全 文 ：第７卷第５期
２００９年９月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．５
Ｓｅｐ．２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０５．００１
收稿日期：２００８－１２－２２
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）资助项目（２００６ＡＡ０２０２０３，２００７ＡＡ０５Ｚ４１７，２００７ＡＡ１００７０３）；教育部新世纪优秀人才基金资助
项目（ＮＣＥＴ０７０３３６）；武汉市攻关项目（２００７２０４２２１３８）
作者简介：汪小锋（１９８３—），男，湖北安陆人，博士，研究方向：微生物学；闫云君（联系人），教授，博士生导师，Ｅｍａｉｌ：ｙａｎｙｕｎｊｕｎ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ
洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶：
一种应用前景广阔的生物催化剂
汪小锋，贾 彬，刘 涛，杨江科，闫云君
（华中科技大学 生命与科学技术学院 分子生物物理教育部重点实验室，武汉 ４３００７４）
摘 要：洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶对有机溶剂（醇）、热、氧化剂、表面活性剂、去污剂、蛋白酶等具有良好的抗性，在
有机合成、对映体拆分、非水相催化等领域应用十分广泛。综述了洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的发酵生产、分离纯
化、基因克隆与表达、固定化与生物印迹、蛋白质结构解析及应用研究等，并展望了其未来发展方向，以期为该工业
酶的研发与广泛应用提供参考。
关键词：洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶；分离纯化；固定化；蛋白质结构
中图分类号：Ｑ８１４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０５－０００１－０７
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅｐａｃｉａｌｉｐａｓｅ：ａｐｏｔｅｎｔｉａｌｖｅｒｓａｔｉｌｅｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｆｏｒ
ｆｕｔｕｒｅｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｎｄｕｓｔｒｙ
ＷＡＮＧＸｉａｏｆｅｎｇ，ＪＩＡＢｉｎ，ＬＩＵＴａｏ，ＹＡＮＧＪｉａｎｇｋｅ，ＹＡＮＹｕｎｊｕｎ
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓｏｆｔｈｅＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅｐａｃｉａｌｉｐａｓｅ（ＢＣＬ）ｗａｓｆｏｕｎｄｔｏｈａｖｅｂｅｔｅｒｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｈｅａｔ，ｏｒｇａｎｉｃｓｏｌ
ｖｅｎｔｓ，ｏｘｉｄａｎｔｓ，ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ，ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，ａｎｄｐｒｏｔｅａｓｅ．Ｉｔｉｓｗｉｄｅｌｙａｐｐｌｉｅｄｉｎｏｒｇａｎｉｃｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ
