全 文 ：2014 年 2 月 第 16 卷 第 2 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Feb. 2014 Vol. 16 No. 2
研究开发
△［基金项目］ “十二五”重大新药创制科技重大专项———中药复方多组分配伍筛选集成化微流控芯片的构建及新药筛选
(2013ZX09507005)
*［通信作者］ 孟宪生，硕士生导师，教授，研究方向:中药组分配伍、代谢组学及药品质量分析;Tel: (0411)87406496，
E-mail:mxsvvv@ 126. com
基于微流控芯片技术研究水红花子复方抗肿瘤的作用
△
王乙同，马立东，孟宪生* ，包永睿，王帅
(辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600)
［摘要］ 目的:基于微流控芯片技术研究水红花子复方含药血清对肝肿瘤 SMMC-7721 细胞的凋亡坏死影响及
血管内皮生长因子(VEGF)分泌的影响。方法:设计与制作玻璃-PDMS复合浓度梯度芯片，并对芯片药物浓度梯度
进行表征;将 SMMC-7721 细胞长期培养在芯片中，绘制细胞的生长曲线，AO/EB 法检测细胞死活率;将预制备的
含药血清通入微流控芯片，分别作用于 SMMC-7721 细胞 24 h和 48 h，凋亡坏死试剂盒检测凋亡坏死率;收集各通
道的细胞上清液，ELISA法测定 VEGF的蛋白含量。结果:细胞在芯片中培养 7 d，细胞增殖活性良好，培养 72 h
期间细胞存活率≥97%。芯片可产生稳定的浓度梯度，线性相关系数为 0. 996 4。芯片中含有药物血清的培养液分别
作用 SMMC-7721 细胞 24 h和 48 h后，发生凋亡坏死细胞的数量随含药血清作用浓度升高而逐渐升高，细胞培养上
清液中 VEGF蛋白含量随含药血清作用浓度升高而逐渐减少，都呈现出一定的时间与浓度依赖性。结论:基于微流
控芯片技术，进一步证明水红花子复方含药血清对肝肿瘤 SMMC-7721 细胞具有促凋亡作用，且能抑制其分泌 VEGF
从而间接抑制肿瘤血管新生达到抗肿瘤作用。
［关键词］ 微流控芯片;药物浓度梯度;中药复方;含药血清;药物筛选
Anti-tumor Effect of Polygoni orientalis Fructus Formula Serum in
Vitro Based on Microfluidic Technology
WANG Yitong，MA Lidong，MENG Xiansheng* ，BAO Yongrui，WANG Shuai
(College of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China)
［Abstract］ Objective:To study the effect of Polygoni orientalis Fructus formula serum on hepatoma
SMMC-7721 cells apoptosis， necrosis and the secretion of VEGF based on microfluidic technology.
Methods:Fabrication and design of the Glass-PDMS microfluidic device，validation of the concentration
gradient generation integrated on the microfluidic device. SMMC-7721 were seeded into the microfluidic
device，drawing cell growth curve and determination the cytotoxicity of cells to chip by AO /EB
staining. Culture medium with medicinal serum was then injected into the microfluidic device by the syringe
pump. Detection of the cells apoptosis and necrosis by Hoechst 33 342 and propidium iodide (PI)double
staining after 24 h and 48 h，respectively. Supernatants collected from each cell culture channel. Ｒesults:
Cells cultured for 7 days on the chip，cells viability ≥97% during 72 h. There was a good correlation (r =
0. 996 4)between the experimental and theoretical data，demonstrating the capability of the chip to generate
concentration gradients. Culture medium with medicinal serum was incubated with SMMC-7721 cells for 24 and
48 h on chip， the number of cells with apoptosis and necrosis increased in response to the increasing
concentration of medicinal serum，the secretion of VEGF decreased in response to the increasing concentration
of medicinal serum，the morphological changes and the secretion of VEGF appeared to be dose-dependent and
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time-dependent. Conclusion:Our job verified that Polygoni orientalis Fructus formula could promote the
apoptosis of human hepatoma SMMC-7721 cells，and indirectly inhibited tumor angiogenesis through inhibiting
VEGF secretion and thus achieved anti-tumor effect based on microfluidic technology.
