全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLO GY　BULL ETIN 2009年第 9期
猪流感病毒 HA基因的克隆及杆状病毒转移载体的构建
赵朴 1 　郑玉姝 1 　贾贝贝 1 　乔传玲 2 　陈化兰 2 　刘兴友 1 　李海燕 2
(1 河南科技学院动物科学学院 ,新乡 453003; 2 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
兽医生物技术国家重点实验室 农业部动物流感重点开放实验室 ,哈尔滨 150001)
　　摘 　要 : 　猪流感病毒 ( swine influenza virus, SIV)不仅给养猪业造成重大经济损失 ,而且威胁人类健康。血凝素 ( hemag2
glutinin, HA)是 SIV囊膜上的重要免疫原 ,介导病毒吸附和膜融合。针对流感病毒的中和抗体主要以 HA靶标阻断受体结合 ,
本研究通过 RT - PCR扩增了猪流感病毒 A /Swine / Inner Mongolia /547 /01 (H3N2)的 HA基因 ,并将其克隆入 pMD182T载体。
重组 pMD182T经 Kpn I和 Pst I酶切后得到的 HA基因插入 pMelBacA载体的 Kpn I/Pst I位点。PCR和限制性内切酶分析鉴定
表明成功构建了 pMelBacA2HA转移载体。这为开发 HA亚单位疫苗奠定了基础。
关键词 : 　猪流感病毒 　HA基因 　克隆 　转移载体
Clon ing of HA Gene of Swine Influenza Virus and
Construction of Baculovirus Transfer Vector
Zhao Pu　Zheng Yushu　J ia Beibei　Q iao Chuanling　Chen Hualan　L iu Xingyou　L i Haiyan
(1 Departm ent of Anim al Science and Technology, He’nan Institute of Science and Technology, X inx iang 453003;
2 S tate Key laboratory of Veterinary B iotechnology, Anim al Influenza Laboratory of M inistry of Agriculture,
Harbin Veterinary Research Institu te of Chinese Academ y of Agricultural Sciences, Harbin 150001)
　　Abs trac t: 　Swine influenza virus( SIV) can cause enormous econom ic loss to p ig industry and poses threat to human health. The
hemagglutinin (HA) is a major immunogen on the envelope of SIV and can mediate viral attachment and membrane fusion. HA is the
main target of neutralizing antibodies against influenza virus that act p rimarily by blocking recep tor binding. In the study, HA gene of
A / Swine / InnerMongolia / 547 / 01 (H3N2) was amp lified by RT2PCR. The p roduct of RT 2PCR was cloned into pMD182T vector.
HA gene was inserted into the Kpn I/Pst I sites of pMelBacA after the recombinant pMD182T was cleavaged with restriction endonucle2
ase Kpn I and Pst I. Identification by PCR and restriction2endonuclease analysis showed that the recombinant transfer vector pMelBacA2
HA was constructed successfully. It is helpful for development of subunit vaccine based on HA.
Key wo rds: 　Swine influenza virus　HA gene　Cloning　Transfer vector
收稿日期 : 2009206208
作者简介 :赵朴 (19752) ,男 ,河南南阳人 ,硕士 ,讲师 ,主要从事动物病毒学及免疫学研究 ; E2mail: zhpu2008@163. com
通讯作者 :李海燕 , E2mail: haiyanli2002 @yahoo. com. cn　　鉴于猪在流感病毒种间传播的重要作用 ,猪流感病毒 ( swine influenza virus, SIV )不仅引起病猪呼吸困难及其它病毒和细菌继发感染 ,给养猪业造成重大经济损失 ,而且严重威胁人类健康健康 [ 1 ]。最近 , H1N1猪流感病毒引发的流感疫情 [ 2 ]再次证明控制猪流感的重要性。因此 ,开发诊断和预防猪流感的制剂显得尤为迫切。血凝素 ( hemagglutinin,HA )是 SIV最重要的表面糖蛋白 ,它能特异性结合宿主细胞表面的病毒受体唾液酸 2α22, 62半乳糖和 / 或唾液酸 2α22, 32半乳糖 ,介导病毒吸附敏感细胞 ,针对 HA 的抗体具有中和活性 [ 3 ]。本研究从 A /Swine / Inner Mongolia /547 /01分离株克隆了 HA 基因 ,并了构建杆状病毒表达系统的转移载体 ,以期通过杆状病毒表达系统获得大量、高活性 HA蛋白 ,为研制猪流感病毒亚单位疫苗提供抗原物质。1　材料和方法111　毒株和质粒猪流感病毒 A /Swine / Inner Mongolia /547 /01
