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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
土壤中产脂肪酶洋葱伯克霍尔德菌的分离与鉴定
贾彬  刘文山  杨江科  汪小锋  叶才伟  闫云君
(华中科技大学生命科学技术学院 分子生物物理教育部重点实验室, 武汉 430074 )
  摘  要:  洋葱伯克霍尔德菌 (Burkhold eria cepacia )在生物防治、生物降解等农业领域有着广泛的应用,它产生的脂肪酶
则在有机合成、精细化工等领域潜力巨大。采用改良的 TB
T平板筛选法从土壤中初步筛选出 300株洋葱伯克霍尔德菌,然后
用脂肪酶活性检测平板对 300株菌进行筛选, 最终获得 6株脂肪酶产量高的菌,通过发酵发现 6株菌均有较好的产脂肪酶能
力。随后通过 16S rDNA比对的方法将 6株全部鉴定为 B. cepacia。在此基础上, 采用 H ae
recA RFLP和基因种特异性 PCR
对 6株菌进行了基因种鉴定, 结果表明 JWT16、G63YL、W J158和 JWT137属于 Burkhold eria cenocepacia菌, JWP9属于 Burkhold

er ia vietnam iensis, JWT267则属于 Burkho lderia mu ltivorans。
关键词:  洋葱伯克霍尔德菌  RecA
PCR TB
T平板  鉴定
Isolation and Identification of L ipase
producing
Burkholderia cepacia in the Soil
Jia B in L iu W enshan Yang J iangke W angX iaofeng Ye Caiwei Yan Yunjun
(K ey Laboratory of M o lecular Biophysics of theM inistry of Education, College of Life Science and T echnology,
H uazhong University of Science and T echnology, W uhan 430074)
  Abstrac:t  Burkholder ia cepacia stra in is w ide ly used in bio log ica l contro l and b iodeg radation, its lipase has grea t potentia l in
m any industria l app lications inc lud ing organ ic synthesis and fine chem ica ls. In th is study, improved TB
T se lection plate to isolate B.
cepacia strains was em ployed and 300 B. cepacia strains w ere ob tained successfu lly. Then, lipase ac tiv ity testing p la te was adopted to
se lect stra ins w ith h ighe r lipase activ ity. S ix lipase
produc ing strains we re obta ined, and a ll o f them exh ib ited high ab ilities to produce
lipase by ferm entation. Subsequently, all six stra ins we re identified to spec ies by 16S rDNA a lignm ent. On th is basis, H ae III
recA RFLP
analysis and genomovar
spec ific PCR w ere further applied to identify genom ovars o f the s ix sta ins ofB. cepacia. The resu lts show that
stra ins JWT16, G63YL, W J158 and JWT137 belong to B. cenocepacia, stra in JW P9 belongs to B. vietnam iensis, and stra in JWT267
be longs to B. m ultivorans.
Key words:  Burkholderia cepacia RecA
PCR TB
T plate Identifica tion
收稿日期: 2009
12
18
基金项目:国家 ! 863∀计划项目 ( 2006AA020203, 2007AA05Z417, 2007AA100703) ,教育部新世纪优秀人才基金项目 ( NCET
07
0336)
作者简介:贾彬,男,在读博士,研究方向:微生物分子生物学; E
m ai:l j iasan lin@ gm ai.l com
通讯作者:闫云君, E
m ai:l yanyun jun@ tom. com
1949年, Burkolder[ 1 ]在腐烂的洋葱中分离出一
种革兰氏阴性菌并将其命名为洋葱假单胞菌 (P seud

omonas cepacia )。 1992年 Y abuuch i等 [ 2]根据 rRNA
同源性将包括 P. cepacia在内的 7种假单胞菌划分
成为新的伯克霍尔德菌属, 该菌属属于变形菌门
的
亚纲 (

subd iv ision o f the phy lum pro teobacte

ria)。而洋葱伯克霍尔德菌 ( Burkholderia cepacia )
则为该属的代表种。根据其独特的代谢方式, 人
们陆续采用不同的选择性培养特异性地筛选 B.
cepacia。常用的选择性培养基有 PCA、OFPBL、TB

