全 文 ：生物杖术通银
技 术 与 方 法 2以为 年 增 刊
生物固定化技术及其应用研究进展
何明 林庆胜 都卫宁 钟国华
(华南农业大学昆虫毒理研究室, 广州51 仪碑2)
摘 典 : 生物固定化技术具有小型高效 德定性好 操作简便 易实现连续化 自动化控制等优.点,在生物 医药 农业 食
品 化工 能源开发 环境保护等方面得到了广泛应用当前生物固定化的材料已由单一的踌发展到含璐菌体或菌体碎片固定
化方法主要包括载体结合法 交联法和包埋法,这些方法近年来都通过发展新型材料和技术得到了长足发展 ,生物固定化技术
在有机污染物净化 土堆重金属污染修复 真菌毒素降解 生物能源开发等方面都取得了重要进展 今后应在开发固定化生物
资源 提高固定化徽生物活性 固定化机理和应用等方面加强研究
关扭询: 生物固定化 方法 应用 进展
Re search A dvances and A PPneati on P ro sPect of B iologl cal
lm m o b il七a ti o n
H e Y ue Lin Q in 乎heng H ao W ein in g Z ho ng G u ohua
(乙的 of 加eet 阮 ic o叭盯肠以 h Ch ina A 交政脚讨价如e匆 , G训吓乎ho u 510642)
Abst ra Ct : Th e techni que of biolog eal imxno bi五Za tion 15 be eonng an im PO rtan t rem edi ati on m etho d an d 诚dely , d in biofo 盯 ,
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K6y w ord S: Bio一unm ob山Za tion M eth od AP plica tion D evefo pm ent
生物固定化技术是指将酶 微生物细胞 动植
物细胞 细胞器等生物催化剂用物理或化学方法限
制或定位在某一特定空间 ,保留其催化活性 ,能被
重复和连续使用的技术手段 生物固定化技术具有
小型高效 稳定性好 反应操作简便 实现连续化
自动化控制等优点 ,可以提高产物的纯度和过程效
率 ,克服游离生物催化剂对环境敏感 性质不稳定
易失活或死亡等缺点 ,同时借助于固定化技术还可
以使化工过程中非均相催化技术的优点在生物工
程中得以充分发挥 , 不仅可以解决贵重的酶回收
再利用 酶污染问题 ,而且提高了酶的稳定性 ,使酶
对环境的适应能力提高 ,对于耐酸 耐碱 耐高温等
耐极端条件酶的开发具有极其重要的意义l,2] 所以
近年来国内外相关研究极受重视 ,并取得了很大的
进展 ,已成为生物技术中非常活跃的跨学科的研究
领域之一 ,其应用领域包括生物学 生物化学 酶工
程 生化工程 有机化学 合成化学 高分子化学 食
品与发醉工业 化学分析 医疗诊断 环境净化 能
收稿 日期 :2(X拍一03 一31
基金项目:国家 自然科学基金(308 71 6以)项 目和广东省科技计划项目 (2(X) 8B0 2仪阅侧X) 7)
作者简介:何用(1984 一),女 ,在读研究生 ,研究方向:农药残留与环境保护
通讯作者:钟国华 ,副教授 ;E一耐 卜gu o卜u山加夕 sc au .ed u. cn
2 义旧 年 增 刊 何明等 :生物固定化技术及其应用研究进展
源生产等多个领域13一,充分显示 了生物固定化技
术的广阔应用前景
l 生物固定化的材料l, ,,9]
用于生物固定的材料 ,起初是采用提取和分离
纯化后的酶 固定化酶能够提高酶的稳定性 ,较游
离酶更适合于多酶反应 对于胞内酶的固定化 ,需
要将细胞破碎后分离酶 , 这一操作一般非常繁琐
因此 ,除部分水解酶外 ,价格都比较昂贵 酶的固定
化方法通常可以采用吸附法 包埋法 围人胶囊法
和共价交联法等l7, 吕,其中围人胶囊法具有较高的
综合性能比,不会影响被包埋的酶的催化活性和存
活力 ,且容易制备和从反应过程中分离回收重复使
用
随着固定化技术的发展 , 目前生物固定化技术
已由原来单一的固定化酶 固定化微生物细胞发展
到固定化动植物细胞[9l 固定化细胞器 固定化原
生质体 固定化微生物分生抱子以及酶与微生物细
胞 好氧微生物和厌氧微生物联合固定等 含酶菌
