的主要内容 。
有关胚挽救技术 目前已报道的方法主要有 3
种 :l) 活体转移;2 )活体培养;3) 离体培养 。 其中胚
早期离体培养技术应用最广泛 , 幼胚 、败育或退化胚
均能通过这种方式再生成植株 , 再生效率主要受胚
龄 、激素配比和培养基的成分的影响 。 不同的果树
种类 , 胚龄对通过胚挽救技术获得高的成苗率的影
响差异较大 。 胚挽救技术是果树早熟育种 、无籽育
种 、多倍体育种及远缘杂交育种工作中所采取的有
效方法之一 , 已经在早熟桃川 、杏〔’〕、樱桃 、葡萄〔‘〕、
柿【’〕、草幕 、柑橘等果树新品种选育科研中取得突
破 [6]。
作者简介:高清华(19 72一 ) , 男 , 助理研究员 , 主要从事草墓和桃种质创新及其设施栽培生理研究 , E 一m al : q h g a o 2 0 3 38 @ y ah o . co m . cn
盆物技 术通报 B to te ch n ole gy 200 8 年增刊
2 胚挽救技术在果树育种上的应用
2.1 挽救发育不良或早期退化胚 , 培育早熟品种
在以桃为模式果树的核果类果树早熟性育种过
程中 , 桃的极早熟品种或早熟品种的果实发育期常
常较短 , 在胚发育的早期就会败育 , 从而难以通过正
常的方法获得成苗 。 早熟胚离体胚挽救技术可以克
服这种困难 , 有效提高早熟品种的成苗率 , 从而提高
育种效率。
我国在近 30 余年内应用离体胚挽救技术已经
成功地培育出一大批果实生长发育期短于 60 d 的极
早熟桃品种 , 如京早 3 号 、春蕾、春花 、早花露 、早霞
露 、玫瑰露 、丹墨 、早红霞等〔’] 。
2
.
2 培育无核 (籽 )果树新品种
利用胚挽救技术培育无籽果实的果树新品种 ,
最为成功和应用最多的果树是无籽葡萄。 利用常规
有性杂交手段难以选用无籽葡萄品种作为母本 , 实
践证实以有籽葡萄品种作为杂交母本 , 其后代中获
得无籽类型的比例常常较低 。 胚挽救使早熟品种及
假单性结实(主要是葡萄 )的无籽品种作为杂交母
本成为可能[8]。 G ra y 等(1987 )[’] 以抗病无籽葡萄
品种 O rlan do 作母本与优质无籽品种 A rk an sas l105
杂交 , 取花后 40d 和 60 d 的胚珠进行培养 3 个月后 ,
再将抗病幼胚进行接种培养 , 结果获得了抗病杂种
优系 ;以后 eantoi等( 1993 )[’o 〕在前人研究的基础
上 , 取 H ul Th o司es s等三倍体品种授粉 28 d 后的幼
胚进 行 胚 挽 救 , 获 得 了再 生植 株 。 郭海 江 等
(20 05 )[ 川 以欧洲葡萄无核品种为母本 , 中国野生葡
萄双优 、欧山杂种北醇及 8 个欧洲葡萄品种为父本
共进行了 16 个组合的杂交 , 通过胚挽救技术获得胚
挽救苗 5 个株系 。 借助于胚挽救技术 , 利用特早熟
桃与特早熟桃杂交培育特早熟桃类型也取得了很大
进展 , 刘文等(20 7 )[ ” ]以桃为母本 , 与经过处理的
李 、杏花粉进行远缘杂交 , 应用离体幼胚挽救技术获
得成功 , 并对部分杂种进行了分子鉴定 。
2
.
