全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
微流控与细胞迁移技术的研究进展
蔡绍皙 黎昌莉
(重庆大学生物工程学院,重庆 400044 )
摘 要: 细胞迁移在多种生理、病理过程中扮演着重要角色。在细胞迁移研究中, 琼脂糖平板法、transw e ll小室法等因
操作简单、重现性好被广泛运用于细胞迁移的体外建模。但传统方法大多是检测单因素条件下的细胞迁移情况,却忽略了血
流这一重要因素对细胞迁移的影响。微流控芯片的出现不仅解决了上述难题, 并能保证迁移试验在多参数条件下一步到位
的完成并及进行实时观测。因此, 微流控芯片将带来一场细胞迁移技术及相关领域的革命。对近 10年微流控技术在细胞迁
移研究中运用进行了总结。
关键词: 细胞迁移 微流控芯片 浓度梯度
Advances ofM icrofluidic Technology in CellM igration Research
Cai Shaox i L iChangli
(B ioengineering College, Chongqing University, Chongqing 400044)
Abstrac:t Cellm ig ration p lay an im po rtan t role in physio log ica l and patho log ic process, such as them e thod o f agarose p late and
transw e ll cham be r o r o ther sim ilar way wh ich have benn w idely applied to v itro test o f cellm ig ra tion. T rad itiona lm e thods are unifac to r
m ode l and equ ipped w ith simp lic ity o f opera tor and better reproduction quality, bu t usually neg lec t b lood flow as an im po rtant fac tor that
can effect ce llm ig ra tion. Indeed, It has been sa id tha t m icro flu idic dev ices mu ltiparam eter m ode ling w ou ld bring about a revo lution in
ce ll m igration research and re la ted techno log ies, as an a lternative techno logy can dea lw ith the prob lem s wh ich usua lly happened in tra
d itiona lm ethods. In this paper, the deve lopm ent o f typical m icroflu id ic chip in recent 10 yea rs w as outlined
Key words: Cellm ig ration M icro flu idic dev ice Chem istry g rad ient
收稿日期: 20091126
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 10872224)
作者简介:黎昌莉,女,硕士,研究方向:细胞迁移与药物筛选; Em ai:l stephon@i 126. com
通讯作者:蔡绍皙,男,教授,博士生导师, 研究方向:细胞力学、血液和血管流变学、药学; Em a i:l sxca@i cqu. edu. cn
细胞迁移在众多生理、病理过程中扮演着重要
的角色。在胚胎形成中, 细胞迁移是在重要的形态
形成过程中重复出现的主题 [ 1]。在免疫反应中,免
疫细胞受感染灶释放趋化因子影响, 由趋化因子的
低浓度区 (如血管壁 )向高浓度区 (感染灶或炎症区
域 )迁移, 清除病原菌 [ 2]。细胞迁移同时也是恶性
肿瘤形成的必备条件。肿瘤细胞从原发部位释放并
侵入周围组织,然后进入血液循环或淋巴循环,通过
在循环系统中转移及被远处器官的毛细血管床捕获
从循环系统中迁出并选择位点开始生长 [ 3 ]。
根据细胞迁移的目的不同可将其可分为趋药
性、趋触性、细胞侵袭、划痕迁移 4大类。趋药性是
指细胞基于对周围化学药品的喜好而做出对该化学
信号靠近或远离的迁移活动; 趋触性是指细胞受胞
外基质中诱导因子浓度梯度影响迁移的活动; 细胞
侵袭是指细胞穿过血管内皮组织的迁移活动; 划痕
迁移是指细胞为修复伤口或填补划痕而进行的迁移
活动。在细胞迁移研究中, 划痕法 [ 4]、琼脂糖平板
