全 文 ：健物杖术通报
研 究报 告 刀云口2万日阴W 双刀 6 Y B U 兀L E Z I N 2 (X 拍 年 增 刊
鸡球虫 185 rR NA 基因序列的测定与分析
王鑫 2 韩红玉 姜连连 赵其平 董辉 韩静芳 黄兵
( , 中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室 ,上海 20 241 ;
,聊城大学材料科学与工程学院 ,聊城 252059 )
摘 要: 为了利用 185 rR N A 基 因进行鸡球虫系统进化分析 ,对巨型艾美耳球虫(五示二 二m :) 柔嫩艾美耳球虫(丑
ten 山 )堆形艾美耳球虫(E .:ce邝叻n:)3 种共8 个不同来源的虫株 ,分别提取总 D N A 进行 18 5 rR N A 基因的扩增和测序;将得
到的序列登录 G enB al止进行同源性和趋异性分析, 并结合 G enB an k 中其它原虫的 18 5 rR N A 基因序列构建进化树结果显示
扩粉获得 8 株鸡球虫 185 rR N A 基因长度为 1 746 一1 756 bP ,序列比对显示同种不同株间的同源性大于不同种间的同源性 ,其
中3株 E .一 株间同源性在 98 .7% 一99.3% 之间, 4 株E . ten 山 株间同源性在 9 .7% 一9 .9% 之间;不同种间同源性为 % .5%
98.1% ,其中E .~ 与 E .比nela 的遗传距离最大 ,为0.03 8;E .m 翻ma 与 E. :eervu 石n:的遗传距离最小 ,为0.02 1顶复器门
9 个不同属所构建的进化树结果显示, E.如eria 和等抱属(IsosP )来为一支,说明亲缘关系比较近 与 G enB an k 中其它5 株不
同鸡球虫的 185 rR N A 基因共同构建的进化树显示, 3 株E .m ~ 聚为一支, 与E . bIun eti E . E .ha E .pox 和 丑
ac e口创如a聚为一大分支;4 株E . ten eBa 与 1株 E .neca tnx 共同形成一个分支 , 说明E .te neHa 与 E .ne ca 二 的亲缘关系最近 本
研究证实了在鸡球虫系统进化研究中 .185 rR N A 基因不仅可以区分不同种 ,而且有可能成为区分同种不同株的理想靶基因
关位词: 鸡 球虫 艾美年球虫 185 rR N A 序列分析 系统进化
S e q u en ce a n d Ph y lo g ene ti c A n a ly sis of 18 5 rR N A G en e fo r
到初e力油 11 C h ick en
w an g Xi n ,2 H an H on邵川, Jiang Li ar山an , Zha o Q ipin g D ong H 山, H an jin沙ng , H ua雌 B in ,
产sha 叨俪 Ve te ri加勺 Re se , h Ins ti映 , Ch ine se Ac 政 my of A乎犯动砚叮以反记nc es , Ke y L砧吻 叮of A ni耐 尸盯山如2叨 of Mi nis try
of A梦ic曲, , Mi 汕四堵Sha 吻诫 2坎刀41,. 悦爪刃之of M宙er云山 反交二& E呼 , e八林g , L~ he 喀 枷 摊tiy , 乙~ he ng Z, 2仍刃
A bs tra ot : T o an 习 ysis th e sequenees an d re lati ons hiP of 185 rR N A 罗ne of E加lena in ehi cken , th e 罗nomi e D N A of 8 5湘 ns of
E加 ena w ere exOlcted. The 185 rR N A ge nes w ere axn Plified 师 pC R res Pectivelv . Th e re sul ts of th e sequenei雌 show that the 18,
讯N A 如脚 en w ere betw een 1 746 bP to 1 756 bP . c o哪 are d of al sequenees indi eated th ere w ere som o di fre renees am ong the s
s廿aJ 们比 . T he di sc reP胡 cy was gre ate r betw een sPecies tha卫1 5渔i卫ls. T 坛 51比山州 ty w 怒 98 .7 % 一 99 .3% in 3 5阅 ns o f E . 功~ : and 99 .7 %
一卯 .9 % in 4 5比Lin s o f 五. ten 山 , th en th e s访公 ty was 96 .5 % 一98 .1% . betw een 3 , ecies o f E 加 由 . T he 罗 neti e di stan ee of 185
rR N A 乎n es 如 m 8 5~ of E im eri a rev eal ed that th e 6 rt hest di s助 ee w as 0 .03 8 betw een E . ~ : an d E . tenela , th e n eare t w 公
0 .02 1 betw een E . ~ an d 石. :ce即吐 na . Th e phylo 乎n etie tre e show ed that E jm ena w as elosed to Isospo 二, an d 3 ,阅 ns of E .