3 克服远缘杂交不亲和 , 培育果树新品种
远缘杂交主要是利用野生种和野生近缘种的优
异抗性基因遗传背景 , 将其整合到优质栽培品种或
将不同种属来源的优良基因杂交重组以便获得优质
多抗的果树新品种的途径 。 植物幼胚败育是植物远
缘杂交及多倍体育种过程中经常出现的一种现象 ,
造成这种败育的原因大致可归纳为七类:胚囊发育
异常 、胚乳发育异常 、幼胚起源 、营养供应失调 、内源
激素 、酚类物质 、某些酶失活及基因调控等方面〔”〕。
因远缘杂种胚胚与胚乳的发育不协调 , 往往导致杂
种胚的败育 , 因此 , 在杂种胚败育前尽早进行杂种胚
挽救是获得远缘杂种新种质的重要途径〔‘4 〕。 刘焕
芳等人(20 4 )〔” 1 以中国樱桃和甜樱桃种间杂交胚
为试材 , 借助胚挽救技术手段 , 研究了幼胚萌发与生
长 、丛芽诱导与分化及生根的最佳培养基配方 , 并成
功地将一批杂种胚培苗定植于大田 。
将远缘杂交获得的杂种胚进行挽救能够提高获
得杂 种 植 株 成 苗 的 比 例[’〕。 G o l d y 等 ( 1955 ,
1
98 9)
〔’6川分别以真葡萄亚属无籽品种和有籽品种
作母本与圆叶葡萄杂交 , 取授粉 6 周后的幼胚进行
了挽救 , 结果分别获得了 19 株和 52 株杂种苗 。 美
味称猴桃海沃德新西兰果树科研工作者育成的优良
品种 ,其主要缺陷在于维生素 C 含量偏低 , 为选育
出含有高维生素 C 含量的称猴桃品种 。 毋锡金等
(19 0) 【’8 〕将海沃德与维生素 c 含量高的野生毛花
称猴桃进行杂交 , 成熟种子有 50 % 退化 ;通过胚挽
救技术使幼胚成苗率提高到 65 % 。 胚挽救技术在
幼胚发育的早期进行接种培养并最终获得成苗 , 在
克服种间远缘杂交中胚败育有重要的利用价值。
2
.
4 进行合子胚挽救培育三倍体
三倍体柑桔因其无籽 、果大 、高抗等优异性状 ,
一直是柑桔育种的重点方向。 获得三倍体柑桔的途
径较多 , 其中利用二倍体与四倍体杂交获得聚合优
良性状的三倍体是最有效途径之一[6〕。 由于柑桔
属及其野生近缘种的种子大都存在珠心胚现象 , 这
会直接导致受精胚的退化或败育 , 大大降低了柑桔
的育种效率。 为克服多胚性干扰 , 柑桔离体胚挽救
技术是提高育种效率的有效途径 。 O ht a 等(19 57 )
首次报道培养小于 3m m 的柑橘胚获得成功 , 但他们
研究发现 , 以多胚性品种为母本获得的成熟种子 , 实
生后代中杂种苗的 比例一 般都较低 。 邓秀新等
(19 6) [”〕以甜橙和温州蜜柑为母本所获得的有性
后代中 , 杂种苗比例约占7.24% ;而 以碰柑为母本
获得的 259 株实生苗中竟无一株杂种后代 。 可见 ,
利用胚挽救技术培养柑桔品种间 、种间 、种属间杂交
后代的幼胚 , 杂种植株的比率大大提高 。 黄志文等
年增刊 高清华等:果树胚挽救技术育种研究进展 1 15
(198 1) [’。]以温州蜜柑授粉后 lood 左右的幼胚为试
材进行离体胚培养 , 结果发现再生植株中合子胚来
源的比例达 40% 一 6 0 % 。 王元裕等(195一) 〔” 了以酸
橙授粉后 10 5d 的幼胚为试材进行离体胚挽救 , 植株
再生率在76 % (球形胚 , 小于 0.3 m m )至 98 % (早
子叶胚 , 0 . 8 一 2 . o m m ) 之间。
3 胚挽救技术成功应用于果树育种实践的
影响因素
众所周知 , 胚发育是一个自养和异养的动态过
程 。 异养阶段的胚较小 , 需要外源营养及生长调节
物质才能满足发育的需要;而进入自养阶段 , 胚的发
育主要依赖于自身养分的贮存和累积 。 此外 , 果树
不同种类和品种的幼胚离体培养所需要的养分配比
和培养条件有差异 , 胚挽救时宜分别对待。
3
.
