全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第4期
收稿日期:2008-02-26
基金项目:国家自然科学基金(30530560)和IAEA(12665/RO)
作者简介:王新峰(1971-),男,讲师,在读博士,研究方向:动物消化道微生物;E-mail:wxf-4@163.com
通讯作者:朱伟云,教授,博导,主要从事消化道微生物研究;E-mail:zhuweiyunnjau@hotmail.com
反刍动物瘤胃是一个变化多样而独特的微生态系统,瘤胃内栖居着大量微生物,主要包括古细菌、细
菌、原虫和真菌,其中原虫数量约为 104~106/ml,占整个瘤胃生物量的 50%,原虫对于饲料中碳水化合物、
含氮物质、矿物质和维生素在瘤胃内的降解、合成、利用起着十分重要的作用,其数量和区系的变化将直接
影响到机体代谢效率的高低。自 1843年 Gurby和 Delfound在牛瘤胃液中首次发现纤毛虫后,人们在其他
反刍动物瘤胃内也陆续发现,迄今为止的研究成果表明,各种反刍动物瘤胃中大约有 250种以上的原虫[1]。
基于18SrRNA基因的PCR/DGGE技术研究山羊
瘤胃原虫动态变化
王新峰 1 苏勇 1 毛胜勇 1 刘建新 2 朱伟云 1
(1南京农业大学消化道微生物研究室,南京 210095;2浙江大学动物科学学院,杭州 310029)
摘 要: 应用PCR/DGGE技术对山羊采食前后瘤胃原虫的多样性随时间的变化进行了研究。采食前和采食后
1、2、4和8h分别采集瘤胃内容物样品,对瘤胃原虫特异性的18SrRNA基因经PCR扩增、DGGE电泳分析。结果显示,
采食前后DGGE图谱由10条左右清晰可辨的谱带组成,图谱上的泳带反映了瘤胃内的优势原虫,泳带数量和位置的复
杂性说明了瘤胃原虫的多样性。并对其中两个优势条带切胶测序,基因序列分析分属于毛口目和内毛目。瘤胃原虫区系
相似性分析,采食前为90.5%~94.1%;采食后相似性发生改变,且存在个体差异。多样性指数由采食前的0.82逐渐上升到
采食后8h的0.90(P>0.05)。DGGE指纹技术有效地反映了不同样品中原虫优势种的组成,并可通过此技术跟踪研究瘤胃
原虫区系在不同条件下的动态变化。
关键词: 山羊 瘤胃原虫 18SrRNA PCR/DGGE
ResearchonGoatRumenProtozoalCommunityKinetics
UsingPCR/DGGE
WangXinfeng1 SuYong1 MaoShengyong1 LiuJianxin2 ZhuWeiyun1
(1LaboratoryofGastrointestinalMicrobiology,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095;2ColegeofAnimalScience,
ZhejiangUniversity,Hangzhou310029)
Abstract: Thegoatsrumenprotozoalcommunitieswereinvestigated,andthechangeofwhichweremonitoredby
usingPCR/DGGEtechniquebasedon18SrRNAgene.Theprotozoaldiversityandsimilarityweredeterminedonthe
baseofthepositionandnumberofbandsinDGGEgel.Theresultsshowedthatovertenbrightbandswereshowed
anddiferenceswereobservedforfourgoatsimmediatelypriortofeedingandafterfeedingat1,2,4and8hour.
Diferentprofilesingelwereobserved,theamountandpositionofbandsrepresentedrespectivelytherumenpredominant
protozoalspeciesandcommunityvariationofdiferentsamples.Thesimilarityindicesoftheprotozoawerebetween
90.5%~94.1%,whilevariationofthesimilaritywerefoundafterfeeding.Theseindicatethatthecomponentsandthe
changesoftherumenpredominantprotozoacanbereflectedefectivelybyusingPCR/DGGEtechnique,tracingand
researchingthevariationoftheprotozoalcommunityatdiferentsituation.