体或菌体碎片进行固定化 ,称之为固定化菌体或固
定化死细胞 固定化细胞与固定化酶比较 ,其优越
性在于 ,免去了破碎细胞提取酶的手续 ,酶活性损
失小 ,成本低 ;保持了胞内酶系的原始状态与天然
环境 ,因而更稳定 ;保持了胞内原有的多酶系统 ,这
对于多步催化反应等其优势更加明显 ;无需辅酶再
生 当然 ,固定化细胞同样具有一定的局限性 ,如利
用的主要是胞内酶 ,细胞内多种酶的存在会产生副
产物 ,细胞膜 细胞壁的存在增加了扩散限制作用 ,
载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性 ,微
生物生长所需的营养条件难以提供等
2 生物固定化的方法
2.1 载体结合法
载体结合法是生物固定化最常用的方法 , 目前
实践中主要包括 3 种方法 ,即物理吸附法 离子结
合法和共价结合法 物理吸附法是酶或细胞被物理
吸附于载体表面地一种固定化方法 吸附法操作简
单 ,处理条件温和 ,基本不会引起酶活性的损失 ,对
细胞的生长 繁殖和新陈代谢没有明显的影响 ,是
目前应用得较为广泛的一种固定化方法 ,尤其是用
于各种酶传感器的制备 l0, 川但其结合力弱 ,酶和
细胞易脱落 所固定的微生物数目受所用载体的种
类及其表面积的限制圈 此类载体很多 ,无机载体
有多孔玻璃 活性炭 酸性白土 漂白土 高岭土 氧
化铝 硅胶 膨润土 羚基磷灰石 磷酸钙 金属氧化
物等 ;天然高分子载体有淀粉 白蛋白等 ;大孔型合
成树脂 陶瓷 纤维素等13 ]; 以及具有疏水基德载体
(丁基或已基一葡聚糖凝胶 )可以疏水性吸附酶
离子结合法是与具有离子交换集团的载体通
过离子结合的固定化方法 ,操作简单 ,对酶活性损
失较少 , 但结合力较弱 , 容易受缓冲液种类或 pH
的影响 ,在高离子强度下酶易脱落 载体主要有阴
离子交换剂 , 如 D EA E一纤维素 D EA E一葡聚糖凝
胶 A m berlite IRA 一93 IRA 一410 IR A一9 X)等 , 阳离
子交换剂如 C M 一纤维素 A m be riite C G 一50 IRC -
50 IR一120 Dow ex一50 等
共价结合法则利用酶蛋白中含有的反应集团
与载体或载体修饰物上的反应基团形成共价键使
酶固定化的方法 酶分子中可以形成共价键的基团
主要有氨基 狡基 轻基 酚基和咪哩基等 用此方
法固定化微生物结合牢固 ,不容易脱落 ,但操作复
杂 ,处理条件苛刻 ,酶一载体结合作用强 ,造成酶活
性损失较大 载体主要有纤维素 琼脂糖凝胶 葡聚
糖凝胶 甲壳质 氨基酸共聚物 甲基丙烯醇共聚物
和多孔玻璃等
2. 2 交联 法
用双功能或多功能试剂使酶与酶之间交联的
固定化方法 与共价结合一样也是利用共价键固定
酶 ,不同之处在于它不使用载体 交联法反应条件
比较激烈 ,酶分子多个基团被交联 ,酶活的收率一
般较低 ,尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间将
有利于固定化酶比活力的提高 交联法制备的固定
化酶结合牢固 ,但酶活力损失较大 ,故可将交联法
与吸附或包埋法联合使用 这用固定化方法称为双
重固定化法 双重固定化法已在酶和菌体固定化方
面广泛采用 ,可制备出酶活性高 机械强度好的固
定化酶或固定化菌体 如在枣酒酿制中 ,以海藻酸
钙为包埋剂 ,再用明胶与戊二醛交联 ,提高了胶粒
的机械强度 ,使细胞泄漏减少Il] 研究表明 , A G E -
eo一EG D M 聚合体较 G M A 一eo一E G D M 聚合体与脂肪
酶有更高的结合性能和表达 在最佳条件下 , A G E -
巧聚合体活性回收率达 78 .40% , 具有更宽的 pH
性物技术通橄习如姗几即枷盯 刀以翻如 2(X 为 年 增 刊
适合范围 ,更高的温度和极好的储存稳定性阴
2. 3 包埋法
包埋法一般不需要酶蛋白的氮基酸残基进行结
合反应 ,可以应用于许多酶 微生物的固定化 ,凝胶
包埋法 微胶囊法和冷冻干燥法是包埋法中最常用
的 3 种方法
凝胶包埋法将酶或微生物包埋在高分子凝胶
细徽网格中 ,常用的凝胶主要为聚丙烯酞胺凝胶与
海藻酸钙等合成高分子化合物以及淀粉 明胶 胶
原 海藻酸钙 角叉菜胶等天然高分子化合物低
徽胶囊法是围人胶囊法中最典型的一种固定化