ｏｆｒａｃｅｍｉｃｍｉｘｔｕｒｅｓ，ａｎｄｎｏｎａｑｕｅｏｕｓｅｎｚｙｍａｔｉｃｃａｔａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，
ｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ，ｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＢＣＬｗｅｒｅｓｕｍｍａ
ｒｉｚｅｄ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅｐａｃｉａｌｉｐａｓｅ（ＢＣＬ）；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ；ｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
洋葱伯克霍尔德菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅｐａｃｉａ，ＢＣ）
为Ｇ－杆菌，由美国微生物学家 ＷｉｌｉａｍＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ
自腐坏洋葱中分离出来，是一组基因型不同、表型
相近的细菌群，根据基因特征和表型特征至少可以
将Ｂ．ｃｅｐａｃｉａ分为１０个基因型［１］，称为洋葱伯克霍
尔德菌复合型（Ｂ．ｃｅｐａｃｉａｃｏｍｐｌｅｘ，简称 ＢＣＣ）。洋
葱伯克霍尔德菌脂肪酶（Ｂｃｅｐａｃｉａｌｉｐａｓｅ，ＢＣＬ）对多
种有机溶剂（醇）、热、氧化剂、表面活性剂、去污剂、
蛋白酶等有较好抗性，是目前在有机合成、洗涤剂
添加剂和非水相催化中应用最为广泛的脂肪酶之
一［２］。脂肪酶（ＥＣ３１１３）是一类特殊的酯键水
解酶，能在油水界面上催化脂类物质分解、合成和
酯交换等反应。作为重要的工业用酶，脂肪酶在食
品、制革、饲料、洗涤、油酯化工等传统工业领域应
用十分广泛［３］，在生物能源（生物柴油）、有机合成、
药物手性拆分和工具酶等新型应用领域前景也十
分广阔［４］。国外学者对ＢＣＬ研究，主要集中在分子
克隆、有机溶剂中的性质研究、酯合成、立体选择
性、对应体拆分以及结构与功能的研究等，关于发
酵工艺的报道较少。应用较多的是日本天野酶制
品株式会社（ＡｍａｎｏＥｎｚｙｍｅＩｎｃ）商品化的ＰＳ脂肪
酶。国内则只有本实验室对该脂肪酶进行了系统
的研究与开发，目前，在基因克隆、高效表达、分离
纯化、酶固定化、生物柴油制备应用等方面均取得
了一系列成果。本文就 ＢＣＬ的发酵生产、分离纯
化、基因克隆与表达、固定化、蛋白质结构及应用研
究作全面综述。
１ 发酵生产
国内外有关ＢＣＬ发酵的报道较少，不同菌株的
发酵条件存在较大差异。１９８８年，Ｌｏｎｏｎ等［５］从胆
囊纤维化肺炎病人体内分离出１０株产脂肪酶的洋
葱伯克霍尔德菌，发现活力最高菌株产生的 ＢＣＬ纯
化后，其相对分子质量大约为２５×１０４，最佳 ｐＨ为
９０，最佳反应底物为Ｔｗｅｅｎ４０。一般洋葱伯克霍尔
德菌最适生长温度为３０～３５℃，而 Ｒａｔｈｉ等［６－７］报
道了１株产ＢＣＬ的耐热菌 ＢｃｅｐａｃｉａＲＧＰ １０最适
生长温度范围为４５～５０℃。采用响应面法优化发
酵产酶条件，发现诱导时间、接种量和 Ｃ源质量浓
度是最重要的影响因素，减少 Ｃ源的供应可以缩短
脂肪酶生产的时间，蓖麻油为最佳诱导物，培养基