Keywords: GoatRumenprotozoa 18SrRNA PCR/DGGE
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
但由于原虫形态上的复杂多变,传统的形态学方法使得观察存在偏差,研究结果的可靠性引起质疑[2];同时
原虫难以在体外分离培养,因而对其进行研究有较大的困难。
近几年来,一些研究者利用真核生物 18SrRNA基因的技术,通过克隆与测序对瘤胃原虫的研究已有
大量报导。原虫在瘤胃液相、固相和上皮中数量和分布存在差异[3];不同日粮条件下原虫的种类发生变化[4]。
此类研究主要针对瘤胃原虫总数和主要几种原虫进行计数。利用 PCR/DGGE技术研究了不同个体、地域、
不同蛋白日粮结构变化,以及光照对瘤胃原虫区系的影响[5,6]。但此类报导较少,且未能充分说明不同时间
原虫区系的动态变化规律。因此,采用 PCR/DGGE技术,对山羊采食全粗料后不同时间瘤胃原虫区系的多
样性进行研究,分析山羊瘤胃原虫区系随采食时间的动态变化规律。
1 材料与方法
1.1 实验动物和瘤胃内容物的收集
4只(A、B、C和 D)装有永久性瘤胃瘘管的本地山羊,自由采食全粗料。实验期间分别于饲喂前和饲喂
后 1、2、4和 8h从山羊瘤胃采集瘤胃内容物,2层纱布过滤,迅速投入液氮保存以备 DNA提取。
1.2 瘤胃内容物总 DNA的提取
参照 Zoetendal等[7]方法,取解冻后混匀的瘤胃内容物样品 1.5ml,珠磨法机械破碎内容物后,用酚和氯
仿/异戊醇提取瘤胃内容物总 DNA。
1.3 PCR扩增反应
以瘤胃内容物总 DNA为模板,对原虫特异的 18SrRNA进行 PCR扩增,原虫特异性引物为 P-Forward-
5′-GGTGGTGCATGGCCG-3′,带有 GC夹子的引物为 reverse5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGC
CCGCCGCCCCCGCCCGGGGCCAATTGCAAAGATCTATCCC-3′[6]。
PCR反应体系为 50μl,其中 Taq酶 1U,10×Bufer5μl,MgCl20.2mM,dNTPs10μM,上、下游引物均为
1μl。PCR程序为 94℃预变性 2min;94℃1min,60℃1min,72℃3min,35个循环;72℃最终延伸 6min。1.2%
琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物。
1.4 DGGE与计算机分析
参照 Muyzer等[8]的方法,对 PCR扩增产物进行 DGGE分析。DGGE用 8%聚丙烯酰胺凝胶(含丙酰胺、
二丙酰胺、尿素、甲酰胺和甘油),其中尿素浓度梯度为 20%～35%。电泳采用 DcodeDGGE系统(Bio-Rad),
电泳缓冲液为 40mmol/L的 Tris-乙醇(pH8.0),首先在 200V电压下预电泳 10min,随后在 85V的固定电
压下电泳 16h。电泳结束后,进行硝酸银染色[9],凝胶显色定影后进行扫描。采用分子分析家软件包(Mole
cularAnalyst,BioRad)对 DGGE凝胶进行相似性和多样性指数分析。
1.5 测序和序列分析
DGGE胶扫描后,随机选择两条条带切胶回收,再进行 PCR扩增和 DGGE电泳,再切胶回收,以切胶
片段为模板进行 PCR,纯化后进行测序。
2 结果与分析
2.1 瘤胃原虫 18SrRNA的 PCR扩增
山羊瘤胃内容物总 DNA的 PCR扩增产物,经琼脂糖电泳检测,均获得了特异性扩增片断,大小约为
280bp(包含引物序列)。
2.2 山羊瘤胃内容物原虫区系的 DGGE分析
图 1为山羊饲喂前和饲喂后不同时间原虫 DGGE图谱,图谱上有明亮的 10多条谱带,反映了瘤胃内
