全 文 ：王不留行提取物对内皮细胞增殖 、迁移及其黏附的作用评价
夏明星 ,张莲芬 ,王一君 ,李　英 ,金　坚
(江南大学医药学院细胞与分子药理实验室 , 江苏 无锡　214122)
收稿日期:2009-02-09,修回日期:2009-03-06
基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目 (No
2006AA02Z153);上海市科委生物医药重大科技攻关项
目(No06DZ19020)
作者简介:夏明星(1982-),男 ,硕士生 ,研究方向:天然药物与血管
生成抑制 , E-mail:mingxing825@yahoo.com.cn;
金　坚(1960-), 男 ,教授 , 博士生导师 , 研究方向:细胞
与分子药理学 ,通讯作者 , Tel:0510-85918219, E-mail:jin-
jian31@126.com
中国图书分类号:R 284.1;R 322.12;R 329.24;R 364.3;
R730.52
文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2009)06-0817-03
摘要:目的　体外分析王不留行抑制人微血管内皮细胞
(HMEC)增殖 、迁移和黏附的有效部位。方法　SRB法测定
药物干预细胞增殖的 IC50和药物作用时间与药效学的关系;
划线灼伤法研究细胞迁移;体外基质胶分析药物对细胞黏附
能力的影响;HE染色观察药物对细胞染色体的影响。结果
　王不留行有效部位对 HMEC增殖抑制的 IC50为 3.60mg·
L-1 , 加药 4h后起作用。加药 48 h后 HMEC迁移受到明显
抑制(迁移率为 40.33%, 对照组迁移率为 77.68%)。 加药
组细胞黏附受到明显抑制 ,且呈浓度依赖关系。结论　王不
留行提取物能明显抑制内皮细胞增殖 、迁移及黏附 , 因此具
有潜在的价值用于抑制血管生成。
关键词:细胞增殖;细胞迁移;细胞黏附;作用评价
　　肿瘤的血管生成是肿瘤生长和转移的重要条
件 。血管形成是一个相当复杂的过程 ,内皮细胞通
过增殖 、游走和黏附到相应部位构成血管样结构 。
因此 ,抑制血管内皮细胞的增殖可切断肿瘤细胞的
营养来源 ,抑制其生长与转移 。王不留行为石竹科
植物麦蓝菜 [ Vacariasegetalis(Neck)Garcke]的干
燥成熟种子 ,其药用部位为多系根 、茎 、叶 、花与种
子并用 。王不留行中主要含有三萜皂苷 、黄酮苷 、环
肽 、类脂和脂肪酸 、单糖等 。桑圣民等 [ 1]从河北产
麦蓝菜 Vaccariasegetalis种子的乙醇提取物中分得
22个化合物。本实验通过王不留行抑制肿瘤血管
生成的探讨 ,分析其新的药用价值。
1　材料与方法
1.1　材料和仪器　中药材王不留行购于三禾中药
饮片公司。大孔树脂 D101购于安徽三星树脂有限
公司。人微血管内皮细胞(HMEC-1)为法国国立健
康与卫生研究院 U553研究所陆核教授惠赠。 MC-
DB131培养基 、SRB染液和 EGF表皮生长因子为美
国 Sigma产品。细胞培养用小牛血清为上海冠羽生
物科技有限公司产品。青霉素 、链霉素 、胰蛋白酶 、
乙腈和甲醇为美国 Tedia产品 。其他试剂均为国产
分析纯。
1.2　内皮细胞培养　参照陶永辉等 [ 2]的 HMEC培
养方法培养 ,取对数生长期的细胞用于活性检测实
验(CO2培养箱 ,美国 Therma公司)。
1.3　待测物的分离纯化　王不留行的乙醇提取物
经大孔树脂吸附法分离 ,收集不同浓度乙醇洗脱液 ,
用 SRB法选择有效组分 , AKTAresource柱分离 ,蒸
发光散射检测组分复杂程度 ,选择活性高 、丰度大 、
成分简单的峰进行 C18柱分离。收集活性峰 E,旋蒸
和低温冷冻干燥得白色晶体粉末 ,用超纯水配成 1 g
·L-1的溶液 ,微孔滤膜过滤除菌待用(AKTA蛋白
分离纯化系统 ,瑞士 Roche公司;HPLC1100,美国
Agilent公司;低温冷冻干燥仪 , 美国 Labconco公
司)。
1.4　SRB法测定药物干预的 IC50值　参照张小平
等[ 3]的 SRB法测定王不留行干预 HMEC-1增殖的
IC50值(96孔和 24孔细胞板 ,美国 COSTAR公司;
MultiskanMK3酶标仪 ,美国 Bio-Rad公司)。选择