T和 PCAT等, 其中 TB
T平板选用台盼蓝和四环
素做为抗性物质对 B. cepacia菌有很高的分离
效率 [ 3 ]。
洋葱伯克霍尔德菌因其能产生硝吡咯菌素、吩
嗪、苯基吡咯、Cepac iam ide A、Cepacidine A等多种
次生代谢物质而被广泛应用于生物防治、生物降解
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 4期
等农业领域 [ 4, 5]。它分泌的脂肪酶在有机溶剂中
具有优良的稳定性,极强的对映体拆分能力, 是在
有机合成、油脂深加工和精细化工等领域应用最
为广泛的脂肪酶酶种之一 [ 6]。与此同时, B. cepa

cia也作为一种重要的人体条件致病菌而备受关
注, 肺囊性纤维化病人 ( CF )受到感染后引起一系
列急剧病理反应, 有很高的致死率 [ 7]。随着研究
的深入, 人们发现 B. cepacia至少由 10个基因种
(亚种 )组成, 它们统称为洋葱伯克霍尔德菌复合
体 (Burkhold eria cepacia complex, BCC )。BCC的 10
个基因种分别为 [ 11] B. cepacia ( genomovars I)、B.
multivorans ( genomovars II)、B. cenocepacia ( genomo

vars III)、B. stab ilis ( genomovars IV )、B. vietnam ien

sis ( genomovars V )、B. dolosa ( genomovars V I)、B.
ambifar ia ( genomovars V II)、B. an thina ( genom o

vars V III)、B. pyrrocinia ( genomovars IX )、B.
ubonensis ( genom ovars X )。不同基因种之间无论
在基因结构和组成、生理生化特性、代谢途径等
方面, 还是在感染程度、致病性、工业应用等方面
均相差甚远 [ 8] ,临床上绝大部分感染是由 II型和 III
型引起的 [ 9, 10]。因此, 准确地进行 BCC分型, 不但
对其潜在价值开发和有效应用有积极作用, 而且
对 BCC感染病人准确诊断和有效治疗具有十分重
要意义。
目前,常用的 BCC分型法有表型分析、理化特
征分析、全细胞蛋白电泳、DNA杂交和 recA RFLP
等,精准的 BCC分型则通常是几种方法联用的结
果,整个鉴定过程非常繁琐。P irone等 [ 12]根据 recA
序列比对结果设计了一套基因种特异性 ( genomo

var
specific) PCR引物,经改进后该方法对所有 BCC
分型均有较高的准确度和敏感性。
本研究根据 B. cepacia菌抗性特征, 在 TB
T平
板的基础上添加高浓度的氨苄青霉素, 并且采用与
脂肪酶活性检测平板相结合的筛选方法成功从土壤
中筛选出了 6株高脂肪酶活性的 B. cepaica菌。在
此基础上, 使用 16S rDNA比对、H ae
recA RFLP
和基因种特异性 PCR的方法对它们进行了基因种
的鉴定。首次将产脂肪酶洋葱伯克霍尔德菌鉴定到
基因种,为后续脂肪酶资源开发利用、生物安全性分
析奠定了基础。
1 材料和方法
11 菌株、培养基及试剂
B. cepacia G63YL为本实验室从油污土壤中筛
选得到 [ 13] , 其它 B. cepacia菌均由作者从不同土样
中筛选获得。DH5为大肠杆菌。B. cepacia和 E.
co li DH5均在 LB培养基中生长, B. cepacia培养温
度为 28# , DH5为 37# 。氨苄青霉素使用浓度为
100 g /mL。改良型 TB
T的成分: 2 g葡萄糖, 1 g
L
天冬酰胺, 1 g N aHCO3, 05 g KH2 PO4, 01 g M g

SO4
7H 2O, 005 g台盼蓝, 002 g四环素, 015 g
氨苄青霉素, 15 g琼脂粉, 1 L H 2O。罗丹明 B脂肪
酶检测平板的成分: 10 g蛋白胨, 5 g酵母提取物, 10
g N aCL, 4mL罗丹明 B溶液 ( 01% , w /v ) , 12mL橄
榄油乳化液 ( 3% (w /v )聚乙烯醇与橄榄油按 3 ∃1比
例混合乳化 ), 022 g CaC l2, 15 g琼脂粉。三丁精脂
肪酶检测平板的成分: 10 g蛋白胨, 5 g酵母提取物,
10 g NaC ,l 2 mL三丁精, 15 g琼脂粉。发酵培养基
成分: 5 g糊精, 15 g蛋白胨, 18 g K2HPO4
3H2O,
07 g M gSO 4, 14 g尿素, 20 mL 橄榄油乳化液,
pH 84, 1 L H2O。
限制性内切酶 H ae III购自 NEB公司, Taq DNA
聚合酶、dNTP均购自 TaKaRa公司;罗丹明 B、蛋白
酶 K和 RNA酶 A购自 Sigma公司;凝胶回收试剂盒
购自 OMEGA公司;胰蛋白胨、酵母抽提物购自 Ox