~ w e比 closed to each o th er , an d 50 di d th e 4 str 赴们比 of E . 如 e山 , E . ren e山 was close to E . n eca 姗 , an d th e vari ability w ith E .
ac ery 司幼a , E . 而 姐 d , E . 而 吮 , E . Pra ecox an d E . brun e面 w as obvi o us . T 五es e re sults Prov ed th at th e 185 rR N A ge ne eoul d b e an ide公
D N A m oecldar to id entify di 价re nt sP ec ies an d str七ns of E血n翻 .
K e y wo 由 : C hi ek en C o eeidi a E in Z二 18s rl又N A Seq uence an 习 i, phylo罗n eti e an al ysis
分子生物学技术应用于寄生虫领域之后 ,给寄 生虫分类学带来了不少生机 , 利用 185 :RN A 基因
收稿 日期 :2洲冷一03 一26
基金项目:国家科技荃础条件平台建设作项 目 (2(X) 5D K A 2 1205一4 )
作者简介 :王盘 (l 98 2一) ,女 ,山东聊城人 ,硕士 ,主要从事球虫分子生物学研究 ;E 一ha 卜wan 乎i耐aoh eZ o Z卿 ah o .co m cn
通讯作者 :黄兵 ,E 一m l:huan gh ing232@ 163 co m
306 生物杖术通稚 刀勿. 动肋城盯 2(X 为 年 增 刊
对寄生虫进行分类 鉴定以及其他分子系统学研
究 , 已经成为寄生虫分类学的热点 , 艾美耳亚 目
(Ei m eri na ) 的虫种中也有不少种类被作为研究对
象 , 如火鸡隐抱子虫 (C叩 句那知n山 um m el e处州山s)
川 微小隐抱子虫 (c. p8)即um )12 艾美耳球虫
(凡功e对.)l,一, 牛源环抱子虫 (价closl玖扭 sp.)16]枯
氏住肉抱子虫(, 陀况 公 ~ )和毛状住肉抱子虫
(s. h如uta )l,.s 等 本研究对实验室保存的 3 种 8 株
鸡球虫 185 rRN A 基因进行了克隆 测序与序列分
析 , 以探索该基因作为球虫种/株分类鉴定靶基因
的可能性
1 材料与方法
1.1 试脸虫株
3 种 8 株鸡球虫(表 1) ,包括 1 株堆形艾美耳
球虫 (E . sc ery 川in a) 3 株 巨型艾美耳球虫(E .m ax -
止m日) 4 株柔嫩艾美耳球虫(E . ten e五a) ,均为本实验
室单卵囊分离繁殖
1.2 总 D NA 的提取
收集 8 株纯化的鸡球虫抱子化卵囊 ,使用申能
博采生物科技有限公司的 DN A zso l试剂盒进行总
D N A 提取
1.3 185 rR N A 基因片段的 PC R 扩增
根据真核生物 185 rR N A 基因的通用引物设计
了一对引物 ,由北京赛百盛生物公司合成 引物序
列 如 下 :p120 , 5 一A CCTG G叨限A TC CTGC CAG 一3 ;
pl2 1 , 5 一CTTCCG CA G G明陀A CCTA CGG 一3 PC R 扩
增反应体系中包括 :总 D NA 4 林l, 10xPC R buf fe r s
卜l, 10 nU ollL dNTp 混合物 2 卜l, 50 pm ollL plZo