［Key words］ Microfluidics;Drug gradient generator;Traditional Chinese Medicine formula;
Medicinal serum;Drug screening
doi:10. 13313 / j． issn. 1673-4890. 2014. 02. 003
癌症是导致现代人类死亡的疾病之一，当前中
国肿瘤病发率和死亡率都呈加速发展态势，根据全
国肿瘤登记中心发布的 《2012 中国肿瘤登记年报》，
全国每年新发肿瘤病例约为 312 万例，死亡病例约
为 270 万。这些数据宣告中国已进入与肿瘤鏖战的
前沿阵地，也使得相关抗肿瘤新药的筛选与研发得
到了我国高度的重视。我国中药资源丰富，从中草
药中筛选抗肿瘤药物具有得天独厚的优势，但目前
大部分实验室还停留在传统孔板筛选模式，实验人
员往往要面对通量低、繁琐操作、试剂耗材消耗量
大、成本高等问题，这对于从数以万计中草药单体
(组分)中筛选出具有抗肿瘤活性药物提出了艰巨
挑战。近年来随着现代科学技术的发展，体外药物
筛选研究出现了一种新型的技术，即微流控芯片
(Microfluidics)技术，以其小型化［1］、操作灵活、
高通量(High Throughput Screening)、高内涵［2］、与
生物体内相似的微环境［3］等优势已经逐渐受到关注，
这为抗肿瘤药物的高效筛选带来希望。
水红花子复方为临床经验方，是由水红花子、
花蕊石、薏苡仁和白茅根 4 味中药组成，具有健脾
祛湿、活血化瘀、缓消癥块等功效［4］，是经过临床
验证优选出最佳配伍比例的复方，临床证实其对肝
癌患者有很好的治疗效果。实验以该复方的含药血
清作为研究对象，采用微流控浓度梯度芯片一站式
生成 8 种浓度梯度对水红花子中药复方含药血清进
行抗肿瘤的体外药效研究，同时 ELISA 法定量检测
不同浓度药物干预后肿瘤细胞分泌血管内皮细胞生
长因子(VEGF)水平的变化，初步研究中药水红花
子复方不同含药血清浓度对肝肿瘤的影响。本文研
究旨在通过应用微流控芯片技术，为我国抗肿瘤新
药特别是抗肿瘤中药活性单体(组分)的快速筛选
与研究提供一种新思路和新方法。
1 材料
1. 1 动物
选用成年健康 SD 大鼠 16 只，雌雄各半，体重
(200 ± 20)g，由大连医科大学实验动物中心提供，
许可证号 SCXX(辽)2011-0002。
1. 2 药物与试剂
水红花子复方:水红花子、花蕊石、白茅根有
效物质组喷雾干燥处理后，与薏苡仁物质组按照配
伍比例混合，委托秦皇岛市太极环纳米制品有限公
司加工制成纳米颗粒胶囊。
胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公
司)。吖啶橙(AO)、溴化乙锭(EB)、荧光素、多聚
L-赖氨酸(Poly-L-Lysine，PLL)均购自美国 Sigma 公
司。SU8 2075 光刻胶(美国 Micro-Chem 公司)。
Sylgard 184 型聚二甲基硅氧烷(PDMS)、固化剂(美
国 Dow Corning 公司)。细胞凋亡与坏死检测试剂盒
(Hoechst 33342 和 PI，碧云天生物技术研究所)。胰
蛋白酶(美国 GIBCO 公司)。人肿瘤血管生长因子
(VEGF)ELISA Kit (上海沪宇生物科技有限公司)。
1. 3 细胞株
人肝癌细胞株 SMMC-7721(上海复蒙生物有限
公司)。SMMC-7721 细胞使用含有 10%胎牛血清的
DMEM-高糖培养基(美国 GIBCO 公司) ，在饱和湿
度、37 ℃、5% CO2 通用培养条件下常规培养，当
细胞生长汇合至 80% ～ 90% 时，将细胞进行 1 ∶ 3
传代。
1. 4 仪器
NUAIＲETM US AUTOFLOW型 CO2 培养箱(德国
NUAIＲE公司) ;SOＲVALL fresco 高速离心机(美国
