全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 8 期
统合生物工艺与纤维素分解性高温菌
乙醇转化的研究进展
赵立峰 严金平 孙焕民 伊日布斯
(昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明 650224)
摘 要: 生物乙醇是可再生的绿色能源，作为可以完全或部分替代化石能源的新型能源，近年来受到了世界各国的关
注。木质纤维素作为生物乙醇的生产原料具有巨大的市场潜力，而统合生物工艺(CBP)能有效降低木质纤维素乙醇的生产成
本，为纤维素乙醇的工业化生产提供了新的工艺思路。主要介绍利用高温纤维素分解菌的统合生物工艺策略以及国内外对
高温纤维素分解菌代谢工程研究的最新进展。
关键词: 木质纤维素 生物乙醇 统合生物工艺 高温纤维素分解菌 代谢工程
Progress on Research of Consolidated Bioprocessing(CBP)and Ethanol
Conversion of Thermophilic Cellulolytic Bacteria
Zhao Lifeng Yan Jinping Sun Huanmin Irbis Chagan
(Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650224)
Abstract: Being the alternative energy which can completely or partially take the place of the fossil energy，the bioethanol is a
kind of renewable and clean solution that has attracted the world＇s attention in recent years． The lignocellulosic biomass，which can be
the material of the bioethanol，has immeasurable market potential． Consolidated Bioprocessing (CBP)can effectively reduce the cost of
cellulose ethanol and provide a new strategy for the industrial production． In this review，we summarized the native strategy of the CBP
and the update progress in the metabolic engineering of thermophilic cellulolytic bacteria．
Key words: Lignocellulose Bioethanol Consolidated bioprocessing Thermophilic cellulolytic bacteria Metabolic engineering
收稿日期:2011-02-25
基金项目:云南省科技计划项目社会发展科技计划(2009CD038)
作者简介:赵立峰，男，硕士研究生，研究方向:高温厌氧菌乙醇发酵的预处理技术研究;E-mail:zhxj11@ yahoo． com． cn
通讯作者:伊日布斯，男，教授，硕士生导师，E-mail:irbisc@ gmail． com
目前全球面临着能源短缺和环境污染的严峻挑
战，而生物乙醇作为一种可再生的清洁能源，具备资
源丰富、燃烧性能好、储备运输方便等优点，近年来
备受关注。当前的乙醇生产方式主要以淀粉或糖类
为原料，因其消耗大量粮食资源并占用耕地面积，存
在很大的局限性。木质纤维素是地球上最丰富的有
机物质，而以木质纤维素为原料的燃料乙醇，作为可
以缓解能源危机、减轻环境污染的可再生绿色能源，
已经引起了世界各国的高度重视［1］，是具有巨大市
场前景的新能源产业。
但是，由于木质纤维素原料的特殊性，目前木质
纤维素乙醇的生产工艺遇到两个主要的技术瓶颈。
首先，纤维素酶成本过高，酿酒酵母不能直接利用木
质纤维素原料中的多糖组分，必须依赖酶类将其水
解为单糖。因此，纤维素乙醇工艺中需要一个独立
于糖化与发酵过程的纤维素酶的生产环节。而目前
纤维素酶产业中常用菌里氏木霉(Trichoderma ree-
sei)的产酶量少、活性低、酶的最适 pH 值和反应温
度与发酵菌的不一致导致了酶水解效率低、用酶量
多［2，3］，所以导致酶的成本过高。其次，缺乏能够高