中 Ｃａ２＋和 Ｍｇ２＋浓度分别为 ０４ｍｍｏｌ／Ｌ和 ０６
ｍｍｏｌ／Ｌ时脂肪酶产量最高。将摇瓶中优化的产脂
肪酶培养基在１４Ｌ发酵罐中培养１５ｈ后比酶活达
到１６０Ｕ／ｍｇ。尹利等［８］也采用了响应面法对洋葱
伯克霍尔德菌产脂肪酶发酵条件进行了优化，发现
橄榄油、豆饼粉水解液以及初始 ｐＨ是最显著的影
响因素。汪小锋等［９］发现尿素、接种量以及初始ｐＨ
对Ｂｃｅｐａｃｉａ产脂肪酶影响显著，响应面法优化后的
试验条件能够在１０Ｌ发酵罐上成功实现放大。Ｆｅｒ
ｎａｎｄｅｓ等［１０］报道了以玉米糠为基质，质量分数５％
的玉米油为诱导剂固态发酵生产 ＢＣＬ，７２ｈ后的平
均比酶活为１０８Ｕ／ｇ，冻干的脂肪酶能直接应用到酯
化和转酯化反应中。
２ 分离纯化
脂肪酶的酶制剂产品分为粗酶制剂和纯酶制剂，
大多数工业应用不需要制备纯酶，然而纯化的程度会
影响酶的利用率，医药和化妆品中使用的脂肪酶对其
纯度要求较高，必须对粗酶制剂进行分离纯化才能满
足应用要求。Ｓｕｇｉｈａｒａ等［１１］采用Ａｃｒｉｎｏｌ杀菌处理发
酵上清液后，通过ＭａｃｒｏＰｒｅｐｍｅｔｈｙｌＨＩＣ疏水层析和
ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１００ＨＲ凝胶过滤两步纯化使ＢＣＬ纯化了
１１２０倍，收率为５４％。纯化后的ＢＣＬ相对分子质量
３６５×１０４Ｄａ，ＰＩ为５１，最适底物为中短碳链的甘油
三脂肪酸酯（Ｃ链长≤１２），能裂解三油酸甘油酯所有
的酯健，偏爱１，３位酯健；而Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ等［１２］将商品
化的ＰＳ脂肪酶用苯基 琼脂糖ＣＬ ４Ｂ柱层析纯化
后发现纯酶的相对分子质量３４１×１０４，ＰＩ为４３，偏
爱中长碳链（Ｃ链长≥８）和不饱和的甘油三脂肪酸
酯。在体积分数７０％ 的异丙醇体系中纯化 ＢＣＬ可
以有效防止脂肪酶分子的团聚［１３］，通过错流过滤、两
步异丙醇处理、液液萃取和疏水层析，脂肪酶被纯化
４００倍，收率为３０％。工业上，多采用双水相系统进
行脂肪酶的初步纯化。Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ等［１４］利用基于表面
活性剂（六乙二醇单十四醚）的双水相系统纯化了
ＢＣＬ，发现ＢＣＬ显示偏好富集于表面活性剂相，单步纯
化使脂肪酶浓缩了４倍，纯化了２４倍。黄瑛等［１５］采用
ＰＥＧ２０００（质量分数１０％）／磷酸盐（质量分数１５％）双
水相系统纯化了洋葱伯克霍尔德菌Ｇ ６３生产的脂肪
酶，脂肪酶纯化了３９８倍，最高回收率达到８７２５％。
３ 脂肪酶基因克隆与表达
ＮＣＢＩ核酸数据库中可以检索到９条 ＢＣＬ基因
序列，它们之间的同源性较高，序列相似性在８７％～
１００％之间。洋葱伯克霍尔德菌复合型产生的脂肪
酶几乎都具有耐有机溶剂和耐热性能以及在水相
和非水相中具有较高的催化活力和独特的催化性
质；但不同基因型的洋葱伯克霍尔德菌分泌的脂肪
酶的酶学性质方面也存在一定的差异，主要表现在
相对分子质量、等电点、底物特异性等方面［１１－１２］。
常规使用的细菌学鉴定方法很难将 ＢＣＣ以及与之
相似的细菌区分开，基于 ｒｅｃＡ基因限制性片段长度
多态性分析和特异基因序列分析以及全基因组水
平的分型等技术已经可以将洋葱伯克霍尔德菌复
合菌群区分开，这将对ＢＣＣ中基因型不同菌株产生
脂肪酶的研究具有重要意义。
目前，有关ＢＣＬ转录调控机制还没有完全被阐
释清楚。ＢＣＬ的转录受群体感应调控体系的影响。
Ｂｃｅｐａｃｉａ中至少存在２种不同的信号分子对脂肪
２ 生 物 加 工 过 程 第７卷