1 胚龄
胚龄与胚萌发后获得的成苗率呈正相关 , 不同
发育时期的幼胚 , 离体培养成功率差异很大 。 若取
材过早 , 如合子胚为球形胚 , 则完全为异养 , 离体培
养所需的营养及条件要求复杂 , 因幼胚未完全分化
难以萌发 , 很难培养成功 , 因此取材过早进行胚培养
常常会导致夭折仁” ] 。 果树幼胚适宜培养时期的确
定是随着胚挽救技术的完善而不断变化的 。 如早熟
桃的胚挽救 , 传统方法是将种胚长与鲜重作为判断
是否进行离体培养的指标 , 认为桃胚的发芽能力一
般与它的大小成正相关关系 , 果实发育期短于 75d
的早熟桃种子 , 由于种胚过小一般难以发芽仁2, 〕。
R a m m i n g ( 1 9 9 0 )
[”〕在 20 多种桃基因型 中发现 , 桃
胚(胚珠)的干重为胚 20 m g(胚珠 38 m g) , 胚干重/
鲜重为 9% 一 10 % , 胚挽救效率最高;如小于 sm m
长的桃胚 , 成苗率仅32 % 。 以四倍体柑桔为父本与
单胚的二倍体类型杂交 , 授粉后 80d 是三倍体幼胚
最适宜的离体培养时期 , 此后退化幼胚培养成活及
成苗率均呈下降趋势川 。
3
.
2 培养基和培养条件
不同果树种类的幼胚培养所需的基本培养基常
常会有些不同 , 培养基及其附加成分的不同 , 会直接
影响幼胚离体胚挽救的成苗率 。 筛选比较不同果树
种类合适的基本培养基是胚挽救技术的关键环节 ,
不同发育时期 、不同品种的果树需要的培养基各不
相同 。 K a n t h ar aj a h 等(r992 )[24 )以 M s 、 M T 作基本
培养基进行柑桔 、称猴桃的离体胚挽救效果较好;
M onnier、 w P 、 e Z d 、 s H 和 w hit。 基本培养基则较适
合桃 、李等核果类果树的胚挽救。 在 CZd 、 S H 和 W P
培养基中培养早熟桃品系 K2 42 一 45 幼胚 , C Z d 效果
最好 , 而杏幼胚在这三种培养基中成苗情况均较理
想[”] 。 极早熟桃胚珠适合在高浓度盐分并含有一
定 量 的 按 态 氮 的 培 养 基 上 培养 。 C ari mi 等
(19 8) [’6 〕在柑桔幼胚培养中添加适量的麦芽提取
物会使成苗率大大提高。
环境条件对离体胚的发育非常重要 , 常常因果
树种类不同、其对培养基的酸碱度 、光照 、温度等条
件的要求也会有所不同。 通常胚培养所用 pH 值的
范围为5.5 一 6 . 3 。 由于胚在胚珠内发育是不见光
的 , 一般认为在黑暗或弱光下培养幼胚比较适宜 。
碳水化合物能提供幼胚发育所需的能量及增强培养
基的渗透压 , 是培养基中不可或缺的营养成分 。 一
般来说 , 在胚挽救的开始阶段和胚珠培养中 , 蔗糖起
始浓度宜高些 。 桃幼胚及胚珠在含蔗糖 6% 、 ro %
和 12 % 的培养基中生长比较迅速 , 胚干重增加 2 一 3
倍 , 而在 2% 蔗糖浓度的培养基中则无反应占27 , 2 8 〕。
而 1.5% 一 3 . 0 % 的蔗糖对柑桔的幼胚培养比较适
宜[‘] 。
3
.
3 激素水平
一些生长调节剂也在胚挽救中也起着至关重要
的作用 。 w a n g D ( 1 9 8 4 ) [”]以草毒幼胚为试材进行
离体培养 , 结果在不添加任何激素的 M S 培养基上
仅诱导出结构松散的愈伤组织 ;在含有 2 , 4 一 D S -
加m 岁L 或 B A 0.sm梦L 的 M S 上 , 能诱导成胚形成
组织 , 最终发育成体细胞 , 在含有酪蛋白水解产物下
形成体胚及组织的频率最高 。 一般地 , 较低浓度的
细胞分裂素可促进胚正常生长 , 而高浓度或抑制生
长或促进胚形成非器官性愈伤组织 。 幼胚离体培养
时生长素和细胞分裂素分别起促进幼胚的生根和嫩
芽分化的作用 , 如果浓度过低则起不到促进作用 ;但
浓度过高时 , 因幼胚发育所需的营养不足而最终夭
折 。
培养基 中使用的激素种类和 水平 , C ari mi 等
(19 8) 〔’6 〕认为添加适量的生长调节物质是柑桔幼
胚生长的前提条件 。 在球形胚和心形胚阶段 , G A 3
(
2
·
9 林m o F L ) 或 G A 3 ( 2 . 9 林m o F L ) + N A A
生物杖术通报 B 勿te ch nole 舒 2008 年增刊
(0 . 1林m ol/ L )有利于胚发芽 。 N i t s e h 培养基中添加
10 一’m o F L I A A 和 10 一 6 m o F L G A 3 会直接影响葡萄
无籽品种的种子败育和胚珠的培养。 即使经过 4℃
的低温处理 , 如果不加 IA A 和 GA 3 , 其再生率会相
当低仅 30 % 一 5 % !’】。 B A 能有效地打破葡萄胚珠
休眠 , 有 助 于 胚 的早 期 发 芽[l0 〕。 庄 恩 及 等
(1990 )[’〕比较了 14 种不 同种激素及浓度配比组
合 , 结果显示 :桃胚珠的生长培养基内附加 1.om 盯L
B A 十 1 . o m 岁L IA A 有利于桃胚发育;而 4 .om 扩L
IB A 、0 . 25 m 岁L K T 及 4 .om 岁L KT 对桃胚的发育有
抑制作用 。 但 Pi nt o等(19 93 )认为:外源生长调节
物质对桃胚挽救没有影响〔’8〕。
3
.