引物 2 卜l, 50 pmo l/L plZI 引 物 2 卜l, 20 U Ta g
Pl us DN A 聚合酶 (购自上海生工生物工程有限公
司)l 卜l和 ddH刃 34 闪 混匀后轻徽离心 ,于 PC R
仪上进行扩增 反应参数如下 :94 预变性 5 而n;
94 变性 30 , 63 退火 1 m in , 72 延伸 Z m in ,共
进行 35 个循环 ; 最后 72 延伸 10 而n 循环反应
完毕后 ,取 5 闪 反应产物在 1% 的琼脂糖凝胶上电
泳 ,观察结果
1.4 PC R 产物的克隆与鉴定
将 PC R 扩增的 185 rR N A 基因产物经过电泳 ,
使用 Ta Ka R a 公司的 AgaID se Ge l D N A Pu rificat ion
儿t 试剂 盒 回收 PC R 产物 , 与 Pm m ega 公 司的
pG EM 一 T eas y veetor连接 ,转化至 TI A N G EN 公司的
大肠杆菌 TO P1 0 感受态细胞 , 取转化后的菌液进
行体系与参数同上的 PC R 扩增反应 , 琼脂糖凝胶
电泳分析是否为目的条带
1.5 浏序与序列分析
将含有单一 目的片段的 PC R 扩增产物和 2 个
经鉴定正确的阳性克隆菌液 , 送至上海 Inv i加ge n
公司测序 , 所得序列经 BLA STn 比对确认和软件
D N A star 5. 0 整理后登 录 Ge nb ank 用 Cl us taI W 的
方法进行多序列比对 , 通过软件 D NA star 5.0 和
M EG A 4. 0 进行同源性分析 序列碱基组成分析及
系统树构建
2 结果
2 .1 PC R 扩增结果
获得了 8 个虫株的 185 rR N A 基因 代 R 扩增
产物 , 电泳结果如图 1 所示 , 8 个虫株的扩增片段
长度一致 ,均约 1 80 坤
2. 2 PC R 鉴 定结果
8 个虫株 的重组质粒 PC R 扩增结果与以总
DN A 为模板的扩增片段长度一致 ,均约 1 80 bp ,
表明扩增片段成功转人感受态细胞 ,得到的克隆为
阳性克隆 ,将鉴定的阳性克隆送样测序
2. 3 序列的处理与登录
将 PC R 扩增产物测序结果和 2 个经鉴定正确
的阳性克隆菌液的测序结果经 BLA STn 比对确认
该序列为鸡球虫的 185 rR NA 基因片段后 , 登录
Ge nb田正,各条序列信息见表 1
2. 4 多序列比对 序列碱基组成和同源性分析
利用软件 D N A star 5.0一M egA lign 得到两两序
列之间的相似性和趋异性 ,结果见表 2 , 比对参数
见表注 可见 :同种不同株间的同源性大于不同种
间的同源性 , 3 个 E . m ax jm a 株 间同源性在 98 .7 % -
9 .3% 之 间 ,4 个 E . te nella 株间同源性在 9 .7% -
9 .9 % 之 间 , 3 个 不同 的种 间 同源性 为 % .5 % -
98 .1% 8 条序列在 EBI 网站上利用 C lus 磁 W 进行
多序列比对 ,共检测到变异位点 81 个 ,其中简约信
息位点 57 个 分析 8 条序列的碱基组成 ,如表 3 所
示 , A +T 平均含量为 53 .3 % , 略高于 G +C 平均含
量 利用 M EG A 4. 0 计算 8 个株两两之间的遗传距
离 , 参数及结果见表 4 , 3 个种中 E . m ax 俪 与E.