法 [ 5]和 Boyden小室 [ 6 ] /T ransw ell[ 7]小室等因操作简
单、重现性好成为建立细胞迁移模型常规方法和装
置。虽然有 40多年的发展历史,但其却存在难以更
加真实地模拟体内微环境 (如剪切力 ), 不能开展后
续试验 (如 EC迁移后的血管生成试验 ), 浓度梯度
不稳定等诸多问题。
微流控芯片技术是 20世纪 90年代由瑞士的
W idmer和 M anz提出的,它是通过微细加工技术在
2010年第 3期 蔡绍皙等:微流控与细胞迁移技术的研究进展
约为几平方厘米的芯片上构建储液池、微反应室、
微管道、微检测等微功能元件构成具有微流路控制
的分析系统。微流控芯片的出现解决了细胞迁移实
验的诸多难题。 Irim ina等 [ 8]设计的一种金字塔结
构的树形分支状微流控装置; Sun[ 9 ]等制作的集合
任一现有设计的微通道集合, 组成具有分流、汇合、
收集、储液功能部件的芯片; Am ir Sham loo等 [ 10]构
建的毛细通道作为微桥连接主通道的集成芯片;
Cheng
[ 11]和 H aessler [ 12]以琼脂糖凝胶为基质设计
的三通道微装置。上述微流控装置不仅能产生精确
可控的流体、在较短的时间内产生稳定的浓度梯度,
还具备实现多参数条件下一步到位的完成一系列试
验,并同时进行实时观测。
1 用于检测细胞迁移的传统方法和装置
1. 1 琼脂糖平板法
琼脂糖平板法主要用于检测中性粒细胞等悬浮
细胞的迁移。具体操作方法为将含小牛血清的 1%
琼脂糖倾到在玻片或平皿中制成凝胶平板, 继而打
孔,每 3孔为一组, 中央孔加细胞悬液, 两侧孔分别
加趋化因子或对照培养液,经 37 温育 2- 3 h后,
用 2%戊二醛或吉姆萨染液固定, 移去琼脂糖层,经
染色后,测量细胞运动的距离, 计算移动指数公式:
移动指数 =趋化移动距离 /任意移动距离
琼脂糖平办法不能形成稳定的浓度梯度, 且浓
度梯度持续时间较短, 所以仅适用于检测迁移时间
很短的细胞。
12 Boyden小室和 Transw ell小室
1962年 Boyden发明了 Boyden小室法, 又称滤
膜小室法,适用于悬浮细胞和贴壁细胞。 Boyden小
室采用特殊的小盒装置, 盒中以一片 3- 5 m孔径
的微孔滤膜将盒分为上下两小室。上室加受检的细
胞悬液;下室加趋化因子。置 37 温育数小时。上
室中的细胞因受下室内趋化因子的诱导, 使细胞由
滤膜微孔进入滤膜内,最后取滤膜,经固定、干燥、着
染、脱色等步骤, 将透明后的滤膜置显微镜下对细胞
进行计数。T ransw ell小室是在 Boyden小室的基础
上改良而成的。Boyden小室和 transw ell assay的优
点在于易操作、能通过快速扩散诱导细胞迁移。迁
移结果能量化,可多孔同步进行。但是,从时间和空
间可控性来说,并不能达到理想的浓度梯度。
2 用于检测细胞迁移的微流控芯片
21 以琼脂糖凝胶为基质的微流控通道
在琼脂糖平板的基础上, Cheng等 [ 11]制作了一
种能够生成稳定的、持久的线性化学浓度梯度的琼
脂糖凝胶微流控装置。将 3条平行的微流体通道制
作在一片较薄的琼脂糖凝胶上 (通常薄于 1 mm ),
其中一条外侧通道 ( source channel)中的流体有着
恒定的化学浓度,而另一条外侧通道 (吸收道 )中的
流体是空白的缓冲液 ( sink channe l)。化学试剂通
过通道之间的凝胶基质进行扩散。中间的通道用于
接种细胞,因两侧通道的浓度差形成了稳定的浓度
梯度诱导细胞向高浓度方向迁移。这种扩散型三通
道结构的装置能够单独产生化学刺激而不受机械刺
激的影响,并且无限期地保持浓度梯度,所以有着无
可比拟的优点。
H aessler等 [ 12]在上述装置的基础上加以改进,制
作了一种可以用于检测在 3D环境下细胞迁移的装
置, 即在装置中间的微通道中填充混合了细胞的胶
原。在两侧通道形成浓度梯度的影响下,可检测细胞
X轴、Y轴和 Z轴 3个方向趋化并进行实时观察。
此外,以琼脂糖凝胶作为装置的基质材料,还具
有其它的优点。例如,大多数细胞需要的营养物质
和生长因子在凝胶中容易扩散, 因此采用水凝胶的
装置较易于整合在生物试验中; 许多溶质在琼脂糖
凝胶中的扩散率相当接近在水中的扩散率, 因此建
立化学梯度所需要的时间很短; 琼脂糖凝胶具有良
好的延展性,容易塑造成不同的形状和尺寸。
22 改进 transw e ll小室制作的微流控装置
Transw e ll小室虽然被广泛运用, 但不能进行实
时观测和非流动环境等缺陷制约着依赖剪切力影响
的细胞的迁移研究 (如血管内皮细胞 )。 Song[ 13]等
通过改进, 将 transw e ll小室的上下小室改进为由
PDMS制作的微流控通道, 通道的尽头连有储液池,
上下通道的储液池分别装培养液和诱导试剂。接种
细胞的聚酯多孔膜粘合在上下通道之间,由此形成
一个 !三明治∀装置。上下两层的通道不仅可以借
助注射泵调节不同的流体剪切力, 同时还可以通过
扩散形成浓度梯度,可用于检测在剪切力和浓度梯