科峻仪器公司) ;HD2-BCN-1360B 型生物洁净工作
台(哈尔滨东联电子技术开发有限公司) ;AE31 型
倒置显微镜(厦门 Motic 公司) ;BX51 荧光型显微镜
(日本 Olympus公司) ;图像处理软件 Image-Pro Plus
6. 0(IPP，美国 Media Cybernetics 公司) ;JKG-2A 型
光刻机(上海学泽光学机械有限公司) ;HPDC-32G-2
型等离子清洗机(美国 Harrick Plasma公司) ;LSP04-
1A精密注射泵(保定兰格公司)。
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1. 5 芯片设计与制作
实验设计的微流控芯片为 PDMS-玻璃复合芯片，
如图 1 所示。芯片采用软光刻技术以及模塑法制作，
氧等离子体处理进行键合［5-6］。芯片通道高度为
100 μm，上部由细胞培养液入口和含有药物的细胞
培养液入口组成，药物由注射泵经入口处注入宽为
100 μm浓度梯度发生区，产生 8 个浓度的药物梯度
并经细胞缓冲区(细胞缓冲区具有 8 个外接出口，方
便后期细胞引入)进入半径为 800 μm圆形细胞培养
区，每个浓度梯度下的细胞培养腔均有 4 个复孔，
培养室下部另设有 8 个出口，可将细胞代谢物进行
收集(不需要时可由专用堵头进行封口)。
2 方法
2. 1 含药血清制备
16 只成年健康 SD大鼠随机分为 2 组，空白组 8
只，给药组 8 只。给药组将水红花子复方胶囊制剂
的内容物取出溶于药用大豆油中，制成 0. 5 mL灌胃
溶液，大鼠给药剂量参照公式:用药剂量 =临床用
量 ×动物等体表面积系数 × 培养基内血清稀释倍
度［7］，采用日剂量一次给药法算出大鼠最大给药量
为 125 mg·kg －1。空白组灌服相同量的空白药用大豆
油。两实验组灌胃前禁食不禁水 12 h。大鼠采用眼
眶静脉取血，根据本实验室已掌握的该中药复方中
活性组分的血中代谢规律，将取血时间分段为 1，
2，3，4 h，每次取血约 0. 8 mL，期间腹腔注射补充
适当 0. 9%氯化钠溶液。全血室温静置 2 h，3 000
r·min －1，离心 15 min，吸取血清，同组血清混合，
56 ℃水浴灭活 30 min，DMEM 不完全培养基稀释至
血清含量 10%，0. 22 μm滤膜过滤除菌， － 20 ℃保
存备用。
2. 2 芯片药物浓度梯度的表征
实验采用荧光素染料(M:376. 27)进行浓度梯
图 1 芯片示意图
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度的表征实验。荧光素染料(100 mg·L －1)和无菌水
分别通过芯片上部两个入口以 0. 6 μL·min －1的流速
注入芯片中，待液流稳定后用荧光显微镜拍摄 8 个
细胞缓冲区通道的荧光图片，专业图像分析软件
Image-Pro Plus 6. 0 (IPP)分析每个通道的光密度平
均值(Density mean)。
2. 3 芯片细胞培养的预处理
采用 0. 1 mg·mL －1的多聚 L-赖氨酸(PLL)对芯
片下部细胞培养腔进行包被处理，促进细胞快速贴
壁［8］。芯片在使用前通入 75%乙醇 10 min 灭菌，后
用无菌水冲洗数遍，烘干，注入细胞前紫外照射
10 min。
2. 4 细胞在芯片中的长期培养和细胞活力
将对数生长期的细胞用 0. 25%的胰酶进行消化，
消化后进行离心富集，将细胞用培养液稀释至 5 ×
105 个·cm －2的密度，通入芯片后放入细胞培养箱中，
待细胞贴壁后，用精密注射泵以流速为0. 6 μL·min －1
将完全培养液注入芯片中，随机抽取芯片 8 组通道
中任意 4 个细胞培养腔，每 24 h 拍照 1 次，通过
IPP软件对细胞图像进行计数分析，4 个培养腔中细
胞数取平均值并计算标准偏差，绘制出 SMMC-7721
肝癌细胞在芯片中的生长曲线。
