全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
猪流感病毒 H1N1血凝素基因和神经氨酸
酶基因在大肠杆菌中的表达
张烨 1 于在江1 唐启慧2 陈禹保 3 辛丽 1 陈永坤 1 陈清轩 2 舒跃龙 1
( 1中国疾病预防控制中心病毒病所国家流感中心,北京 100052; 2北京标凯科技有限公司,
北京 100094; 3北京中亚国瑞生物经济研究所,北京 102206)
摘 要: 克隆、表达和鉴定猪流感病毒 H 1N1 HA, NA基因序列, 为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。在成功克隆猪
流感病毒 H 1N1全长 HA、NA基因并测序的基础上, 将部分基因序列克隆到表达载体 pET32a( + )上,全基因序列克隆到表达
载体 pGEX4T1上, 构建了重组表达质粒 pET32a( + ) /HA (截短 ), pET32a( + ) /NA (截短 ), pGEX4T1 /NA, 转化大肠杆菌
BL21 /Rosetta, IPTG诱导表达, 利用 N i2+亲和层析柱和 GST rap 4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化, 并用 W estern B lo tting和
ELISA方法检测其抗原性。结果显示, 重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达, SDSPAGE显示其相对分子质量与预计大小一
致。 ELISA和W estern b lotting试验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。本研究成功克隆和表达了猪流感病毒 H 1N1HA、NA基
因序列, 为猪流感病毒 H1N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。
关键词: 猪流感病毒 H1N1 血凝素 神经氨酸酶 克隆表达
Expression of theHemagglutinin and Neuram idinase Gene
of Influenza A virusH1N1 inE coli
ZhangYe
1 Yu Zaijiang1 TangQ ihui2 Chen Yubao3 Xin L i1 Chen Yongkun1 Chen Q ingxuan2 Shu Yuelong1
(
1
Chinese N ational Influenza Center, N ational Institute for V iralD isease Control and Prevention, B eijing 100052;
2
Beijing Biokit Inc., B eijing 100094;
3
SinoGreen Institute for B ioeconomy, Beijing 102206)
Abstrac:t It was to c lone, express and cha racte rize theHA and NA Prote in of Sw ine in fluenza v irus H 1N1On the bas is of suc
cessfu l cloning the fu ll leng th HA and NA gene, part of the gene in to pET32a( + ) w ere ligated, and full o f the gene into pGEX4T1An
expression vector pET32a( + ) /HA ( cu t), pET32a( + ) /NA ( cut) , pGEX4T1 /NA w ere constructed and expressed in E. coli BL21 /
rosetta induced by IPTGRecomb inant prote in w as pur ified through affin ity chrom atography co lumnW estern B lo tting and EL ISA w ere
used to dete rm ine the antigenic o f the recomb inan t pro te inResults show ed tha t the recomb inant caps id gene can be ove r expressed inE