方法 ,将其包埋在高分子半透膜中(人工细胞 ) ,其
方法分界面沉淀法 (或称相分离法) 界面聚合法
二级乳化法 脂质体包埋法 多电解质络合法 徽胶
廷法得到的粒子要比凝胶包埋颖粒小的多 ,大小在
徽米或毫米范围, 徽胶囊技术的优势在于形成徽
胶囊时 , 囊心被包扭而与外界环境隔离, 它的性质
能毫无影响地被保留下来, 而在适当条件下, 壁材
被破坏时又能将囊心释放出来16 ,且底物和产物扩
散阻力较小 但徽胶囊醉的催化性质有所改变 ,因
此醉徽囊化后 ,还必须考察它的性质阴 ,如偶联率
及相对活力的测定等 目前 ,徽胶囊技术主要应用
于食品添加剂 醉制剂和徽生物等徽胶囊化中 例
如 ,用 PM C G 制备的 SA /CS一Ca C12 /PM CG 徽胶囊具
有良好的生物相容性 ,用该徽胶囊固定化培养大肠
杆菌或酿酒醉母 ,与相应的游离培养类似18 序艳
华等119采用锐孔法原理 ,以海藻酸钠 吐温 印 抓
化钙 盐酸(分析纯)和 P5 价 作为载体和保护剂制备
的徽胶囊浸泡在蒸馏水中存放 so d ,具有较好的塑
行性和强度 把双歧杆菌徽胶囊化 , 也可使双歧
杆菌的活性和稳定性得到有效保持 从2,
冷冻干燥法是将需要干操的醉溶液或细胞悬浮
液预先冻结成固体 ,然后在真空条件下使水蒸汽直
接从固体中升华出来 ,并用冷凝方法捕凝升华的水
汽 ,致使物质脱水干燥 冷冻干燥的优点 :可避免酶
及细胞因高热而分解变质 , 所得产品质地疏松 ,加
水后迅速溶解恢复药液原有特性 ,含水 t 低 (1% -
3% ) ,同时干操在真空中进行 ,不易氧化 ,有利于产
品长期贮存 真空冷冻干操是保藏醉母菌 细菌 真
菌抱子及霉菌最有效 最成功的方法之一 ,在生物
工程 医疗工业 食品工业等方面得到了广泛应用
干操过程中 ,冷冻和干操两个过程会造成部分徽生
物细胞的损伤 死亡及某些酶蛋白分子的钝化网
对于绝大多数细菌冷冻干操成功(存活率高 活存
期长)的关键在于有效保护剂的使用 ,保护剂可以
改变生物样品冷冻干操时的物理 化学环境 ,减轻
或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害 ,尽可能保持
原有的各种生理生化特性和生物活性陈川保护剂
种类繁多 ,包括多经基化合物 糖 氨基酸 聚合物
蛋白质 盐 胺和表面活性剂等l均,机制复杂 ,近年
来国内外对其研究颇多
上述各种固定化方法的优缺点比较见表 1
3 生物固定化技术的应用
生物固定化技术提高了微生物在工业生产中
的利用价值 ,在环保 医药 精细化学品工业 手性
化合物 食品工业等方面正发挥 日益显著的作用 ,
近年来尤其是在环保和能源开发方面研究应用尤
多同 ,并且取得了突出的效果 ,展示了广阔的应用
前景
3.1 有机污染物净化
工农业生产过程中不免产生大t 的有机污染
物 在工业废水处理技术中 ,采用固定化细胞技术
固定化方法
衰 1 各种生二 定化方法的优映点比较
吸附法 交联法
侧备难易
结合程度
再生
费用
对底物的专一性
钧理吸附
易
弱
可能
低
不变
离子结合
易
中等
可能
低
不变
共价结合
难
强
不可能
高
可变
较难
强
不可能
中等
可变
凝胶包埋
较难
强
不可能
低
不变
包埋法
徽胶囊
难
强
不可能
离
不变
冷冻干操
较难
弱
不可能
中等
不变
2 X为 年 增 刊 何明等 :生物固定化技术及其应用研究进展
有利于提高生物反应器内的微生物细胞浓度和纯
度 ,并保持高效菌种 ,其污泥产生量少 ,利于反应器
的固液分离 ,也利于除氮和除去高浓度有机物或某
些难降解物质浏 膜包埋法固定细胞形成的生物膜
可用于废水的硝化或脱硝 ,无氧过程处理有机污染
物形成的甲烷可以作为再生能源 ,还能用于吸附出
去的溶解重金属 这不仅可以保护生态环境 ,而且
能为能源的节约开辟新的途径 利用包埋法将消化
菌和反硝化菌固定后 ,发现这种混合固定法有利于
废水中氮的去除 , 且去除率高于纯种固定法国
分别用 PV A 和海藻酸钙包埋非活体真菌粉末吸附
A u+ ,结果表明 ,用 PV A 制备的固定化小球表现出
更优越的机械强度和化学稳定性 , 吸附 A u+ 3 .5
h 可达到 80% 的吸附率 ,用海藻酸钙包埋的固定化
微生物小球则需 265 h , 吸附 372 h 后可达到 9 .