不同的时间段将含药培养基换成新鲜培养基 , 48 h
后取出细胞板 , SRB法测定 ,计算细胞增殖抑制率。
1.5　细胞迁移实验　参照 Wu等[ 4]的划线灼伤法
测定王不留行干预 HMEC-1的细胞迁移率(倒置显
微镜 ,日本 Nikon公司)。
1.6　细胞黏附实验 [ 5] 　4℃下将 Metrigel以每孔
400 μl加到 24孔板中 ,室温风干 40 min待用。将
悬浮好的 HMEC-1细胞以每孔 3 ×104加到基质胶
上 ,同时加入不同浓度的王不留行提取液 ,设置对照
组。 37℃、5% CO2及饱和湿度培养孵育 2 h, PBS
洗去未吸附的细胞 , HE染色后显微镜下计数 。
1.7　统计分析　实验数据经统计软件 SPSS16.0
处理 ,实验结果以 x±s表示 ,组间比较采用 t检验 。
2　结果
2.1　提取物对 HMEC-1细胞 IC50值的测定　王不
留行提取物峰 E对 HMEC-1的增殖有明显的抑制
·817·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2009;25(6):817 ～ 9
作用 ,且呈剂量依赖性 ,其对 HMEC-1细胞的 IC50为
3.60mg· L-1(Fig1)。当药物作用小于 4 h,其细
胞增殖抑制率与时间呈依赖关系 ,当作用 4 h后 ,细
胞抑制率不再随时间增加而增强(Fig2)。
Fig1　Theeffectofcowherbseed
extractsonproliferationinhibitionofHMEC( x±s, n=4)
Fig2　Thedependentrelationshipoftimeandefect
2.2　提取物峰 E对细胞迁移的作用效果　通过比
较对照组和测试组灼伤距离来判断迁移能力 , Fig3
表明 5 mg· L-1的提取物能明显抑制细胞的迁移 ,
在培养 24 h和 48 h时 , 其迁移抑制率分别为
20.16%和 37.35%(P<0.05)。
2.3　提取物对细胞黏附的作用结果　通过设定不
同的药物浓度 ,在细胞培养 2 h后可以发现高浓度
的药物能明显抑制细胞黏附。当浓度大于或等于
25 mg· L-1时几乎没有细胞黏附在基质胶上 ,在低
浓度时细胞能黏附。见 Fig4。
2.4　提取物对细胞形态的影响　HE染色发现对
照组细胞生长良好 ,细胞核大而圆 , 染色质分布均
匀;加药组(4mg·L-1)内皮细胞核固缩 ,染色质凝
集 ,产生核破裂或核融合 ,死亡细胞明显多于对照
组 。见 Fig5。
Fig3　Theeffectofcowherbseedextracts
onwoundhealingmigrationofHMEC
Fig4　Theefectofceladhesiononcowherbseedextracts
Fig5　Theefectofextractsoncell
morphologicalchangebyHEstaining
3　讨论
　　通过抑制肿瘤血管生成 ,进而抑制肿瘤生长和
转移已成为一种新的肿瘤治疗策略。传统的肿瘤治
疗药物大多缺乏肿瘤细胞靶向性 ,在杀伤肿瘤细胞
的同时 ,也杀伤大量的骨髓细胞及其他正常的增殖
旺盛细胞 ,产生严重的毒副作用 。其次是由于肿瘤
细胞的不均一性及肿瘤细胞基因组的高度不稳定
性 ,使得少数耐药细胞得以生存或肿瘤细胞的治疗
中获得耐药性 ,继而对进一步的治疗产生临床耐药
现象 [ 5] 。与传统的抗癌治疗相比 ,抗血管生成治疗
具有许多优势:(1)正常血管内皮细胞常处于不分
·818· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2009;25(6)
裂状态 ,抗血管生成治疗对正常内皮细胞影响不大;
(2)血管内皮细胞暴露在血液中 ,药物能够直接发
挥作用;(3)血管内皮细胞基因表达相对稳定;(4)
作用具有放大效果[ 6, 7] 。近期国外研发的抗 VEGF
抗体和血管抑素均为治疗性生物制品 ,只能静脉给
药 。由于肿瘤患者抗新生血管治疗疗程长 ,上述多
肽 、蛋白质药物给药剂量大 ,治疗费用高 ,且使用不
便 ,存在过敏的风险 。因此 ,寻找高效 、无毒 、价廉 、
可口服的血管生长抑制剂是该领域的关键 。
　　传统中药王不留行作为传统中药用于行血通