o id公司,其他试剂为国产分析纯。离心机为德国
Eppendorf 5415D型高速离心机, PCR仪为德国 Ep

pendorf公司。
12 土壤中产脂肪酶 B. cepacia的分离
在武汉市周围农田、果园、草地等样地进行采
集, 土壤取样深度为 0- 20 cm。共采集 10个样品。
采样时间为 2009年 4月。每份土样各取 10 g加入
20mL含 09% NaC l的无菌水, 充分震荡后置于
28# 摇床培养 3 - 5 h。随后取 1 mL 土壤悬液
12 000 r/m in离心 1 m in,将上清涂布于 TB
T筛选
平板,平板置于 28# 培养至有菌落长出。然后用无
菌牙签将 TB
T平板上的单菌落转移到脂肪酶活性
检测平板上, 28# 继续培养 2- 3 d,测量检测平板上
菌落水解圈大小,重复 3次后,挑选水解圈大的菌落
进行具体分型鉴定。
184
2010年第 4期   贾彬等:土壤中产脂肪酶洋葱伯克霍尔德菌的分离与鉴定
13 DNA的提取
B. cepacia总 DNA的提取参考 Coenye等的方
法 [ 14]。将随机挑选的菌落接种于含 1 mL LB培养
基的 15 mL Eppendorf管中, 28# 过夜培养后
12 000 r /m in离心收集菌体。然后将菌体重悬于
200 L 裂解液 ( 025% ( w /v ) SDS, 50 mmol /L
N aOH, 50 g /mL蛋白酶 K) 50# 裂解 20m in, 2倍体
积乙醇沉淀后溶于 100 L无菌水中,于 - 20# 保存。
14 16S rDNA和 recA基因 PCR 
分离菌株 16S rDNA的扩增采用通用引物 PA /
PH,反应条件为 95# 预变性 5m in, 94# 30 s, 56#
30 s, 72# 延伸 90 s,反应 30个循环, 最后 72 # 延
伸 10m in。BCC鉴定的引物设计见参考文献 [ 10] ,
表 1详细列出。BCR0 /BCR1 /BCR2是 BCC recA基
因的特异扩增引物,根据 PCR产物的大小判断被鉴
定菌落是否属于 BCC。 recA的扩增采用巢氏 PCR,
首轮 PCR使用 BCR0 /BCR2做引物, 25 L PCR体
系中含 1 %PCR buffer、250 mo l/L dNTPs、2 mmo l/L
M gC l2、05 U Taq酶、10 pmo l引物和 2 L总 DNA。
反应条件 95# 预变性 3 m in, 94# 30 s, 58# 30 s,
72# 1 m in, 30个循环。第二轮 PCR使用 BCR1 /
BCR2做引物, 2 L首轮 PCR产物做模版, 除退火
温度改为 62# 外,其它条件与首轮 PCR相同。表 1
中其它引物为基因种特异性引物, 用以区分不同的
BCC基因种。 PCR反应除延伸时间依产物大小略
有不同外,其它基本相同。所有 PCR产物都在 1%
琼脂糖胶上进行电泳分析, 切胶纯化后送测序公司
测序。引物由上海生物工程公司合成。
表 1 用于 BCC基因型鉴定的引物
基因型 引物名称     引物序列 产物大小 ( bp)
16s
PA AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
PH AAGGAGGTGATCCAGCCGCA
1 500
BCC
BCR0 ACAGTGTCTGCATTCGTG
BCR2 CTCTTCTTCGTCCATCGCCTC
BCR1 CTTGACCGCCGAGAAGAGCAA
1 114
1 043
B. cepa cia
BCRG11 CAGGTCGTCTCCACGGGT
BCRG12 CACGCCGATCTTCATACGA
492
B. m ul tivorans
BCRBM 1 CGGCGTCAACGTGCCGGAT
C2- 3 CTCGGCTTCGTCGTGGC
710
B. cenocepacia
BCRG3A1 GCTCGACGTTCAATATGCC
BCRG3A2 TCGAGACGCACCGACGAG
378
B. pyrrocin ia
BCRG3B1 GCTGCAAGTCATCGCTGAA
BCRG3B2 TACGCCATCGGGCATGCT
781
B. stabilis
BCRG41 ACCGGCGAGCAGGCGCTT
BCRG42 ACGCCATCGGGCATGGCA
647
B. v ietnam iensis
BCRBV1 GGGCGACGGCGACGTGAA
BCRBV2 TCGGCCTTCGGCACCAGT
378
B. dolosa
BCRBM 1 CGGCGTCAACGTGCCGGAT
C6- 3 TGATGAAGATCACGAGGCAA
260
B. am bifaria
BCRBC1 GTCGGGTAAAACCACGCTG
BCRBC2 ACCGCAGCCGCACCTTCA
810
B. an th ina
BCRG81 TACGGTCCGGAATCGTCG
BCRG82 CGCACCGACGCATAGAA
473
185
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 4期
15 recA RFLP鉴定
Eshw ar等 [ 15]证明根据 recA基因经 Hae III酶切
后限制性内切酶长度多态性 ( RFLP)能区分不同 BCC
基因种。因此,根据 recA PCR产物的H ae III酶切图
谱就可以初步鉴定 BCC基因种。20 LH ae III酶切
体系含 5 L recA PCR产物、2 L NEB酶切缓冲液、
10UH ae III, 37# 温浴 2 h。酶切产物在 25%琼脂糖
胶上进行电泳分析。
16 多重比较及系统发育分析
自 GenBank中下载 B. cenocepacia, B. vietnam ien