2 X 旧年 增 刊 王鑫等:鸡球虫 185 rR NA 基因序列的测定与分析 307
ten ella 的遗传距离最大 ,为 0.038 ;E.
aeen, ulsn 的遗传距离最小 ,为 0.021
m ax im a 与E.
2 3 4 5 6 7 8 9 10 bP
2 0 0 0
1 0 0 0
50了一J,..五
圈 I P120 ,P12 1 PC R 扩增各虫株的电泳结果
2. 5 以 185 rR N A 基 因进行系统进化分析
在 G enBank 下载得到顶复器门 (A pieom plexa )
中真球虫 目(Eueoeeidiorida)和梨形虫 目(piro plas-
m记a )部分代表虫种的 185 rR NA 序列信息 (表 5 ) ,构建系统进化树
从本实验测序结果中选取 1株 ETDS01 , 与另
外 9 个不同的属在 EBI 网站上利用 Cl us tal W 进行
多序列比对 , 将比对结果输人 M EG A 4.0 软件 ,用
NJ 法构建进化树 ,其中 切 s力m an isp.作为外群 ,如
图 3 所示 ,属于肉足鞭毛亚门(Sarc om astigophora)的
场 劝m an万 a sp.与复顶亚门 (A pieoeom plexa)的其他 8
个属较早的发生了分化 ;B . ben ne ti T. 即ndi i 和 s.
la certae 聚为一支 , ETDS01 和 1. ro bi ni 聚为一支 , B.
dJ ve毕担ns 和 T. ovis 聚为一支 ,说明这几个分支一L 的
种属亲缘关系比较近; 而 C. Pa rv um 和 尸. 加 rsh ei
可能是较早分化出的种属
将本实验中 8 个鸡球虫株的 185 :R N A 序列与
G enBank 中艾美耳属 (E加e万a)另外 5 种球虫的 185
rR NA 序列在 E BI 网站上利用 Cl us tal W 进行多序
列比对 ,将 T. gon di i作为外群用 M EG A 4.0 软件中
N J 法构建进化树如图 4 所示 , EM 4101 E M TY OI 和
E M ES0 1 3 个姊妹株均为 E .m ax im , 聚为一支 ,与
E . 石川ne ti E . 而r殆 E . m iva ri E . p ra eeox 和 E .
ac , uIln a 聚为一大分支 ,其中 E. m it,s 和 E . m iv8 tJ
亲 缘 关 系 最 接 近 ;ETD S() l E BG D() 1 ETA M 和
ETA D 4 个株均为 E . tenela , 与 E . neeatriX 共 同形
成一个分支 , 说明 E . ten e] la 与 E. ne ca trix 的亲缘
关系最近
表 1 本试验虫株与 185 rR N A 甚因序列的 G e nB ank 登录号
序号 虫株 (虫种 ) Ge nB an 号 长度 序号 虫株 (虫种 ) Ge nB an k 号 长度
(bP ) (bP )
1 E A 120 1(E . ae柳 I万n ) E F 175928 1 748 5 El,D S() l (E . ren 翻a ) E U 025 ll3 1 756
2 E M 4 I01 (E . max im a ) E U 025 ll0 1 747 6 E B G IX) l (E . renel la ) E U 025 ll4 ] 754
3 E M E S() l(E . o ax 加a) E U 02 5 lll l 746 7 E TA D (E . enels ) E U 02 5 ll6 1 7 56
4 E M T Y 0 1 (E . ~ a ) E U 025l lZ 1 747 8 E T A M (E . rene月a ) E U 025 lls 1 7 56
序号
表 2 8 株鸡球虫的 185 旧 N A 序列相似性和趋异性
2 3 4 5 6 7 8 虫株
1 9 8 .1 9 7 .7 9 7 .5 9 7 .5 9 7 .3 9 7 .4
2 1 .9 9 9 .1 9 .3 9 7 .0 9 6 .8 9 6 .9
3 2 .3 0 .9 9 8 .7 96 .7 9 6 .6 9 6 .7