coli SDSPAGE show ed that the gene cou ld express product as sam e as expectedELISA andW este rn b lo tting show ed that the recom
b inant prote in per fo rm ed sa tisfactory antigenicThere fore, the HA and NA prote in o f sw ine in fluenza v irus H1N1 has been successfu l
cloned and expressed, wh ich could be useful fo r developing diagnose reagents or vacc ine o fH 1N1
Key words: Sw ine influenza v irus H 1N1 H em agg lu tinin Neuram idinase C lone and express
收稿日期: 20091127
基金项目:国家科技部项目 ( 2006BAD06A15)
作者简介:张烨,女,研究方向:流感病毒与分子克隆; Em a i:l n lxd rong@ 126 com
通讯作者:舒跃龙,研究员; Em ai:l yshu@ vip sina com
猪流感 ( sw ine in fluenza, SI)是由正黏病毒科、A
型流感病毒引起的猪的一种急性、热性和高度接触
性呼吸道传染病,是猪的免疫抑制性传染病之一,临
床上以突发高热、咳嗽、呼吸困难、精神沉郁、发病率
高、病死率不高, 迅速康复或死亡为特征 [ 1]。H 1N1
亚型引起的猪流感已有近百年历史, 1918年美国首
次报道,由于猪群表现的症状与当时人群中流行的
流感症状相似, 所以倍受人们关注 [ 2, 3]。 1930年,
Shope
[ 6]从猪体中首次分离到 H1N1亚型猪流感病
毒, 即 A /Sw ine / Iow a /30(H1N1) [ 4, 5]。H1N1型猪流
2010年第 2期 张烨等:猪流感病毒 H1N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达
感病毒呈地方性流行,世界性分布,可感染各年龄和
各品种猪,发病率高达 100%。
2009年 4月在墨西哥、美国暴发的甲型 H 1N1
流感, 其病毒是一种与猪流感病毒高度同源的新型
变异毒株,它包含禽流感、猪流感和人流感 3种流感
病毒的基因片段,同时拥有亚洲猪流感病毒和非洲
猪流感病毒的特征,是一种 杂交型 !流感病毒。与
传统的猪流感病毒不同, 该病毒能在人和人之间快
速传播。到目前为止,全球 40多个国家均发现有甲
型 H1N1流感病毒感染的存在 [ 7, 8]。因此,有关猪流
感病毒 H1N1生物学特性, 致病机理,诊断和预防的
研究日益受到卫生防疫人员的重视。
血凝素 ( hemagglulinin, HA )蛋白是病毒表面的
主要糖蛋白之一,属于主要的保护性抗原,它不仅可
以诱导特异性中和抗体产生,而且还可以刺激机体
产生细胞毒性淋巴细胞 ( CTL )反应。另外, HA在
病毒吸附、穿膜以及决定病毒的宿主特异性和致病
力方面均起着关键作用 [ 9]。NA基因编码的神经氨
酸酶 ( neuram id inase, NA )蛋白是体液免疫的靶抗
原,可诱导机体产生特异性抗体,抗体具有免疫保护
作用 [ 10]。
本研究利用大肠杆菌表达系统成功表达了
H1N1病毒 HA, NA蛋白, 并对重组蛋白抗原性进行
了初步评价,为血清流行病学调查及诊断试剂的开
发打下了良好的基础。
1 材料和方法
11 材料
猪流感病毒 H1N1由中国疾病预防控制中心病
毒病所国家流感中心分离培养、大肠杆菌 E coli
DH5、E coli BL21、Eco li Rosetta、DNA marker为北
京标凯科技有限公司产品; pET32a( + )和 pGEX4T
1载体为 Novagen公司产品、pMD20T载体、蛋白
marker为 TaK aRa公司产品; 限制性内切酶、T4DNA
连接酶为 NEB公司产品; DNA Ploym erase、Reverse
Transcr iptase为 TaKaR a公司产品; DNA凝胶回收试
剂盒、质粒 DNA小量抽提试剂盒、RNA抽提试剂盒
为北京标凯科技有限公司产品; N iNTAgrose为 Q ia
gen公司产品; GSTrap 4B亲和层析柱为 GE公司产
品;其他试剂为分析纯产品。
12 方法
121 猪流感病毒 H 1N1全基因组提取以及 HA、
NA基因的克隆 病毒基因组的提取按病毒 RNA提
取试剂盒说明书进行操作。根据 G enB ank中猪流
感病毒 H 1N1基因序列, 设计出针对 H1N1 HA和