sis和 B. multivorans的 recA基因序列 NC_0080601、
NC_0092561和 NC_0100841。利用 C lusterW 对这
些序列和 6株分离菌的 recA基因测序结果进行多重
比对, 根据比对结果采用 MEGA软件构建系统发
育树。
17 脂肪酶活力测定
采用滴定法进行脂肪酶的活力测定 [ 16]。脂肪
酶水解活力单位 (U )定义为在 45# 、pH90的条件
下,每分钟水解橄榄油产生 1 mol游离脂肪酸所需
的酶量。
2 结果
21 B. cepacia分离、形态学观察及发酵产酶测定
本试验从 10份土样中随机挑选 300个单菌落,
随后将它们挑于脂肪酶活性检测平板上。30# 培养 3
d后,选取水解圈最大的 5个菌,分别命名为 JWT16,
JWT137, JWT267, W J158和 JWP9,它们和 G63YL一起
被用于 BCC基因种鉴定。筛选菌在 LB平板上菌落均
呈圆形,表面光滑,隆起,边缘整齐,正反面乳白色,菌
落平均直径 2- 4 mm。6株分离菌经摇瓶发酵后脂肪
酶活力测定结果见表 2。可以看出,通过上述方法筛选
获得的 6株菌均有较好的产脂肪酶能力,均在 7U /mL
以上,特别是 G63YL的活力高达 135U /mL。
表 2 6株分离菌产脂肪酶能力的比较
菌株 脂肪酶活性
JWT16 84
JWT137 75
JWT267 102
W J158 91
JWP9 113
G63YL 135
22 16S rDNA和 recA基因的扩增
以 PA /PH为引物, 细菌总 DNA为模版, 扩增
6个待检菌的 16S rDNA,扩增结果见图 1
A。由图
1
A可知, 16S rDNA扩增产物大小约为 1 500 bp,
与目的条带大小相一致。 PCR产物经纯化后直接
送交测序公司进行序列测定。测序结果经 BLAST
比对分析后发现, 6株菌均为 B. cepacia菌,说明本
试验采取的筛选方法对产脂肪酶 B. cepacia菌的检
出率达到了 100%。但由于 6个菌落的 16S rDNA
序列间的同源性高达 98%, 无法确定其具体基
因种。
采用半巢氏 PCR扩增 B. cepacia的 recA基
因, 利用 BCR0和 BCR1作上游引物、BCR2作下
游引物, 提高 PCR的准确度, 降低非特异性扩增。
据 P irone[ 1 2]等报道, BCR0、BCR1和 BCR2可作
为 B. cepacia菌群的特异性扩增引物, 以 BCR0 /
BCR 2为引物做首轮 PCR, 然后以首轮 PCR的产
物作模版, BCR1 /BCR 2作引物进行第二次 PCR,
二次 PCR产物为 1 043 bp(图 1
B )。 6株菌均扩
增出 1 kb左右的条带, 且与目的条带大小完全一
致, 据此, 可以进一步说明被鉴定的 6株菌均属
B. cepacia菌。
M. M arker; 1. JWT267; 2. JWT16; 3. JWP9; 4. G63YL;
5. JWT137; 6. W J158
图 1 6株分离菌的 16S rDNA (A )
和 recA基因 ( B )PCR结果
23 RecA RFLP鉴定
B. cepacia 菌 recA 基因经 H ae III酶切后的
RFLP能够区分 5个基因种, 图 2显示 6株菌 recA
经 H ae III酶切的酶切图谱。将图谱与 M ahent