效利用戊糖的发酵菌株。木糖、阿拉伯糖等戊糖来
源于半纤维素组分，而半纤维素通常占植物纤维原
料总量的 10% －40%［4］。同纤维素相比，半纤维素
更容易被水解，其水解产物中含有的大量戊糖不能
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
被酿酒酵母所利用，导致原料的乙醇转化率降低，影
响了木质纤维素原料转化乙醇的经济效益。鉴于
此，2002 年 Lynd等［5，6］提出了一种适用于木质纤维
素乙醇生产的新型统合生物工艺(consolidated bio-
processing，CBP)技术。该技术是将纤维素酶和半纤
维素酶的生成、纤维素和半纤维素多糖成分的水解
以及发酵生成乙醇的一系列生物催化过程由一种或
一组微生物完成的生物乙醇生产工艺。它可以简化
同步糖化发酵法(simultaneous saccharification and
fermentation，SSF)或同步糖化共发酵法(simultane-
ous saccharification and cofermentation，SSCF)［7］等传
统工艺中的纤维素酶的生产过程。据报道，CBP 技
术的实施可以将木质纤维素乙醇的生产成本降低至
4． 23 美分，只需 SSCF 工艺 NREL 模式的 1 /4 的费
用［5］。因此，CBP可以作为有望大幅度降低乙醇生
产成本的新型发酵工艺。
CBP技术能否实现产业化的关键在于如何选
育适合的发酵微生物，该技术要求发酵菌有较高的
纤维素分解代谢功能和产乙醇的能力。然而，目前
适合于 CBP 技术条件的天然菌种并不存在。基因
重组技术为理想工业菌株的构建提供了可能，研究
者们正利用代谢工程技术从两个不同方面研究相应
的对策，分别是天然纤维素分解性策略(native cel-
lulolytic strategy)和重组纤维素分解性策略(recom-
binant cellulolytic strategy)［5，6］。
1 天然纤维素分解性策略
天然纤维素分解性策略是对具备纤维素分解功
能的微生物进行改造，使其乙醇产率和乙醇耐受性
得到提高，以适应 CBP技术的生产要求。目前对于
天然纤维素分解性策略研究较多的是溶纤维素梭状
芽孢杆菌(Clostridium cellulolytium)和热纤维梭状芽
孢杆菌(Clostridium thermocellum)等高温厌氧纤维
素分解细菌［8］。高温纤维素分解细菌不仅可以降
解纤维素、半纤维素等复杂的碳水化合物产生戊糖
和己糖［9，10］，还可将降解产物转化为乙醇。另外，
高温纤维素分解细菌具有对 pH、温度、环境的适应
能力强［11 － 13］等适合于工业菌种的特性［9，14］。利用
高温纤维素分解菌进行乙醇发酵不仅可以提高生物
催化反应速度和乙醇转化效率、避免乳酸菌等杂菌
的污染［15，16］，而且高温条件还有利于乙醇的回收［11］。
1. 1 高温纤维素分解菌的遗传转化体系的研究
高温纤维素分解菌的代谢工程改造，首先需
要建立其遗传转化体系。但是，由于高温纤维素
分解菌的内源性质粒未被开发，同时也缺乏适合
高温重组子筛选的耐高温筛选标记等原因，高温
纤维素分解菌遗传转化体系尚不够成熟。近年
来，很多研究都针对高温纤维素分解菌开发高效
遗传转化方法，为高温纤维素分解细菌的基因敲
除和外源基因表达的研究开发了分子生物学工
具，为其代谢途径的改造奠定了分子生物学基
础［17 － 19］。1997 年 Mai 等［17］将来自 Streptococcus
faecalis 质粒 pKD102 的耐高温卡那霉素抗性基
因插入到 Escherichia coli-Clostridium acetobutyli-
cum 的穿梭质粒 pIMP1 的多克隆位点上，首先构
建了高温厌氧菌的表达质粒 pIKM1，并利用电穿
孔的方法成功转化了高温厌氧性革兰氏阳性
菌———嗜热厌氧菌(Thermoanaero bacterium)。在
此基础上，2004 年 Tyurin 等［18］利用电转化技术，
针对热纤维梭状芽孢杆菌也开发了高效率的遗
传转化方法。高温纤维素分解细菌遗传转化体系
的建立，为高温纤维素分解菌的基因工程改造提
供了可能。
1. 2 高温纤维素分解菌的代谢工程改造
高温纤维素分解菌的乙醇发酵过程中，往往
伴随乳酸、乙酸等有机酸的产生。这些副产物的
产生不仅减少了乙醇的产率，还抑制了发酵菌种
活性［20］，因此天然高温纤维素分解菌的乙醇产
量比较低［9，14］。该问题的解决可通过代谢工程
技术改造发酵菌株的代谢途径，如阻断其乳酸和
乙酸产生的代谢旁路，抑制有机酸的生成，促使
代谢朝乙醇合成方向转化，提高高温纤维素分解