8% 的吸附率侧 将漆酶固定在具有环氧功能团的
丙烯酸树脂转化污水中的合成嫩料 ,研究表明连续
的流化床反应器漆酶与搅拌反应器相比 ,能降解更
大流量的污水侧 为了解决酸雨导致湖水酸化的系
列环境问题 , N a玩sh ima 等13 通过吸力填充的方法
将微生物固定于纤维素管中和酸化水 以戊二醛
作为交联剂 ,运用经过化学修饰的聚抓乙烯塑料薄
板以共价结合的形式固定草酸盐氧化酶 ,回收率可
达 65 % I一
农药既带来了巨大的经济效益 ,但同时污染了
环境 食品 ,造成对环境和人畜的不良影响 大量的
研究工作表明 ,徽生物对环境 作物中农药的降解
起到重作用 ,大部分的有机污染物都被微生物不同
程度的降解或转化 ,转化后的产物要可作为微生物
生长的碳 氮 磷源 ,为其生长提供营养侧 为了使
微生物能实际应用于生产实践 ,林淦等 34 ]以海藻
酸钙固定化联苯菊酷降解酶液 , 比较了固定化酶与
游离酶对联苯菊醋的降解作用效果 , 理想条件下 ,
固定化酶的活性相当于游离态酶的 75 % ,使联苯菊
醋降解 72 % ;闻艳春等陈网获得高酶活性的工程
菌 ,固定化后对农药的降解效果较理想 ,固定化细
胞在 lh 内对有机抓和菊醋类农药 的降解率可达
o % ; 虞 云龙等 国 把分离到的广谱性降解菌
Al cali ge ne o sP .Y Fl l 进行了固定化并对固定化后酶
对氛戊菊醋和杀灭菊醋的降解特性进行了研究
利 用 生 物 反 应 器 固 定 细 胞 Sphi ng om on as
chloro phenoliea PC p一1处理五抓苯酚污水 , 降解效
果高达 92% 以上 ,且此生物处理系统能持续至少 2
个月阂
3. 2 土壤重金属污染修复
生物固定化载体 (如甲壳素 多孔陶瓷 活性
炭 海藻酸盐等)本身具备一定的吸附能力l, ,侧,可
将重金属离子吸附在表面 ;扩散传质作用使得重金
属离子浓度从载体外部到内部由高到低 ,形成浓度
梯度 ,减轻了有毒物质对其内微生物的毒性 ,有利
于微生物对有毒物的降解l几生物细胞吸附金属的
机理十分复杂 ,它们对重金属的作用可以分为生物
积累和生物吸附两个不同的生物化学过程圈 采
用包埋法固定曲霉菌体制备成生物吸附剂 ,对水中
的 Cr6 +进行吸附实验 ,发现 5% PV A +l % SA 为最
佳固定载体 ,去除率可达 85巧% l43] 用海藻酸钙包
埋大肠杆菌吸附 H解+和 C6H SH g+获得了满意的效
果 ,去除率均在 90 % 以上 ,且解吸重复利用 3 次后
吸附效率没有明显减弱洲
3. 3 真菌毒素降解
真菌毒素(M yco tox in )是某些丝状真菌在适宜的
沮度和湿度条件下产生的具有生物毒性的次级代
谢产物 ,不仅污染食品引起食物中毒 ,不少真菌毒
素还具有致癌 致畸 致突变作用 ,对人类健康造成
极大威胁 研究表明 ,真菌中存在着可以降解生物
毒素毒性的酶 ,如黄曲霉毒素解毒酶 (A nato xi n一de-
toxicZym e , A D Tz)等 固定化技术可以克服酶离开自
然环境表现不稳定的缺点 如将黄曲霉毒素解毒酶
固定化后 ,解毒活性被保留下来 ,酶的酸碱稳定性
热稳定性 放置稳定性等均得到显著的提高阅 将
溶解酵素酶固定于玻璃质表面 ,处理修复淡水中的
埃希氏大肠杆菌 ,酶形成膜状与玻璃质紧密连接在
一起阅