经 、催生下乳 、消肿敛疮 、妇女闭经 、乳汁不通 、难产 、
血淋 、痈肿 、金疮出血等 。我们前期体内外药物筛
选发现王不留行煎剂口服可抑制新生血管生长 ,通
过分离纯化得到王不留行单一活性组分群 。该物质
为白色晶体 ,极易溶于水。鉴于其对 HMEC-1细胞
增殖具有很强的抑制活性 ,本文研究表明该提取物
在体外能够明显抑制血管内皮细胞增殖 (IC50为
3.60mg· L-1)。直接用光学显微镜观察 , 提取物
峰 E对 HMEC细胞的形态学发生了明显的改变 ,可
见细胞凋亡的发生 ,并呈剂量依赖性。当药物浓度
在 5 mg· L-1时 ,细胞的迁移受到明显的抑制 ,其迁
移率比对照组低 37.35%。同时加药后内皮细胞黏
附受到明显抑制 ,药物浓度大于或等于 25 mg· L-1
时 ,细胞不能贴壁 。鉴于该提取物在内皮细胞增殖 、
迁移和黏附的抑制活性 ,使其有可能成为一种有较
好前途的抗肿瘤血管生成抑制剂。
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Evaluationoftheefectofcowherbseed
extractsonendothelialcelproliferation, migrationandadhesion
XIAMing-xing, ZHANGLian-fen, WANGYi-jun, LIYing, JINJian
(LaboratoryofCelandMolecularPharmacology, SchoolofMedicineandPharmaceutics, JiangnanUniversity, WuxiJiangsu　214122, China)
Abstract:Aim　Tostudytheinhibitoryfunctionon
humanmicrocapilaryendothelialcelsproliferation,
migrationandadhesionbycowherbseedextractsin
vitro.Methods　IC50 wasdeterminedbySRB;thetime
ofmedicineefectwascontroledforinvestigatingthe
time-efectdependentrelationship;woundmigrationas-
saywasusedtoinvestigatethecelmigration;theefect
ofextractonceladhesioninvitrowasevaluatedby
matrigel;HEstainingwasusedtoobservethechangeof
celmorphology.Results　ThevalueofIC50 was3.60
mg·L-1.Therelationshipoftimeandefectindicated
thatittook4hoursfortheextractstoinhibitcelgrowth
afterithadbeenaddinthe96wels.Thecelmigration
oftestgroupwasinhibitedafter48 hours, andthemi-
gratoryrateoftestandcontrolwas40.33% and
77.68% respectively(P<0.05).Celadhesionassay
indicatedthattheextractscouldsuppressendothelial
celadhesioninaconcentration-dependentmanner.
Conclusions　Thecowherbseedextractscansuppress
theendothelialcelsproliferation, migrationandadhe-
sion.Meanwhile, theyseemtobeapotentialmaterial
forinhibitingtheangiogenesis.
Keywords:celproliferation;celmigration;celad-
hesion;efectevaluation
·819·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2009;25(6)