4 培养温度
温度也会极大地影响胚的发育 , 18 ℃会阻止早
熟桃胚的退化 , 多数植物的胚在 25 一 30 ℃ 之间生长
良好 。 s t a r a n t i n a 等 (1953 )[’o ] 认为 27℃ 较适宜培
养柑橘的幼胚 。 一般光照强度 2 o o lx , 光照时间
12 丫d , 温度(25 士 2) ℃的培养条件比较适合核果类
果树的胚挽救 。 对 NJN5 油桃 、红港桃胚珠在 7 种
不同的温度下培养 , 结果发现 27 ℃最有利于桃胚的
生长〔”〕。 常采用两步培养法 , 先促使胚在胚珠内生
长 , 再将长大的幼胚进行低温处理 (30 一 6 0d ) , 再转
移至发芽培养基上 , 是落叶果树进行胚挽救的有效
方式 。 桃 、樱桃 、李及梨等树种幼胚的培养 , 若不经
过低温(1 一 5 ℃ )处理 , 常常会导致胚的活力低下 ,
萌芽力降低 , 且易形成畸形苗。
4 展望与不足
胚挽救技术在果树新品种培育和新种质创制上
的快速应用和迅速发展 , 大大提高了果树杂交育种
工作(特别是果树远缘杂交育种 )的效率。 种质资
源是育种的物质基础 , 近代作物育种所取得的巨大
成就主要得益于一批重要种质的发现和利用 , 以及
育种技术的创新和应用 。 因此 , 胚挽救技术将会是
优异种质资源 (特别是野生资源 )利用最有效的途
径之一 。
果树胚挽救技术在育种上的应用尚有不足之处
4 .1 果树离体胚挽救技术的应用相对较成熟 , 已大
量应用于果树新品种的育种实践;但有关利用胚挽
救技术获得的中间种质的农艺性状的评价方面的研
究仍较少 , 缺乏与果树重要农艺性状遗传连锁图谱
和分子标记辅助育种的紧密结合 。
4
.
2 离体胚挽救技术的应用一定程度上能够克服
远缘杂种不育 , 有时会出现非期望的倍性及再生植
株生长较弱的问题 。 因此 , 只有将胚挽救技术与组
织培养技术 、传统的育种技术结合起来 , 才能有效地
提高远缘杂种胚的成苗率。
4
.
3 胚挽救技术在核果类早熟育种 、柑橘三倍体育
种及葡萄无籽育种方面已经取得了较大进展 , 而在
诸如干果类的板栗 、核桃 、柿枣等及热带水果的育种
方面宜应进一步进行幼胚离体胚挽救技术的研究与
应用 。
4
.
4 充分利用成熟的胚挽救技术体系 , 加快对中间
育种材料的评价和应用 。
因此 ,建立在果树重要农艺性状基础上的遗传
连锁图谱和分子标记辅助手段 , 并结合常规育种技
术 , 充分利用果树胚挽救技术在果树新种质创制中
的优势将是今后果树育种科研的方向和热点 。
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生物技术通报 B to te ch n oto盯 B “le 而 2008年增刊
农大也相继成功获得体细胞克隆猪 , 使我国挤身于
国际猪体细胞克隆研究先进国家行列 。 随着体细胞
克隆技术的进一步完善 , 将为我国优良地方猪种的
保种及优良猪种资源的高效利用提供一条新的途
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