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
(H3N2) ,简称 SW / IM /547 /01,由中国农业科学院
哈尔滨兽医研究所分离、鉴定并保存 ; pMD182T载
体购自 TaKaRa公司 ;杆状病毒转移载体 pMelBacA
由孟庆文老师馈赠。
112　引物与主要试剂
从 GenBank下载参照序列 ,利用 O ligo6. 0设计
HA基因特异性引物 (上海生工合成 ) :上游引物 : 5′2
CTTTGAGCTACATTCTCTGTCTG23′, 下游引物 5′2
GTATCCAGATT TTAGTTCGACAC23′。根据 Invitro2
gen公司 Bac2N2B lueTM转染试剂盒操作手册合成杆
状病毒转移载体通用引物 : 上游引物 : 5′2AAAT2
GATAACCATCTCGC23′,下游引物 : 5′2GGAAATTCT
CCTTGAAGT23′,由上海生工合成。
Taq DNA聚合酶、Pst I、Kpn I、Sa l I和 EcoR I内
切酶购自 TaKaRa公司 ,小量胶回收试剂盒购自上
海华舜生物工程公司 , RNA提取试剂 Trizol、M 2MLV
反转录酶、T4 DNA连接酶购自 GIBCO公司。
113　病毒 RNA的提取
Trizol法从猪流感病毒 SW / IM /547 /01株感染
的鸡胚液中直接提取病毒 RNA , - 20℃保存备用。
114　反转录 (RT)进行 cDNA的合成
取 RNA悬液 3μl与 20 pmol (1μl)上游引物混
匀后置于 70℃水浴中 5 m in,冰浴 10 m in,再依次加
入 5 ×反转录酶缓冲液 4μl, 0. 1 M DTT 2μl, 2. 5 M
dNTPs 4μl, RNA酶抑制剂 1μl (20 U) ,M 2MLV反转
录酶 1μl ( 10 U ) , DEPC水补足 20μl, 37℃水浴中
作用 1. 5 h。95℃作用 5 m in灭活反转录酶 ,直接用
于 PCR或 4℃保存备用。
115　HA基因的 PCR扩增
10 ×Taq DNA 聚合酶缓冲液 5 μl、cDNA 2. 5
μl, 2. 5 mmol dNTPs 2μl, 20 pmol上、下游引物 ( 20
pmol)各 0. 5μl, Taq DNA聚合酶 0. 5μl后 ,灭菌去
离子水补足 50μl,在 PTC2100基因扩增仪上扩增。
反应条件是 95℃5 m in, 94℃1 m in, 60℃1 m in, 72℃
1. 5 m in, 35个循环 ,最后 72℃延伸 10 m in。取 5μl
PCR产物在 1%琼脂糖凝胶上电泳检查扩增结果 ,
余下的 4℃保存。
116　HA基因的克隆与鉴定
PCR产物电泳、回收后与 pMD182T载体连接 : 4
μl回收的 PCR产物、5μl连接液和 1μl pMD182T
载体 , 16℃水浴 90 m in或过夜 ;转化感受态细胞
JM109,涂布含 Amp、X2Gal和 IPTG的 LB平板 , 37℃
培养 14～16 h,挑取单个白色菌落 ,培养后小量碱裂
解法制备质粒 DNA [ 4 ] ,分别进行 PCR和酶切鉴定 ,
阳性重组质粒命名为 pMD182T2HA。
117　序列测序及分析
经鉴定为阳性的质粒送大连宝生物工程公司测
序 ,结果经 BLAST( http: / /www. ncbi. nlm. nih. gov/ )
进行确证 ,然后用 DNAStar进行分析。
118　重组转移载体的构建和鉴定
小量碱裂解法制备质粒 pMD182T2HA和 pMel2
BacA分别用 Kpn I和 Pst I酶切、电泳、胶回收后进
行连接 : HA基因 3μl, pMelBacA 1μl, 5 ×T4 DNA连
接酶缓冲液 2μl, T4 DNA连接酶 1μl,灭菌的去离子
水补足 10μl, 16℃过夜 ;转化感受态细胞 JM109,涂
布含 Amp、X2Gal和 IPTG的 LB平板 , 37℃培养 14～
16 h,挑取单个白色菌落培养 ,小量碱裂解法制备质
粒 DNA ,分别进行 PCR: 94℃2 m in, 94℃1 m in, 45℃
2 m in, 72℃3 m in, 72℃7 m in,进行 30个循环。和酶
切鉴定 ,阳性重组质粒命名为 pMelBacA2HA。
2　结果
211　HA基因的 PCR扩增
根据已发表的 SIV H3N2 HA 基因的 cDNA 序
列 ,用 O ligo6. 0设计的一对引物通过 RT2PCR扩增
得到 HA基因 ,电泳可见分子量大小约 1 770 bp的
片段 ,与预计结果相符 (图 1)。
1.λ2EocT 14ⅠDNA marker; 2, 3. pMD182T2HA PCR产物
图 1　重组质粒的 PCR鉴定
212　HA基因的克隆与鉴定
重组质粒分别进行 PCR 和酶切鉴定 , 以
pMD182T2HA为模板扩增出约 1 770 bp片段 ; EcoR I
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2009年第 9期 赵朴等 :猪流感病毒 HA基因的克隆及杆状病毒转移载体的构建
酶切 pMD182T2HA产物大小约为 462 bp, S a l I酶切
pMD182T2HA产物大小约为 1 732 bp,目的片段大小
与预期结果完全一致 ,表明 HA 基因已成功克隆入
pMD182T载体 (图 2)。
1. EcoR I酶切 pMD182T2HA; 2. Sal I酶切 pMD182T2HA;
3. DNA Size Marker Ⅲ
图 2　重组质粒的酶切鉴定
213　HA基因的序列分析
测序结果在 NCB I( http: / /www. ncbi. nlm. nih.