酶的转录调控起重要的作用［１６］。脂肪酶基因的转
录调节蛋白基因（ＬｕｘＲ）的失活也将极大降低了脂
肪酶的产量［１７］。洋葱伯克霍尔德菌分泌脂肪酶的
途径为 ＧＳＰ途径（ＧｅｎｅｒａｌＳｅｃｒｅｔｉｏｎＰａｔｈｗａｙ）。ＧＳＰ
途径分泌的脂肪酶具有Ｎ端信号肽，可被Ｓｅｃ复合
体识别，穿过内膜到达周质。在周质中，ＢＣＬ在特
异的分子伴侣蛋白帮助下形成正确的折叠构像，并
在Ｄｓｂ蛋白酶的作用下形成一个分子内二硫键，从
而形成有活性的脂肪酶。随后脂肪酶通过由１２个
Ｘｃｐ蛋白组成的孔状结构穿过外膜，分泌到胞外。
许多学者都发现ＢＣＬ基因 （ＬｉｐＡ）的表达需要
一个伴侣基因 （Ｌｉｆ）来帮助其折叠成有活性的构
象［１８］。ＬｉｐＡ编码４４个氨基酸的信号肽序列，ＬｉｐＡ
和Ｌｉｆ拥有一个共同的启动子，两者的比例为１∶１时
是未成熟的脂肪酶加工和分泌所必须的。由于大
多数产脂肪酶的伯克霍尔德菌是潜在的致病菌，实
现ＢＣＬ基因的异源表达具有十分重要的意义，许多
学者尝试将ＢＣＬ基因在大肠杆菌中表达，但成功实
现高效表达的很少。Ｔｒａｕｂ等［１９］将 ＢＣＬ基因在大
肠杆菌中表达，但发现表达蛋白以无活性的包涵体
形式存在，需要一个复杂的复性过程。这是由于大
肠杆菌中没有Ｓｅｃ复合体识别与转运系统，脂肪酶
在大肠杆菌中大量表达时通常形成包涵体。包涵
体的形成对克隆子的筛选也会造成一定的困难。
ＰｕｅｃｈＧｕｅｎｏｔ等［２０］最近开发了一种高通量的方法
筛选不同的ＢＣＬ重组子，极大地提高了筛选效率。
ＢＣＬ基因异源表达时，必需同时表达ＬｉｐＡ和Ｌｉｆ
才能获得有活性的脂肪酶。Ｌｉｆ的大量表达对宿主
细胞具有致死效应，因此，通过同源表达的方法提
高脂肪酶基因的拷贝数和细胞膜分泌蛋白的拷贝
数、增强分泌能力等途径提高脂肪酶的产量不失为
一种简单有效的方法。Ｙａｎｇ等［２１］将克隆到的 ＢＣＬ
的ＬｉｐＡ和 Ｌｉｆ连接在广泛宿主质粒 ｐＢＢＲ１Ｔｐ载体
上，通过三亲杂交，在辅助质粒 ｐＲＫ２０１３的帮助下，
转入原宿主菌ＢｃｅｐａｃｉａＧ６３中，构建的同源高效表
达基因工程菌的酶活力较原始菌株提高了３６倍。
目前，为了开发更加高效的同源表达系统，本课题
组正致力于构建基于 Ｔ７表达系统的洋葱伯克霍尔
德菌同源表达菌株。
４ 固定化与生物印迹
固定化方法是生物催化剂实现其工业化应用
的重要手段。与游离酶相比，固定化酶具有稳定性
好、易于分离、可以重复使用、反应条件易于控制等
优点。因此，ＢＣＬ的固定化研究也成为该脂肪酶研
究的一个热点。与游离酶相比，固定化后的脂肪酶
对底物特异性会发生改变。Ｐｅｎｃｒｅａｃ′ｈ等［２２］对比
研究了Ｂｃｅｐａｃｉａ脂肪酶的游离酶和固定化酶的性
质，发现固定化后的脂肪酶偏爱短链的脂肪酸酯，
而游离酶偏爱长链脂肪酸酯。ＢＣＬ在有机溶剂中
固定在多孔聚丙烯载体上后对广泛的底物有高活
性，但对长链脂肪酸酯的活性较低［２３］。
ＢＣＬ经固定化后，其最适反应温度升高，催化
酯化反应的活化能降低，且表现出良好的热稳定性
以及对短链醇的耐受性。不同的固定化材料以及
载体的疏水性对固定化脂肪酶的性质影响较大。
ＢＣＬ固定在陶瓷粒子（ＰＳ Ｃ）和硅藻土（ＰＳ Ｄ）
上，在非水相催化醛肟和酮肟的酰基化反应时，２种
脂肪酶的最适溶剂分别为四氢呋喃（ＴＨＦ）和二氧杂
环己烷（１，４ ｄｉｏｘａｎｅ）［２４］。溶胶凝胶固定化方法是
脂肪酶固定化中应用较为广泛的方法，以甲基三甲
氧基硅烷（ＭＴＭＳ）和四甲氧基硅烷（ＴＭＯＳ）等硅烷
耦连剂为前驱体制备的溶胶凝胶固定化 ＢＣＬ的活
性和稳定性与游离酶都得到了显著提高［２５－２６］。通
过简单的吸附，ＢＣＬ能与亲水性载体海藻酸钠进行
生物耦合，这种可溶性的生物耦合物使酶的活性和