的优势原虫,泳带数量和位置的复杂性说明了瘤胃原虫的多样性。结果显示,采食前和采食后不同时间点
瘤胃原虫存在差异。由于在 1头反刍动物瘤胃中,主要原虫种类约为 20多种[1],在 DGGE图谱上出现 10
多条数量不等和位置不同的条带,反映了瘤胃原虫优势种的数量和不同样品原虫组成的差异。
142
2008年第4期
由图 1可以看出,在采食前后的相同时间点,山羊瘤胃内容物原虫 DGGE图谱有共同的条带。随机选
择两条优势条带切胶回收(图 1中箭头 1和 2所指),对纯化后的 18SrRNA的 PCR产物进行序列分析(登
录号分别为 EF988081和 EF988082),然后将基因序列提交 NCBI进行 BLAST分析,得到以 18SrRNA序列
为基础的系统进化树(图 2)。由图 2可知,EF988081与 IsotrichaIU577701的相似性为 96%,对应的原虫属
于毛口目;EF988082与 Ophryoscolex相似性为 98%,对应的原虫属于内毛目。
图 1 山羊瘤胃内容物原虫 18SrRNA的 DGGE图谱
图中 M代表 Mark;A0-A8,B0-B8,C0-C8和 D0-D8分别代表
每只山羊采食前和采食后 1、2、4和 8h
图 2 瘤胃原虫 18SrRNA系统进化树
图中 1和 2分别代表 DGGE切胶条带,括号内为登录号
2.3 瘤胃原虫区系的变化
2.3.1 原虫区系的相似性分析 对 DGGE图谱进行相似性分析,山羊瘤胃原虫区系存在个体上的差异。采
食前 A、B、C和 D4只山羊原虫区系相似性介于 90.5%~94.1%之间。而采食后,山羊 DGGE图谱上泳带的
数量和位置明显发生变化,存在共同条带,部分优势带在位置、数量上产生变化。在采食后 1、2、4和 8h4
只山羊原虫区系相似性见图 3。
同一只山羊不同时间原虫的分布也存在差异。A羊采食前与采食后 1、2、4和 8h的原虫区系相似性分
别为 96.4、32.3、82.3和 88.2%,B羊分别为 74.1、95.8、96.2和 97.6%,C羊分别为 86.1、95.6、92.6和
91.0%,D羊分别为 98.1、94.2、91.7和 82.5%。
2.3.2 原虫区系的多样性分析 山羊在采食前瘤胃原虫区系的多样性平均为 0.824,在采食后 1、2、4和
8h多样性指数逐渐上升,瘤胃原虫的多样性随时间呈现上升趋势(图 4),但差异不显著(P>0.05)。
以上结果表明,山羊瘤胃原虫的数量、种类及分布会随着消化活动而发生相应变化。
图 4 山羊瘤胃原虫多样性指数变化规律
图 3 山羊瘤胃内容物原虫 DGGE图谱的相似性分析
图中 M代表 Mark;A0-A8,B0-B8,C0-C8和 D0-D8分别代表
每只山羊采食前和采食后 1、2、4和 8h
王新峰等:基于18SrRNA基因的PCR/DGGE技术研究山羊瘤胃原虫动态变化 143
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
3 讨论
瘤胃原虫在数量上虽比细菌少,但由于其体积大,因此在瘤胃微生物总量中占有相当大的比例,直接
影响饲料中碳水化合物、含氮物质、矿物质和维生素的消化和利用。因此,了解瘤胃原虫有助于研究反刍动
物的消化代谢过程,从而更好地利用粗饲料资源[10]。使用 RFLP方法分析发现,来自不同地域、不同绵羊个
体和不同形态的某一瘤胃原虫的多态性不存在差异,而此方法只能研究原虫的多态性[5,11]。Shin等(2004)从
奶牛瘤胃液、瘤胃固相和瘤胃上皮获得原虫克隆,经测序分析分别属于内毛虫属(占 69.6%)和前毛属(占
30.4%),然而克隆技术仅能对瘤胃原虫的组成进行研究,不能对原虫的动态区系变化进行分析。显微镜计
数,主要对原虫总数或几种主要原虫计数,对瘤胃其它原虫数量和区系组成的变化不能详尽描述。PCR/