gov/ )网站 BLAST数据库中分析表明 ,与国内外多
个毒株 HA基因具有较高的核苷酸同源率 ,所扩增
的 HA基因包含完整的 ORF, ORF全长为 1 701 bp,
编码 567个氨基酸 ,并且可用限制性内切酶 Kpn I
和 Pst I切下完整 ORF。
214　重组转移载体的构建及鉴定
用 pMelBacA载体通用引物 ,分别以空转移载
体 pMelBacA 和可疑阳性转移载体做模板 , PCR扩
增出约 230 bp和 1 968 bp的片段 (图 3)。可疑重组
1.λ2EocT 14ⅠDNA marker; 2, 3, 4. pMelBacAPC产物 ;
5. pMelBacA2HA PCR产物
图 3　转移载体的 PCR鉴定
转移载体用 Kpn I和 Pst I酶切 ,得到约 1 738 bp的
片段 (图 4) ,目的片段均与预计结果相符 ,表明成功
构建杆状病毒表达系统的转移载体 pMelBac A2HA。
1.λ2EocT 14ⅠDNA marker; 2. pMelBacA2HA; 3. Kpn I和 Pst I酶切
pMelBacA2HA; 4. DNA Size Marker Ⅲ
图 4　转移载体的酶切鉴定
3　讨论
猪呼吸道上皮细胞表面同时存在人流感病毒受
体 SA2α22, 6Gal和禽流感病毒 ( avian influenza virus,
A IV )受体 SA2α22, 3Gal,这样猪既可感染人流感病
毒又可感染 A IV,从而成为人 2禽流感病毒重组的理
想“混合器 ”[ 5 ]。最近 , H1N1猪流感病毒引发的流
感疫情再次证明了控制猪群中流感病毒的迫切性和
必要性。而研制预防猪流感的制剂是控制猪群中流
感病毒的前提。
本试验首先通过 RT2PCR 扩增出 H3N2 亚型
SIV HA基因 ,通过克隆和亚克隆将其插入 pMelBa2
cA ,成功构建了杆状病毒表达系统的转移载体
pMelBacA2HA ,这为 HA基因进一步在杆状病毒表达
系统中的表达奠定了基础。本试验克隆的 HA 基
因 ,在 B last中进行同源性比较发现 ,与国内外多个
毒株 HA基因具有较高的核苷酸同源率 ,表明用于
开发亚单位疫苗有较好的代表性和较大的实用价
值。本试验中选用的杆状病毒表达系统 ,能对表达
产物进行行糖基化、磷酸化等一系列蛋白质翻译加
工修饰 ,表达产量高 ,而且昆虫细胞与脊椎动物亲缘
关系远 ,抗原交叉反应低 ,这也为下一步制备大量高
活性亚单位疫苗抗原提供了前提。
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参 考 文 献
1　赵朴 ,郑玉姝 ,李海燕. 中国兽医杂志 , 2008, 44 (9) : 54～56.
2　 Naffakh N, van derW erf S. M icrobes Infect, 2009, 11 ( 8～9) : 725
～8.
3　 Kash JC, Basler CF, García2Sastre A, et al. J V irol, 2004, 78 (17) : 9499～95114　萨姆布鲁克 J, 弗里奇 EF, 曼尼阿蒂斯 T,金冬雁 ,黎孟枫 ,等译 , 分子克隆实验指南 [M ] (第 2 版 ) . 北京 :科学出版社 ,1996, 19～22.5　 Ito T, Couceiro J, Kelm S, et al. J V irol, 1998, 72: 7367～7373.
中国科技核心期刊、全国优秀农业期刊
《植物遗传资源学报 》征订启事
　　《植物遗传资源学报 》是中国农业科学院作物科学研究所和中国农学会主办的学术期刊 ,
为全国中文核心期刊、中国科技核心期刊、全国优秀农业期刊。该刊为中国科技论文统计源期
刊、中国科学引文数据库来源期刊 (核心期刊 )、中国核心期刊 (遴选 )数据库收录期刊、中国学
术期刊综合评价数据库统计源期刊 ,又被《中国生物学文摘 》和中国生物学文献数据库、中文
科技期刊数据库收录。据中国期刊引证研究报告统计 , 2007年度《植物遗传资源学报 》影响因
子达 0. 914。
报道内容为大田、园艺作物 ,观赏、药用植物 ,林用植物、草类植物及其一切经济植物的有
关植物遗传资源基础理论研究、应用研究方面的研究成果、创新性学术论文和高水平综述或评
论。诸如 ,种质资源的考察、收集、保存、评价、利用、创新 ,信息学、管理学等 ;起源、演化、分类
等系统学 ;基因发掘、鉴定、克隆、基因文库建立、遗传多样性研究。
双月刊 ,大 16开本 , 128页。定价 20元 ,全年 120元。各地邮局发行 ,邮发代号 : 82 - 643。
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001
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