4 2 .5 0 .7 1.3 9 6 .7 9 6 .5 9 6 .6
5 2 .6 3 .3 3 .5 3 7 9 .9 9 9 .7
6 2 .6 3 .3 3 .5 3 .8 0 .0 9 .8
7 2 .7 3 .3 3 .5 3 .7 0 .2 0 . 1
8 2 ,6 3 3 3 5 3 8 0.1 0.0 0 .0
9 7 4
96 .9
9 6 .7
E A 12 0 1
E M 4 1 0 1
E M E S 0 1
E M T Y 0 1
E T D 别)1
E B G I刃 l
E T A D
E T A M
6gQ矛%9
注 :下三角为趋异百分 比 , 上三角为相似性百分比
308 健物孩术通橄刀勿扭比彻城盯 B川介血 2 (X 为 年 增 刊
衰 3 8 株鸡球虫的 , 85 rR N A 序列碱鑫组成(% )
C A G TO tal (如)
E A 120 1
E M 4 10 1
E M E S0 1
E M T Y 0 1
E T 理刃 1
E BG 洲)1
ET A M
E T A D
27.7
28.0
27.8
2 7 .8
2 7 .9
27.9
27.9
27.9
20 .1
19 .6
19 .7
19 .7
19 .7
19.7
19.6
19 .6
24 .9
2 5 .4
2 5 .5
2 5 .4
2 5 .5
2 5 .5
25.5
2 5 .6
27 .3
27 .0
26 .9
27 .1
26 .9
26 .9
26 .9
26 .9
1 7 4 8
1 74 7
1 746
1 7 47
1 756
1 754
1 756
1 75 6
A + T
5 2 .6
53 .4
5 3 .3
5 3 .2
53 .4
5 3 .4
5 3 .4
5 3 .5
裹 4 8 株鸡球虫 185 rR N A 序列的造传距离(含标准理
序号 6 7 虫株
045104510. (X 抖
2 0 .02 1
0. 仪抖
0. 创拼
0. (X) 5
0 .阅 5
0. 0 1
O了R凡,月, nU弓Jl一1 0.0
0 .0 3 3
0. (兀岭 0. (X 抖 0. 洲抖
0. (X) 2 0. (X) 2 0. X 阵
0. 0 3 0. 0 5
0.013 0 .加 5
0.035 0 .038
0.0 36 0 .038 0 .的 l
0.036 0 .038 0 (X) l
0.035 0 .03 8 0 .加 2
0 .0 1
0. 0 1 0. 0 1
E A 120 1
E M 4 1 0 1
E M E S() l
E M T Y 0 1
E T D so l
E B G IX) l
E T A M
E T A D
全JO月t呀峙叹,气内n0olU0684735
注:下三角为遗传距离 ,上三角为标准差
一
1坛, JfJ工J.T以叩 地m a
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L . s腼 翻 旧
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. 八12 0 1
E n 巴目橄
今 日G 团 1
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今曰八洲 ]
今曰八 ]
丫 Oa ,山
加 ~ .
,1一
圈 3 M E G A 4 .O一NJ 法对盆顶亚门9 个属的代衰株构建
185 rR N A 序列进化树
圈 4 M EG A 4 .O一N J 法对艾美耳 . 13 个代衰株构建
185 旧N A 序列进化树
2(X 为 年 增 刊 王鑫等 :鸡球虫 185 rRN A 基因序列的测定与分析 3o
裹 5 G enban k 下峨的 18S rR N A 序列伯息
虫种名称
E . 五川爬 t百
E . p用eC 沈
属名 长度(帅)
47902otgR1.O夕丹45企690J巴,7.月了1,矛J吕9门0声.f-,二1l2.八玉凡乙
. 面 石日
n e C日之五笼
E . 而 阳石
I. m 石加万
C . p曰功
5 . Ja ce八ae
B . 加川刀e招
E 龙m en 日
肠油已污日
月功翻 .