菌的乙醇产率。虽然利用代谢工程改造纤维素
分解菌代谢途径的研究起步较晚，但目前已经取
得了一定的成果。
1. 2. 1 代谢旁路关键酶基因的敲除 1989 年，
Tailliez等［21］就通过紫外线诱变育种的方法破坏了
C． thermocellum的乳酸脱氢酶基因(ldh) ，获得的突
变菌株的乙醇产量提高了 7. 5 g /L。2004 年 Desai
等［17］首次构建了高温厌氧菌 Thermoanaerobacterium
saccharolyticum JW /SL-YS485 乳酸脱氢酶基因为目
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2011 年第 8 期 赵立峰等:统合生物工艺与纤维素分解性高温菌乙醇转化的研究进展
标的自杀质粒 pSGD8，并利用该质粒成功的敲除了
T． saccharolyticum JW /SL-YS485 的乳酸脱氢酶基
因，失活了该菌的乳酸脱氢酶，从而切断了乳酸生成
的代谢通路。但是与野生型菌株相比，该菌的乙醇
和乙酸的产量并没有显着的增加。在此基础上，
Shaw 等［22］又构建了高温厌氧菌 T． saccharolyticum
乙酸激酶(ack)和磷酸乙酰转移酶(pta)基因的自杀
质粒 pSGD9，利用该自杀质粒和质粒 pSGD8 研究者
成功敲除 T． saccharolyticum 的乳酸脱氢酶、磷酸乙
酰转移酶和乙酸激酶的基因，从而切断了乳酸和乙
酸的生成，得到了双基因敲除突变株 ALK2(ldh －和
ack /pta －)、单基因敲除突变株 ldh －和 ack /pta －等 3
种工程改造菌。分批发酵结果显示，菌株 ALK2 对
葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖的利用率均超过
92%，最终乙醇浓度可高达 37 g /L，且无其他副产物
的产生。2009 年 Cripps 等［23］利用基因敲除技术改
变热葡糖苷酶地芽孢杆菌 Geobacillus thermoglucosi-
dasius NCIMB11955 和 G． thermoglucosidasius DL33
的代谢途径，使碳代谢途径的混合酸代谢流转向乙
醇，从而达到了提高乙醇产量的目的。结果显示，重
组菌株的乳酸产量明显减少，乙醇产量得到了一定
的提高，但在突变菌中仍然检测到丙酮酸的积累。
该研究团队还成功敲除丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)基
因、上调表达丙酮酸脱氢酶基因(pdh)并得到了突
变株 TM242(ldh －，pdhup，pfl －)。该菌株具有葡萄
糖代谢速率快、丙酮酸积累少等特性，并且乙醇产率
高达 0. 42 g /g;利用纤维二糖时的乙醇产率达
0. 47 g /g，是理论最大产率的 92%。
1. 2. 2 引入外源乙醇生成途径 2008 年，Thomp-
son等［24］构建了含有 Zymomonas mobilis 丙酮酸脱
羧酶 (pdc)基因的 Geobacillus-E． coli 穿梭质粒
pBST22:ZYM，将其导入乳酸脱氢酶缺失突变菌 G．
thermoglucosidasius NT中，并检测了转化菌 G． ther-
moglucosidasius NT pBST22:ZYM 的产物代谢情况。
结果表明，在 52℃培养条件下可以检测到来源于 Z．
mobilis丙酮酸脱羧酶基因的表达及其酶的活性，其
胞外丙酮酸浓度比野生菌减少了 42 mmol /L，乙醇
和甲酸产量分别增加了 167 和 57 mmol /L。Guedon
等［25］也尝试在 C． cellulolyticum ATCC35319 中同时
表达来源于 Z． mobilis 的丙酮酸脱羧酶(PDC)和乙
醇脱氢酶(ADH) ，在受体菌中构建了新的乙醇生成
的代谢途径，结果与野生型受体菌株相比，重组菌的
纤维素利用率增加了 150%，细胞干重增加了
180%，细胞中丙酮酸积累量下降了 60%。而且重
组菌中检测到 0. 58 U /mg PDC活性，ADH的活性也
增加了 71%，代谢产物中乳酸产量减少了 48%，乙
醇和乙酸产量分别增加了 53%和 93%。2008 年卲
蔚蓝等［26］构建了含有乙醛 /乙醇脱氢酶(adhE)基
因的 Thermoanaerobacter ethanolicus-E． coli 穿梭质粒
pTE16 并通过电转化导入 T． ethanolicus JW200 中，
使 T． ethanolicus JW200 过量表达乙醛 /乙醇脱氢酶