度共同影响下的细胞迁移。和 transw ell小室相比,
其能形成更为稳定的浓度梯度和可控的剪切力, 但
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
依旧不能实行实时监测。
23 其他用于检测细胞迁移的微流控装置
除了在传统方法及装置基础上改进而成的微流
控芯片,许多用于检测细胞迁移的微流控装置都是
基于兼顾形成稳定浓度梯度和精确可控的流速而设
计的。Sham loo[ 10 ]等利用毛细原理制作了一款利用
数个宽 5 m微桥连接 3条宽度大于 500 m、长度
为 4 mm的微通道来实现浓度梯度检测细胞迁移的
芯片。 Tsensors[ 17] , M icro je ts Device[ 18] 及 M osade
gh, Co lleagues等 [ 19 ]的梯形交叉微通道,也是通过不
同的构型实现浓度梯度稳定和流速可控的多参数条
件来进行细胞迁移。同传统装置或方法相比, 上述
装置为迈向更加真实模拟体内环境跨出一大步。
3 制作方法
制作微流控装置的常用方法有光刻法 [ 14 ]和抽
丝法 [ 15, 16]。光刻法是将所需要的微通道图形制成
光掩模,以硅或玻璃作为微通道的基底材料,旋涂光
刻胶, 然后曝光, 用湿法或干法蚀刻, 在这些材料表
面上形成微通道 (沟槽 ) , 然后进行键合使微通道顶
面实现闭合。作为光刻工艺家族的延伸工艺微机械
加工方法如体硅微机械加工、表面微机械加工等,在
微电子机械 (MEM S)领域也已经被大量地用来构建
许多形状与不同深宽比的微通道。但是昂贵的光刻
仪器和繁琐的制作过程使得微流控装置不能普及到
普通实验室。V erma[ 15]和蒋稼欢等 [ 16]运用抽丝的
手段简化的微流控芯片的制作工艺。抽丝法利用在
液态 PDMS或凝胶中嵌入尼龙丝或其它细丝, 固
化后将细丝抽出的方法来制作装置。包括微通道及
其阵列的构建包含排布微丝、浇注固化、抽丝封装 3
个主要步骤。利用抽丝法因能制作简单、成本低廉
而适用于普通实验室,但装置构型制作受限制。
4 微流控芯片中的细胞加载与追踪
就目前微流控芯片技术,加载系统主要有两种
形式: 机械加载系统和非机械加载系统 [ 20, 21]。机械
加载系统主要包括剪切力驱动系统、压电微泵、静电
微泵、气动微泵、电化学制动汞微泵、!无阀 ∀往复
微泵、离心力驱动系统。非机械加载系统主要包括
电渗流体驱动系统、电流体动力泵、磁流体动力
泵、重力驱动系统、表面张力微泵等。在细胞迁移
试验中,采用的技术方案为将微流控芯片放置在具
有恒温功能的超净工作台上, 在微流控芯片上活体
细胞经培养后进行荧光染色, 然后利用加载系统设
置剪切力或其它影响细胞迁移的条件持续对细胞进
行作用。利用荧光显微镜观察细胞迁移过程中的形
态变化及位置变化并进行实时连照。
5 讨论
影响细胞迁移的因素很多,传统方法和装置侧
重于单因素对细胞迁移的影响,而忽略了浓度梯度、
力学、细胞基质等多因素在细胞迁移过程中扮演的
综合作用。例如, 层流和紊流都能对内皮细胞的迁
移产生明显的促进作用。又如,在剪切力的作用下,
细胞迁移速度较静态水平有显著差别 [ 22 ]。另外, 在
传统二维平台下对细胞进行研究和体内真实环境的
误差较大。微流控芯片的出现解决了上述难题。它
能够提供精确可控的流体速度和浓度梯度; 允许多
参数共同调节下一步到位的完成试验;并且能够更
真切的模拟细胞生长的体内微环境。且微流体芯片
可多次重复运用,且因需要较少的试剂而大大节约了
试验费用,提高了工作效率。可以说微流体技术的发
展将为细胞迁移方面的研究提供更广阔的平台。
长期以来, 运用体外模型筛选药物的成功率不
高, 其根本原因是单因素体外环境和真实复杂的体
内环境差距甚大。传统的体外模型忽略了血液流动
对靶细胞或靶组织的影响, 微流控芯片或许能在关
于细胞迁移下述的生理事件中更好地扮演下列角
色: 在免疫反应中, 模拟不同流场影响下免疫细胞受
感染灶释放趋化因子诱导, 由趋化因子的低浓度区
(如血管壁 )向高浓度区 (感染灶或炎症区域 )迁移;
在肿瘤形成中模拟肿瘤细胞从原发部位释放并侵入
周围基质,然后进入血液循环或淋巴循环,在流动系
统中迁移;或模拟血管内皮细胞在剪切力作用下迁
移后形成毛细血管网为肿瘤细胞的 !物质供应 ∀服
务。与传统体外试验相比, 微流控芯片或许能提高
药物筛选的成功率。更为重要的是, 微流控芯片为
观测细胞迁移后的 !后续表演 ∀提供了一个好的平
台, 如血管内皮细胞迁移后血管的形成,肿瘤细胞迁
移后肿瘤的形成。传统方法或装置难以实现上述功
能。微流控技术将为细胞迁移及相关研究将带来一
场新的革命。
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2010年第 3期 蔡绍皙等:微流控与细胞迁移技术的研究进展
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