月m 朗 日
E 万m 份妇
俪 那沁摺
O )甲盆照即对山帅
肠此翻户山
刀七朋of 血
登录号
U 67 116
U 67 120
U 67 lls
U 6 7 1 19
U 76748
T. gD ndi 灿 oP1 翻m a
P. be 动ei PJ 翻nx 斌um
B . 成此雌脾刀s B 曲. 扭
T. 0油 肠 日J己痴
及湘为公切旧扭 sP . 肠 拍h na月Ia
A 印 8肠 12
A F l l5 3 7 7
A Y 0I5113
A Y 6 539 9
X 6 8 5 2 3
M 19 7 12
A Y 57 24 5 6
A Y 5 3 3 14 4
A F3 03938
3 讨论
rR N A 基因是高度重复的串联序列单位 , 它由
285 185 5.85 以及被 5.85 所分隔的基因内转录间
隔区I仆一1 和 I巧一2 共同组成 rRN A 分子具有功能
上的高度保守性 ,在所有细胞生物中都存在 ,进化
具有良好的时钟性质 ,其序列中不同位置上变化的
速度不同 目前已成为系统分类学研究中最有用和
最常用的研究对象 , 并称为 rR NA 分子钟 (rR NA
m oleeular Cloek ) ,用来测定几乎全部生物间的系统
发育关系 ,并构建进化树l9] 由于 185 rR N A 基因在
生物进化过程中具有高度保守性 ,常用来分析物种
系统进化关系或利用特异性引物 PC R 进行病原检
测等
本研究以 8 种 13 个球虫株的 185 rR N A 序列
构建进化树结果显示 , E . m sx 加a 与 E . 石几刀et ti E.
m Jds E . 而v8 石E . p阳ec ox 和 E . ac erv ul加a 聚为一
大分支 , 其中 E . m万tis 和 E . m 万vs ti 亲缘关系最接
近 ;E. ten 曲 与 E . nec atrix 共同形成一个分支 ,说
明 E . ten el la 与 E . necs 戚 的亲缘关系最近 这一
结论与 Barta 等 13 利用 18 5 rR NA 全序列分析的 8
种鸡球虫的系统发生关系结果一致 , Barta 认 为 E.
nec at力吮和 E . tan e刀a 是姊妹种 , E . In itis 和 E . m ivs ti
是 另 一 对 姊 妹 种 ,E . Pra ec ox E. m sx 加 和 E.
石川m et ti 是亲缘关系较近的另一个类群 , 而这几个
姊妹种又与 E. sc 诫刀a 组成另一支序
在目前普遍公认的分类地位中的贝诺抱子虫
(Bes nof tia ) 住肉抱子虫(sa祀cys tis ) 弓形虫 (To xo -
川邵切:) 艾美耳球虫(凡m eria )与等抱球虫(Is osp}
ra )同属于真球虫目(Euc ec ci di orida ) ,与本研究中利
用 185 rR N A 序列构建的进化树结果一致 ; 而巴贝
斯虫 (刀司比s抽)和泰勒虫(仆eile ria)同属于梨形虫 目
(乃哪 2韶m ida ) ,在本研究中显示二者形成的一个分
支与真球虫目中的 7 个不同属有交叉 ,有待进一步
探讨
本研究虽只用了 3 种鸡球虫 ,但与另外 5 种鸡
球虫共同构建的 18 5 rR NA 序列进化树 , 可明显将
种进行区分 ,且同种不同株间存在遗传差异 ,说明
在鸡球虫系统进化研究中 , 18 5 rRN A 基因不仅可
以区分不同种 ,而且有可能成为区分同种不同株的
理想靶基 因
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