(AdhE)。结果显示，在重组菌 JW200-adhE中 AdhE
活性比野生型 JW200 AdhE 活性高 3 倍，乙醇产量
也高于野生型菌株。
2 重组纤维素分解性策略
重组纤维素分解性策略指的是利用基因重组技
术将纤维素酶基因等外源基因导入原本没有纤维素
分解能力的乙醇发酵菌中，改良了该菌的某些性状
或增加新特性，从而扩大可利用碳源的范围，缩短发
酵时间，提高生产效率。近年来，通过基因重组技术
解决 C6 /C5糖共发酵难题的研究已在一些微生物中
获得部分成功，如常见的发酵菌株 Saccharomyces
cerevisiae ［27］、Z． mobilis ［28］和 E． coli ［9，14］。但是，这
些工程菌对 C5糖的乙醇转化率还远达不到对葡萄
糖的转化率，还有待进一步研究和开发才能真正解
决生产工艺中提高半纤维素利用率的实际问题。此
外，研究人员还试图通过代谢工程的方法表达纤维
素酶基因或半纤维素酶基因，使酿酒酵母等能直接
以纤维素、半纤维素为碳源，将来源于木质纤维素的
糖类大部分或全部进行发酵［29］。例如，可以表达
纤维素酶的 Klebsiella oxytoca工程菌，虽然提高了对
微晶纤维素的水解能力，但其表达的酶活量还不足
以使其在纤维素培养基上生长增殖［30，31］。日本神
户大学 Kondo 实验室［32］在不同酵母表面表达了纤
维素酶［33］、木聚糖酶［34］和淀粉酶［35］等 3 种酶，可以
发酵纤维素、粗淀粉和桦树的木聚糖，乙醇转化量分
别达到 0. 45、0. 40 和 0. 30 g /g 底物。欧阳嘉等［36］
在酿酒酵母和毕赤酵母(Pichia pastoris)中成功转化
了 T． reesei木聚糖酶基因的重组菌分泌的木聚糖酶
活力可分别达 9. 59 IU /mL和 1. 45 IU /mL。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
3 高温纤维素分解菌 CBP工艺共培养策略
共培养有两层含义:一是指发酵液中存在不同类
型的微生物，可利用广泛类型的糖类底物。例如将仅
能具有分解纤维素、半纤维素的功能，但因不能利用
木糖的热纤维梭状芽孢杆菌与能利用戊糖的热硫化
氢梭菌(Colstridium thermohydrosulphaircum)的混合培
养，这能避免不同微生物间的底物竞争，提高了乙醇
产量［37，38］。二是指存在不同特性的微生物相互协
作［39，40］，加强发酵效果。如 Kohji 等［41］构建的利用
高温微生物协同作用高效降解木质纤维素原料的共
培养系统。该系统是由具有纤维素分解能力的微好
氧高温菌和半纤维素分解性高温乙醇发酵菌组成，因
此能直接利用纤维素和半纤维素并将其转化生产乙
醇。试验结果显示，菌株 kpu03 和 kpuA1 与菌株
kpu04和 kpuB3的共培养将菌株 kpu03和 kpu04单独
培养的乙醇产量分别提高了 4 和 2. 5 倍。因此，利用
高温菌的组合系作为发酵微生物不仅能通过纤维素、
半纤维素分解菌的协同作用提高木质纤维素分解率，
还能提高对多糖水解产物(包括 C6糖和 C5糖)的利用
率，从而提高原料的乙醇转化率。
除了以上研究报道，目前已研究过的能在共培
养体系中增加乙醇产量的微生物还有嗜热厌氧乙醇
菌(T． ethanolicus)、嗜热硫化氢梭菌(Clostridium
thermohydrosulfuricum)、嗜热解糖梭菌(Clostridium
thermosaccharolyticum)［25］等。
4 展望
统合生物工艺由于统合了传统工艺中纤维素酶
和半纤维素酶的生产、多糖的水解和乙醇发酵的过
程，作为木质纤维素的转化工艺具备了成本和工艺
的优势，被视为目前最有发展前景的发酵工艺。高
温纤维素分解菌作为 CBP工艺的功能菌种，其代谢
工程的研究已经取得一定的进展，但是包括上述采
用分子生物学技术重构代谢网络的代谢工程研究，
无论是通过阻断代谢旁路的策略还是通过引入外源
代谢途径来提高目的代谢产物产量，产物的得率都
还未能达到理想的工业生产要求。对高温菌代谢工
程改造的研究，在定向改变代谢流量的同时，还应加
强从系统生物学的角度研究代谢途径的重构对菌株
细胞的影响。在提高目标代谢产物产量的同时优化
微生物细胞适应这种改变的生理活性，强化细胞还
原力的再生、提高糖酵解途径的速度等研究是进一
步提高高温纤维素分解菌将木质纤维素转化产物得
率的关键之一。
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(责任编辑 狄艳红)
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