稳定性都得到了提高，催化效率也大幅提高［２７］。
刘涛［２８］采用大孔树脂固定化洋葱伯克霍尔德菌
脂肪酶，使固定化脂肪酶的机械强度、酶活力以及稳
定性均得到大幅提高。固定化酶蛋白比活力游离酶
提高了１５４倍，将大孔树脂固定化法与脂肪酶的生
物印迹方法相结合，固定化脂肪酶比活力提高了
１９４％。最近生物印迹作为一种改良酶学特性、扩大
脂肪酶工业应用领域的新兴技术正越来越受到人们
的重视。曹雄文等［２９－３０］系统研究了生物印迹与溶胶
凝胶固定化相结合的方法对ＰＳ脂肪酶酯化活力的影
响，并初步探讨了生物印迹的机制。以 ＭＴＭＳ和
ＴＭＯＳ为前驱体，月桂酸为印迹分子，在最优反应条
件下，印迹酶相对于游离酶比活力提高了４４３倍，相
对于未印迹固定化酶提高了２４倍。印迹分子的疏
水性与底物分子的相似性对印迹效果影响较大，疏水
性越强，与底物分子相似性越大，印迹效果越好，印迹
分子对脂肪酶酯化活力的提高主要通过影响聚合物
的结构来改变固定化酶的酶活。
５ 蛋白质结构
目前，许多脂肪酶的蛋白质结构已经被解析，
３ 第５期 汪小锋等：洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶：一种应用前景广阔的生物催化剂
ＮＣＢＩ结构数据库中收录 ＢＣＬ的３Ｄ结构信息有９
条（检索方法：ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅｐａｃｉａＡＮＤｌｉｐａｓｅ）。
１９９７年，ＢＣＬ的３Ｄ结构先后被多位学者解析［５，３１］，
结构显示脂肪酶包含１个α／β水解折叠结构和催化
三联体Ｓｅｒ８７，Ｈｉｓ２８６，Ａｓｐ２６４，活性中心有１个钙离
子结合位点，Ｇｌｎ８８和 Ｌｅｕ１７的氨基Ｎ在β３链和β４
链环状结构的 Ｃ末端形成阴离子氧洞。ＢＣＬ结构
暴露了１个溶剂易于接近的活性位点高开放构象。
这个结构表明细菌脂肪酶界面激活涉及二级结构
的改变和大幅度的移动盖子结构使活性位点暴露
出来。Ｌａｎｇ等［３２］发现甘油三酯与 ＢＣＬ反应时有４
个结合的“口袋”结构，１个阴离子氧洞和３个与甘
油三酯ｓｎ １、ｓｎ ２和 ｓｎ ３脂肪酸长链相匹配的
“口袋”。
为了合理设计和有效预测 ＢＣＬ与底物在有机
合成反应中的反应性和对映选择性，许多学者致力
于数学模型的开发研究。Ｌｅｍｋｅ等［３３］开发了基于
３（ａｒｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎ２ｏｌｓ反应动力学的脂肪酶活性
位点的三维结构模型。该模型能解释和预测是否
接受化合物作为底物，并能够评价脂肪酶催化反应
的对映体选择性。ＢＣＬ脂肪酶是生产高对映选择
性的手性仲醇中应用最为广泛的催化剂之一，它的
对映偏爱性主要取决于底物的结构，对映选择性取
决于脂肪酶与底物原子的相互作用。Ｓｃｈｕｌｚ等［３４］
构建分子模型预测 ＢＣＬ对广泛的仲醇和芳香二级
醇的对映选择性。Ｈｗａｎｇ等［３５］通过计算机辅助建
立分子模型研究ＢＣＬ对各种饱和γ 内酯和δ内酯
的对应选择性，发现 ＢＣＬ优先水解底物中的（Ｒ）
对映体。Ｇｅｎｔｎｅｒ等［３６］建立了预测ＢＣＬ与伯醇环状
结构的对映体选择性的数学模型，发现只有偏爱性
的对映体进入“Ｈｉｓ沟”（由 Ｈｉｓ２８６和 Ｌｅｕ２８７形
成），模型与实验数据吻合较好。ＢＣＬ是唯一１种
对多种伯醇有高对映体选择性的微生物脂肪酶，通
过改变活性中心附近 Ｖａｌ２６６和 Ｌｅｕ１７之间的距离
可以显著改善ＢＣＬ对伯醇的选择性。最近，Ｖｉｌａｒｅ
ａｌ等［３７］基于ＢＣＬ的结构开发了一个模型对ＢＣＬ催
化外消旋的１ 苯基乙醇的对映选择性机理进行了