3. 4 环境监浏
酶反应鉴定主要污染物已经被证实是一种非
常有前景的方法 ,如重金属 ,基于其抑制作用的测
定方法是一种非常精确的毒性鉴定评价刚J 如将南
瓜尿素酶固定于 3.5% 藻酸钙微粒中 , 利用酶抑制
作用能有效的检测水中的汞I侧利用这种策略可以
性物孩术通推忍勿姗加 城盯 召以翻咖 2 X为 年增 刊
开发环境有害物质的实时监测新技术 ,发展前景广
阔
3 .5 生物 能源开发
生物柴油是一种清洁可再生的生物能源 酶法
合成生物柴油技术 ,即用脂肪酶催化动植物油脂与
低碳醉间的转醋化反应 ,生成相应的脂肪酸醋 而
脂肪酶固定化技术是酶法合成生物柴油得以工业
化应用的关键 Noure ddied 刚等研究了固定化酶和
游离酶的催化性能 ,将大豆油同甲醉和乙醇进行醋
化反应 ,分别采用洋葱假单胞菌脂肪酶的游离和固
定化态作为催化剂 ,发现固定化酶较游离酶始终保
持很高活性 ;采用脂肪酶固定化技术 ,能提高酶的
稳定性并使其能重复利用 Shan 倒等报道在无溶剂
系统中 , 利用 3 种脂肪酶 (以 m m obaeteri um vis co -
sum , 山 d d8 川go 朋, 几祀万月e panc~ ) 催化麻风树
油生产生物柴油 ,只有来源于 C .vis co su m 的脂肪酶
得到了一定的产t , 固定化的 C .讨cos um 脂肪酶在
40 下反应 8h 使得生物柴油得率较游离酶的 62%
上升到 71 % 向固定化醉反应体系中加人 0.5% 的
水 ,使得率由 73 % 上升到 92% 可见 ,适宜的固定
化酶以及反应条件提高了生物柴油的得率 ,采用不
同固定化方法的固定化酶在醇解反应中的催化作
用也有明显的差别
4 生物固定化技术的发展趋势
尽管 目前生物固定化技术取得一系列研究成
果 ,但现阶段不少问题仍有待解决 ,概括而言 ,今后
一段时间 ,生物固定化技术有待解决的问题包括如
下几方面 :(l) 注意固定化生物资源的开发 环境污
染物的成分复杂 , 单个微生物难于处理多种污染
物 我国生物资很丰富 ,在酶工程领域 ,要注意充分
开发生物资源 ,例如开发海洋生物 盐湖生物 极地
生物 ,从中发现嗜冷醉 耐热酶 耐盐酶 耐溶剂酶
等在极端环境下能很好地起生物催化作用或具有
特殊功能的新酶种 (2) 采用新技术手段 ,提高固定
化徽生物的活性 目前 ,大多数载体存在成本高 ,使
用寿命受限制等缺陷 ,水解后对微生物存在毒害作
用等l,1 ,如何充分利用天然高分子载体及其改性或
加人添加剂如酶激活剂等 ,研究和开发耐用 廉价
安全的微生物固定化载体或包埋材料及复合 固定
化技术 ,如超临界技术 纳米技术 膜技术等来固定
酶 (3) 固定化微生物在处理污染物的反应过程中
载体对细胞浓度 活性的影响及其传质阻力的研究
还有待深人 ,如何保持高效的传质过程是固定化微
生物技术工程化过程中所需要解决的工艺问题
(4 )在生物化学方面 ,面临的主要问题是如何进行
大规模工业生产 固定化微生物具有独特的理化性
质 , 其稳定性与载体及细胞的电荷相互作用有关 ,
米氏常数与固定化过程中蛋白质侧链的构象改变
有关 ,其最适 pH 最佳使用温度及专一性与酶活力
和生物内部微环境 生物能的改变有关
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