SMMC-7721 细胞在微流控芯片上分别培养 24，
48，72 h后，在芯片出口处将 100 mg·L －1AO /EB 混
合液通入芯片中，避光染色 5 min，PBS 清洗 3 次，
使用倒置荧光显微镜进行拍照，检测细胞的存活率，
每条通道中 4 个培养腔分别计数。其中正常活性细
胞(VN) :细胞呈圆形，核质体着绿色，大小形状较
单一;坏死细胞(NVN) :细胞呈椭圆形，核质体着
桔红色，大小形状较单一;凋亡早期细胞(VA) :核
质体着绿色，细胞形状不规则，呈新月形;凋亡晚
期细胞(NVA) :核质体着桔红色，染色质浓缩，细
胞核碎裂成点状。细胞存活率按公式计算:细胞存
活率% = VN /VN + NVN + VA + NVA ×100%。
2. 5 水红花子复方含药血清对肝癌细胞凋亡坏死的
影响
将水红花子复方含药血清实时注入芯片 24 h 和
48 h后，将芯片细胞缓冲区玻璃塞打开，将细胞染
色缓冲液、Hoechst 33342 染液和碘化丙啶(PI)染
液 1∶1(V /V)依次通入芯片中，4 ℃孵育 10 min，
PBS清洗 3 遍后使用 Olympus荧光显微镜 CellSens成
像软件进行拍照。由于正常细胞、凋亡细胞和坏死
细胞的细胞膜完整性的差异，Hoechst 33342 和 PI 可
使不同状态的细胞核着染不同的颜色:正常细胞核
呈弱蓝色荧光 +弱红色荧光，凋亡细胞核呈强蓝色
荧光 +弱红色荧光，坏死细胞核呈强红色荧光 +强
蓝色荧光。
2. 6 ELISA法检测细胞上清 VEGF的含量
将芯片细胞培养腔下部的 8 个出口通过聚四氟
乙烯管与离心管相连接，实时收集细胞上清液。注
射泵流速为 0. 6 μL·min －1连续给药，分别收集给药
24 h和 48 h后各通道细胞上清液，将收集到的上清
液冻存在 － 20 ℃冰箱中，临用 4 ℃现化，3 000
r·min －1，离心 25 min，仔细吸取上清液。ELISA 操
作方法严格按照说明书上进行操作，对照和样品均
设 3 个复孔，450 nm 波长测定各孔的 OD 值，以浓
度为横坐标，OD为纵坐标绘制标准曲线，通过公式
计算出每个通道的 VEGF含量。
2. 7 数据统计与处理
实验数据经统计学软件 SPSS 18. 0 分析，各项
参数均以(珋x ± s)表示。两样本均数采用 T 检验。
P ＜ 0. 05、P ＜ 0. 01 视为差异有统计学意义。
3 结果
3. 1 芯片药物浓度梯度的表征测试
经前期考察细胞培养液流速设为 0. 6 μL·min －1
时，细胞在此剪切力下无明显影响，芯片同时可形
成较好的浓度梯度，如图 2 所示。通过光密度测试
后得出线性回归方程为 Y = － 7. 69X + 62. 71，r =
0. 998 2，说明浓度产生实际值与理论值［9］相近，即
芯片两注入口浓度分别为 0 和最终浓度 c，则芯片浓
度梯度发生区 8 个通道浓度关系为 0，0. 14c，
0. 28c，0. 43c，0. 57c，0. 71c，0. 86c，c。
图 2 荧光素浓度梯度图(n =5)
3. 2 细胞在芯片中的生长曲线和活力
经过多聚赖氨酸处理的通道，SMMC-7721 细胞
能在 3 h内贴壁完全，经过 7 d的培养，细胞每天都
在持续增殖，如图 3 所示。通过 IPP 软件对细胞图
像进行计数分析，绘制单个培养腔中的细胞生长曲
线，如图 4 所示。用荧光染料 AO /EB 对细胞进行前
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72 h的染色，计算出细胞在芯片中存活率都能达到
97%以上，如图 5、图 6 所示。
图 3 细胞在芯片中的生长状态图(×40)
图 4 细胞在芯片单个培养腔中生长曲线(n =4)
图 5 芯片中 AO/EB双染细胞荧光图(×40)
图 6 芯片中细胞存活率统计(n =4)
3. 3 芯片中含药血清对肝癌细胞的影响