深入研究，发现ＢＣＬ在水相和有机相中表现出不同
的对映选择性，对映选择性的改变是由于脂肪酶分
子的构象发生改变所致。
６ 洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的应用
酶在非水相中仍具有催化活性这一发现大大扩
展了酶在化工中的应用。当转化的底物在水溶液中
的溶解度较低或不稳定时，非水相催化反应是较好的
选择。ＢＣＬ因对多种有机溶剂具有较高的抗性，因此
成为非水相催化应用最为广泛的脂肪酶之一。催化
转酯化反应生产生物柴油、精细化工产品以及外消旋
化合物的对映体拆分是目前ＢＣＬ应用最多的领域。
６１ 酯合成与生物柴油的生产
游离的ＢＣＬ在水相、微乳相和有机溶剂中均具
有水解活力，固定化ＢＣＬ在非水介质中有较高的酯
合成和转酯活力，能催化多种酯的合成和转酯化生
成多种化合物（如生物柴油）。有机溶剂中 ＢＣＬ催
化酯合成制备氢化肉桂醛酯的转化率能达到
７０％～８０％，某些酯采用转酯化反应的转化率要比
酯合成高［３８］。转酯化的效率与有机溶剂的疏水性
密切相关，ＢＣＬ偏爱高疏水性的溶剂（如正己烷）。
ＢＣＬ脂肪酶在有机溶剂反应体系和无溶剂反
应体系中，都表现出很高的催化活性和强甲醇抗
性，并随体系中水分含量的减少而提高。酶法生产
生物柴油时，甲醇可以一次性加入到含有高甲醇抗
性脂肪酶的反应体系中，使生产工艺得以简化。所
以，ＢＣＬ是一种在酶法催化生产生物柴油中极具应
用前途的脂肪酶。Ｎｏｕｒｅｄｄｉｎｉ等［２６］以溶胶凝胶固定
化ＢＣＬ催化大豆油转酯化反应生产生物柴油，最佳
反应条件下脂肪酸甲酯和乙酯的转化率分别达到
６７％和６５％。Ｈｓｕ等［３９］以页硅酸盐溶胶凝胶固定
化的ＢＣＬ（ＩＭＢＳ ３０）为催化剂，在无溶剂体系的
填充柱反应器中催化乙醇和餐饮废油转酯化反应
生产生物柴油，反应４８ｈ，脂肪酸乙酯转化率大于
９６％。Ｓｈａｈ等［４０］以硅藻土载体固定 ＢＣＬ为催化
剂，在无溶剂体系中催化麻疯树油转化生产生物柴
油，８ｈ转化率就高达９８％，固定化脂肪酶重复利用
４次生物柴油转化率都保持不变。刘涛［２８］在无溶
剂体系中采用大孔树脂固定化 ＢＣＬ催化大豆油制
备生物柴油，反应８ｈ其甲酯得率可高达９８９８％，
并且固定化酶表现出很好的操作稳定性，连续反应
１０个批次，其甲酯得率仍保持 ９２％以上。助溶剂
（叔丁醇等）能够大大提高酯交换反应速率［４１］，从
而提高生产设备的效率，降低能耗，受到人们的普
遍重视。随着有机溶剂中固定化 ＢＣＬ催化生产生
物柴油研究的不断深入，生物柴油的生产效率和转
化率还将得到进一步提高。
６２ 有机合成与对映体拆分
ＢＣＬ在水相和非水相中都具有较高活性，对有
４ 生 物 加 工 过 程 第７卷
机溶剂具有耐受性，是绿色生物催化工业中应用前
景十分广阔的脂肪酶之一。ＢＣＬ能够催化合成 β
氨基化合物、医药中间体以及许多手性化合物，对
顺式异构体具有偏爱性。微生物脂肪酶被广泛应
用于光学异构体的拆分上，是目前国内外研究较多
的拆分方法。这使得以 ＢＣＬ为催化剂工业化生产
化工产品具有巨大的市场潜力。Ｋａｎｅｒｖａ等［４２］研究
了ＢＣＬ在有机溶剂中催化合成了接近对映纯的 β
氨基酸酯，以２，２，２ 三氟氯乙酸酯为助溶剂催化合
成十脂环族的β氨基羧酸乙酯时ＢＣＬ的立体选择
性得到显著提高。左羟丙哌嗪化学合成一般是外
消旋的羟丙哌嗪，在有机溶剂中采用固定化的 ＢＣＬ
能够高效拆分羟丙哌嗪的外消旋化合物得到对映
纯的Ｒ 羟丙哌嗪［４３］。薄荷醇是一种重要的医药中
间体，以甲基丙烯酸肟作为酰基受体，固定化的ＢＣＬ
在二异丙基醚中催化（±）薄荷醇合成手性的甲基