DGGE技术是近年来用于多种生态环境微生物区系研究的最主要的分子生物学手段之一,已广泛地应用于
研究不同家畜(牛、绵羊、山羊和猪)胃肠道中细菌、古细菌的数量和微生物区系变化,但利用该方法研究瘤
胃中的原虫还不如细菌深入和成熟,尤其是 18SrRNA基因的 PCR/DGGE方法的报道比较少[11,5]。使用 PCR/
DGGE方法结合 18SrRNA分析了山羊瘤胃原虫区系的多样性及其动态变化规律,同时随机选择 2条优势条
带回收对纯化后的 18SrRNAPCR产物进行序列分析,提交 NCBI进行 BLAST分析,发现对应的原虫分属于
毛口目和内毛目。表明,PCR/DGGE在研究瘤胃原虫区系的多样性上是一种非常有效的技术。
研究发现 4只山羊在采食前和采食后 1、2、4和 8h瘤胃内容物的原虫区系发生变化,并结合相似性
分析比较不同山羊在采食前后瘤胃原虫区系变化规律。结果表明,山羊瘤胃原虫区系的数量和组成存在个
体和采食时间上的差异。有研究报道,同一圈舍并饲喂相同日粮的不同绵羊瘤胃内容物的原虫区系存在差
异[11]。研究发现 4只山羊相同时间其瘤胃原虫区系存在差异,与 Regensbogenova等[6]研究结果相一致;但同
一只山羊采食后不同时间的原虫区系存在差异,主要原虫的数量和分布发生了一定的变化。有些瘤胃原虫
对糖有偏好,使饲喂前沉积在瘤胃底部的原虫活动增加,引起原虫在采食前后分布上的差异[1,12]。
Regensbogenova等研究报道,饲喂高蛋白和低蛋白日粮对反刍动物原虫区系有显著影响,表明日粮组成和
结构对瘤胃原虫区系的组成和数量产生影响[11]。由于瘤胃原虫这种日粮成分的偏好性,从而使主要原虫数
量和种类分布出现差异。
结果显示,利用 PCR/DGGE方法有效分析了山羊在采食粗饲料后不同山羊个体之间瘤胃原虫的差异
及同一个体采食后不同时间瘤胃原虫的变化规律。总之,PCR/DGGE技术可快速、准确地分析不同条件下
瘤胃原虫区系的多样性及其动态变化规律。
参考 文献
1 WiliamsAD,GSColeman.Springer-Verlag,NewYork,1992.
2 DehorityBA.JournalofEukaryoticMicrobiology,1994,41(2):103~111.
3 ShinEC,ChoKM,LimWJ,etal.JournalofAppliedMicrobiology,2004,97:378~383.
4 KarnatiSKR,YuZ,SylvesterJT,etal.JAnimSci,2003,81:812~815.
5 McEwanNR,AbeciaL,RegensbogenovaM,etal.LetersinAppliedMicrobiology,2005,41:97~101.
6 RegensbogenovaM,PristasP,JavorskyP,etal.LetersinAppliedMicrobiology,2004,39:144~147.
7 ZoetendalEG,AkkermansADL,deVosWM.ApplEnvironMicrobiol,1998,64:3854~3859.
8 MuyzerG,deWaalEC,UiterlindenAG.ApplEnviornMicrobiol,1993,59:695~700.
9 ZhuWY,WiliamsBA,AkkermansADL.ReproductionNutritionDevelopment,2000,40:180.
10 BergenWG.JNutr,2004,134:3223~3224.
11 RegensbogenovaM,KisidayovaS,MichalowskiT,etal.ActaProtozool,2004,43:219~224.
12 DehorityBA.NotinghamUniversityPress,Notingham,UK,2003.
144