实验采用 Hoechst 33342 和碘化丙啶(PI)双染
法观察芯片中不同浓度梯度含药血清对肝癌细胞凋亡
坏死的影响，从图 7(A)、(C)可知细胞培养腔随
浓度梯度的增加，细胞核呈现亮蓝色荧光的个数也
越多，即发生凋亡的细胞数开始增多，且同浓度梯
度下可明显观察到 48 h 较 24 h 发生凋亡的细胞数
量多;从图 7(B)、(D)可知细胞培养腔随浓度梯
度的增加，细胞核呈现亮红色荧光的个数也随之增
加，即发生坏死的细胞数开始增多，同时也可观察
到同浓度梯度下 48 h较 24 h凋亡的细胞数量增多。
由于正常细胞核着弱蓝色荧光和弱红色荧光，导致
其在芯片缩放图中呈现不明显;所以从图中看到呈
蓝色或红色荧光的细胞均为发生凋亡或坏死的
细胞。
A. 24 h的 Hoechst 33342 染色细胞荧光图
B. 24 h的 PI染色细胞荧光图
C. 48 h的 Hoechst 33342 染色细胞荧光图
D. 48 h的 PI染色细胞荧光图
图 7 Hoechst 33342 /PI双染荧光检测结果(×40)
3. 4 水红花子复方对细胞分泌 VEGF的影响
为客观衡量 VEGF的分泌情况，实验对芯片中
24 h与 48 h 的细胞总数进行了分析，发现细胞总
数变化不显著，药物对肝肿瘤细胞呈现出一定的增
殖抑制作用，所以在考察 VEGF的分泌情况时排除
了细胞数量对实验造成的干扰。从实验结果可知，
与空白通道(通道 1)比较，加药通道的 VEGF 含
量明显降低，VEGF 抑制率升高，差异具有统计学
意义(P ＜ 0. 05)。作用时间相同条件下，随着药物
浓度的升高，VEGF 的含量呈现降低趋势，VEGF
抑制率呈现增大趋势。药物浓度相同条件下 48 h
的 VEGF含量较 24 h的低，48 h的 VEGF抑制率较
24 h的高，结果见表 1 与图 8，VEGF 含量测定标
准曲线公式为Y = 0. 000 3X － 0. 032 5，r = 0. 994 9。
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表 1 水红花子复方对细胞分泌 VEGF含量的影响(珋x ± s)
/pg·mL －1
时间 通道 1 通道 2 通道 3 通道 4 通道 5 通道 6 通道 7 通道 8
24 h 881. 11 ±73. 13 767. 78 ±56. 70 665. 56 ±39. 06# 650 ±35. 28## 623. 33 ±52. 92## 567. 78 ±51. 78## 474. 44 ±46. 83## 423. 33 ±74. 24##
48 h 910 ±37. 12 761. 11 ±13. 88＊＊ 656. 67 ±72. 11＊＊625. 56 ±50. 04＊＊ 561. 11 ±60. 49＊＊ 532. 22 ±23. 41＊＊ 430 ±64. 29＊＊343. 33 ±50. 33＊＊
注:24 h的与同组空白组(通道 1)比较，#P ＜ 0. 05，#P ＜ 0. 01，n = 3;48 h的与同组空白组(通道 1)比较，＊＊P ＜ 0. 01，n = 3
图 8 水红花子复方含药血清对细胞 VEGF抑制率的影响
4 讨论
实验通过利用一种浓度梯度芯片，研究水红花
子复方含药血清对肝肿瘤 SMMC-7721 的影响，实
验整体过程操作简单，水红花子复方含药血清一步
自动生成 8 个线性良好的浓度梯度，并实时作用于
肝肿瘤 SMMC-7721 细胞，通过荧光倒置显微镜实
时在线观测药物诱导肝肿瘤细胞凋亡的全过程，同
步测定了 VEGF分泌量的动态变化。实验发现药物
作用时间相同条件下，随着药物浓度的增大，细胞
发生凋亡坏死数量呈现出明显增加，同步检测药物
对 SMMC-7721 细胞分泌 VEGF 的抑制率也均呈增
大趋势，总体表现出明显的剂量与效应关系，且在
第 8 通道即药物作用浓度最大时，VEGF 抑制率