丙烯酸薄荷酯单体（ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅｅｓｔｅｒｏｆ（）ｍｅｎ
ｔｈｏｌ）的收率可高达９６％，ｅｅ值为９８％［４４］。洋葱伯
克霍尔德菌也可以作为一种全细胞催化剂应用于
外消旋体的拆分。Ｙｕ等［４５］以 ＢＣＬ全细胞催化 ＤＬ
薄荷醇乙酸酯制备 Ｌ 薄荷醇，对映选择率 Ｅ＝
１７０，转化率为５０％，ｅｅ值为９６％。
６３ 离子液体中的催化
离子液体作为溶剂已经在聚合反应、选择性烷
基化和胺化反应、酰基化反应、酯化反应、支链脂肪
酸的制备等方面得到应用，并显示出反应速率快、
转化率高、反应的选择性高、催化体系可循环使用
等优点。最近，ＢＣＬ在离子液体中的催化反应吸引
了许多学者的广泛关注。
Ｎａｒａ等［４６］报道了离子液体［ｂｍｉｍ］ＰＦ６中以
ＰＣＬ Ｃ催化二乙基辛基 １，８ 乙二酸锡盐和１，４
丁二醇的缩聚反应，ＢＣＬ在离子液体［Ｃ４ＭＩｍ］ＰＦ６
中催化氟脲苷苯甲酰化反应，其酶活力和区域选择
性也显著提高［４７］。在离子液体［ｂｍｉｍ］ＰＦ６中，固定
化的ＢＣＬ（ＰＳ Ｃ）能以琥珀酸酐作为酰基受体催化
外消旋二级醇制备对映纯的单体，添加三乙胺能显
著提高反应速率［４８］。Ｓｈａｈ等［４９］报道 ＢＣＬ交联酶
晶体能在离子液体［ｂｍｉｍ］ＰＦ６介质中高效拆分（Ｒ，
Ｓ） １ 苯基乙醇，２ｈ的转化率就高达５０％，ｅｅ值达
到９９％，对映选择率 Ｅ＞１０００，而游离脂肪酶转化
率仅达８％。
６４ 洗涤剂工业中的应用
当前脂肪酶已成为洗涤剂行业中添加的第２大
酶制剂，它不仅能高效地将油脂污垢分解成脂肪酸而
被除去，还有利于环境保护。废水处理时加入一定量
的脂肪酶，可高效除去脂肪，减少废水处理的成本和
降低二次污染。ＢＣＬ因具有强烈的抗氧化性以及良
好的兼容性，在洗涤剂中添加 ＢＣＬ具有很大优势。
Ｒａｔｈｉ等［６］报道了一种来自洋葱伯克霍尔德ＲＧＰ １０
的新型碱性脂肪酶在洗涤剂工业中具有重要的应用
价值。该碱性脂肪酶能兼容各种离子型和非离子型
表面活性剂以及商业洗涤剂。在室温下，ＢＣＬ有很强
的抗氧化性，与Ｈ２Ｏ２，ＮａＢＯ３和ＮａＣｌＯ等混合１ｈ活
性保持不变。这种酶能耐受各种商业碱性蛋白酶，甚
至在５０℃下经蛋白酶处理１ｈ仍可保留完整活性；
该脂肪酶还表现出较好的稳定性，比已商品化的Ｌｉ
ｐａｓｅ更加适合于加入到商业洗涤剂中。
７ 结语与展望
面对资源、能源和环境的挑战，开发资源节约型
和环境友好型的化学工艺势在必行，非水相酶学的迅
猛发展为化学工艺开辟了广阔的天地。作为非水相
酶学研究热点的脂肪酶更是受到研究者的重视。
脂肪酶的成本是制约其大规模工业化应用的
瓶颈问题。商品化的 ＰＳ脂肪酶价格较高（粗酶约
６０００元／ｋｇ，蛋白质量分数为０６％），如何降低ＢＣＬ
的制备和使用成本已成为当前研究开发的重点。
降低ＢＣＬ的制备和使用成本的途径很多，通过传统
方法筛选与改良野生菌株、构建高效的同源与异源
表达的基因工程菌株、开发先进的发酵控制工艺和
分离纯化工艺以及固定化研究等都能有效降低脂
肪酶的成本。洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶是一种酶
学性质十分优良的细菌脂肪酶，也是目前应用最为
广泛的脂肪酶之一，随着国内外对该脂肪酶研究的
不断深入以及成本的降低，该脂肪酶的应用将拓展
到更多工业应用领域。
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７ 第５期 汪小锋等：洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶：一种应用前景广阔的生物催化剂