h iralingam等报道的酶切图谱进行比较,发现共有 4
种酶切带型,其中 JWT16、G63YL和W J158为 G型,
JWP9为 A型, JWT137为 J型, JWT267为 C型。根
186
2010年第 4期   贾彬等:土壤中产脂肪酶洋葱伯克霍尔德菌的分离与鉴定
据报道, G、J型酶切图谱属于 B. cenocepacia, A型酶
切图谱属于 B. vietnam iensis, C型谱图属于 B. mul

tivorans。由 此可初步证 明, 6 株 菌中 JWT16、
G63YL、W J158和 JWT137属于 B. cenocepacia菌,
JWP9属于 B. vietnam iensis, JWT267则属于 B. mul

tivorans。上述结果也表明土壤中 B. cenocepacia菌
的分布最广且脂肪酶产量较高。
M. Marker; 1. JWT267; 2. JWT16; 3. JWP9; 4. G63YL; 5.
JWT137; 6.W J158
图 2 recA基因的 Hae III RFLP分析
24 基因种特异性 PCR和系统发育树分析
逐一使用表 1的基因种特性引物,对 6株 B. ce

pacia菌进行 PCR扩增, 并根据扩增产物的大小区
分其基因型, W J158的基因种特异性 PCR扩增结果
见图 3
A。以 BCRG3A1 /BCRG3A2为引物成功扩
增出 400 bp左右的条带,与目的片段 ( 375 bp)大小
一致, 其它引物虽然可以扩增但产物大小不一致。
因此, 基因种特异性 PCR结果表明菌W J158的确属
于 B. cenocepacia, 与 recA RFLP鉴定结果一致。同
样, JWT16、G63YL和 JWT137基因种特异性 PCR产
物与W J158相同, 证实它们也属于 B. cenocepacia。
图 3
B显示分别采用引物 BCRBV1 /BCRBV 2和
BCRBM1 /C2
3对 JWP9和 JWT267进行基因种特异
性 PCR的结果, 如图所示, JWP9和 JWT267 PCR产
物大小分别约为 400 bp和 710 bp与目的片段相同,
证实 JWP9属于 B. vietnam iensis而 JWT267则属于
B. multivorans。因此, 综合 16S rDNA、recA RFLP和
基因种特异性 PCR的结果, 证明分离菌 JWT16、
G63YL、W J158和 JWT137均属于 B. cenocepacia菌,
JWP9属于 B. vietnam iensis, JWT267则属于 B. mul

tivorans。
A: M. M ark er; 1- 9.使用表 1中 9对基因种特异性引物对菌
W J158 PCR产物; B: M. M ark er; 1.引物 BCRBV1 /BCRBV2对菌
JWP9 PCR扩增产物; 2.引物 BCRBM 1 /C 2
3对菌 JWT267 PCR
扩增产物
图 3 基因种特异性 PCR结果
根据 NCB I库中相关菌的 recA基因序列和 6株
分离菌 recA基因序列的比对结果,用 MEGA软件将
它们之间的亲缘关系表现出来,结果如图 4。
图 4 分离菌和相关菌的基于 recA基因序列的系统发育树
3 讨论
根据文献报道, B. cepacia对多种抗生素均有耐
受性,尤其对青霉素类抗生素具很高耐受性 [ 17]。因
此, 本研究采用改良的 TB
T平板对土壤中 B. cepa

cia菌进行筛选。在 TB
T平板的基础上添加高浓度
的氨苄青霉素,进一步提高对 B. cepacia的检出率。
该方法与传统微生物筛选方法相比, 实现了对土壤
中 B. cepacia菌特异性筛选,极大提高 B. cepacia菌
的检出率,简化了试验步骤, 提高了整体效率。
随着对 B. cepacia研究的不断深入,越来越多的
基因种被陆续分离和鉴定出来, 而且它们之间无论
在基因结构、代谢方式等方面,还是在致病性、生产
应用等方面均有相当大的差异。根据报道, 已有多
种方法被用于 B. cepacia鉴定。本研究首先采用
16S rDNA鉴定, 然后结合H ae III
recA RFLP和基因
187
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 4期
种特异性 PCR对分离的 6株 B. cepacia菌进行基因
种鉴定,成功地将 6株菌鉴定到基因种水平。鉴定
结果表明,即便经过罗丹明 B的筛选, 获得的高产
脂肪酶 B. cepacia仍具明显遗传多样性。本研究鉴
定的 6株菌中有 4株是 B. cenocepacia ( III型 )菌,这
与在美国、加拿大和欧洲临床分离的 BCC菌群结果
基本一致 [ 18]。B. cenocepacia在临床上分离率较高,
但也表现出良好的生物防治效果 [ 19 ]。因此, 有必要
对分离得到 4株菌的生物安全性和生物防治效果做
进一步研究。
参 考 文 献
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