均达 50%以上。在相同药物作用浓度下，随着给
药时间的延长，细胞发生凋亡坏死数量及 VEGF
的分泌抑制率也呈现增长趋势，总体表现出了明
显的时间与效应关系，且当药物作用 48 h 达到最
佳状态。
从实验前期结果可知，为了验证芯片产生稳定
的浓度梯度能力，对芯片做了相应的浓度梯度表征
工作，在采用 0. 6 μL·min －1流速下芯片形成良好的
浓度梯度，浓度梯度线性回归系数达到 r = 0. 998 2，
浓度产生的实际值与理论值非常相近，这为保证后
期实验结果的准确性非常重要，也证明了本实验室
设计的浓度梯度芯片的可行性。同时考虑到新加工
的芯片因其结构的改变流体剪切力也会随之改变，
从而对细胞生长环境产生未知的影响，所以本实验
在 0. 6 μL·min －1流速下对肝肿瘤 SMMC-7721 细胞进
行了长期培养研究，结果显示细胞在芯片中持续培
养 168 h其生长状态依然良好，仍有继续增长的趋
势，且形态未出现细胞膨大、核浓缩等细胞坏死现
象;同时实验对芯片中 72 h 内的细胞进行了活力检
测，细胞存活率都达到 97%以上，所有的工作从侧
面佐证了在 0. 6 μL·min －1流速下芯片的实验性能是
准确可靠的。值得一提的是该实验过程省去了传统
长期细胞培养实验中不断更换培养液的过程，因其
极低的试剂消耗量及培养液实时更新等特点，本实
验一次换液就达到了肝肿瘤 SMMC-7721 细胞长期培
养的目的，极大地节省时间、减少人力。
综上所述，水红花子复方含药血清对肝肿瘤
SMMC-7721 细胞具有促凋亡作用并能抑制其分泌
VEGF，且这种作用具有明显的时间、剂量、效应关
系，说明水红花子复方可以通过诱导肿瘤细胞凋亡
并抑制 VEGF 分泌，间接抑制肿瘤血管新生等联合
作用来达到治疗肿瘤的作用。最后应该指出的是微
流控芯片作为一门新兴的技术，尤其在大规模抗肿
瘤新药研发领域尚属早期，目前对芯片中药物干预
后的细胞信息采集依然需要借助荧光显微镜后期拍
照分析，其图片分析处理过程复杂繁琐，芯片通量
受阻明显，细胞定量手段也欠佳。相信随着荧光实
时在线定量分析技术的完善，微流控芯片技术将在
不久实质性地缩短抗肿瘤新药研发周期，降低研发
成本，催生出民族新药。
参考文献
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(下转第 108 页)
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图 1 分级酸性多糖对肿瘤抑制率的比较
4 讨论
茯苓的主要物质成分为多糖，其含量达 80%以
上，国内外诸多文献报道，茯苓羧甲基多糖具有抗
肿瘤生物活性。本实验室前期研究表明，茯苓多糖以
酸性多糖为主，占总多糖含量的 90%以上;将茯苓酸
性多糖直接进行了抗肿瘤、调节免疫功能及阿霉素致
肾病模型的药效学研究，均具有显著的药理效果。
为了探讨茯苓酸性多糖的生物活性与其酸性强弱
和分子量大小的相关性，笔者采用 0. 1 ～ 1. 0 mol·L －1
梯度 NaOH 溶液将茯苓酸多糖分级分离为 10 个组
分，进行抗肿瘤生物活性比较研究。研究结果表明，
各分级组分茯苓酸性多糖均有不同程度抗肿瘤活性，
但 0. 9，1. 0 mol·L －1 NaOH 溶液分级分离得酸性多
糖抗肿瘤活性明显高于其他分级组分酸性多糖。说明
茯苓酸性多糖抗肿瘤活性与其酸性强弱密切相关，
弱酸性多糖抗肿瘤活性优于强酸性多糖，从而为进
一步探讨茯苓酸性多糖的构效关系奠定了基础。
茯苓酸性多糖构效关系有待进一步深入研究，
拟在本文研究基础上，对茯苓酸性多糖分级分离 10
个组分多糖的分子量、单糖组成及其连接方式等进
行系统研究。以期阐明茯苓酸性多糖的构效关系，
从而为茯苓多糖的深度开发利用提供科学依据。
参考文献
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