NA大片段的引物。以提取的病毒 RNA为模板, 在
逆转录酶的作用下逆转录 HA和 NA基因。操作步
骤为:模板与引物 70∀ 保温 10 m in后迅速在冰上
急冷 3 m in, 瞬离再加入已混合好的 buffer、dNTT
M ix tu re、RN ase Inhibitor、Reverse T ranscriptase、
RN ase freeH2O, 42∀ 保温 1 h。再设计引物,以逆
转录出的 1 stS tand为模板 PCR扩增 DNA。反应
条件: 95∀ 预变性 5 m in, 93∀ 变性 30 s, 55∀ 退火
30 s, 72∀ 延伸 2m in, 30个循环, 72∀ 延伸 10m in。
PCR结束后, 经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性的片
段用 1%琼脂糖凝胶电泳分离, 用胶回收试剂盒
回收纯化后克隆至 pMD20T载体, 转化大肠杆菌
感受态细胞 DH5, PCR鉴定, 阳性质粒送北京标
凯科技有限公司进行序列测定。引物序列: H1
up: 5#GACACAATATGTATCGGCT3#; H1down: 5#
TTAGATGCATATTCTACACT3#; N 1up: 5#GGAAGT
CAAAACCACACT3#; N 1down: 5#CTACTTGTCAAT
GGTGAACGGC3#。
122 重组表达质粒 pET32a ( + ) /HA (截短 ),
pET32a( + ) /NA (截短 )的构建 根据 HA NA蛋白
基因阳性重组质粒的测序结果, 设计引物: pETH1
up: 5#GAGAGGATCCGACACAATATGTATCGGCT3#;
pETH1down: 5#GAGACTCGAGCACTCCATCAATTT
TCT3#。
以猪流感病毒 H1N1蛋白基因阳性重组质粒
( pMD20THA /NA )为模板进行 PCR, 反应条件为
95∀ 预变性 5m in, 93∀ 变性 30 s, 55∀ 退火 30 s, 72∀
延伸 2m in, 30个循环, 72∀ 延伸 10m in。PCR扩增出
尾部截短 150 bp两端带有酶切位点和保护碱基的
HA和 NA基因序列。经 1%琼脂糖凝胶电泳分离,胶
回收纯化后双酶切, 与用同两种酶双酶切的 pET32a
( + )载体连接、转化大肠杆菌感受态细胞 DH5、挑
单克隆扩大培养, PCR鉴定出阳性克隆。重组质粒
pET32a( + ) /HA (截短 ) , pET32a ( + ) /NA (截短 )
PCR阳性克隆送北京标凯科技有限公司测序。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
123 重组表达质粒 pGEX4T1 /NA的构建 根
据 NA蛋白基因阳性重组质粒的测序结果,设计引
物: GXTN1up: 5#GAGAGA ATTC GGAAGTCAAA
ACCACACT3#; GXTN1down: 5#GAGACTCGAGC
TACTTGTCAATGGTGAACGGC3#。
以猪流感病毒 H 1N1蛋白基因阳性重组质粒
( pMD20TNA )为模板进行 PCR,反应条件为 95∀
预变性 5 m in, 93∀ 变性 30s, 55∀ 退火 30 s, 72∀
延伸 2m in, 30个循环, 72∀ 延伸 10 m in。 PCR扩
增出全长 NA基因序列。经 1%琼脂糖凝胶电泳
分离,胶回收纯化后双酶切, 与用同两种酶双酶切
的 pGEX4T1载体连接、转化大肠杆菌感受态细胞
DH5、挑单克隆扩大培养, PCR鉴定出阳性克隆。
重组质粒 pGEX4T1 /NA PCR阳性克隆送北京标
凯科技有限公司测序。
124 HA、NA蛋白抗原片段的表达 阳性 pET32a
( + ) /HA(截短 ) , pET32a( + ) /NA (截短 )质粒转化
Ecoli BL21 Star,阳性 pGEX4T1 /NA质粒转化 Ecoli
Rosetta,挑单克隆,接种入 5 mL含相应抗生素的 LB
培养基中, 37∀ /250 r /m in振摇过夜。次日将 5 mL
培养液转接入 500mL含相应抗生素的 LB培养基中,
37∀ 振荡培养至吸光度 A 600 = 06时,加入 IPTG至终
浓度 1 mmo l/ ,l诱导 3 h,离心收集菌体,并用 PBS洗
1次, - 40∀ 冻融两次,用 1 /10体积的 PBST ( PBS,
05% T ritonX100, pH74)悬浮菌体,加 PM SF至终浓
度为 1 mmo l/L, 180H z超声破碎细菌, 4∀ 、12 000 r/
m in离心 30m in,分别收集沉淀和上清, SDSPAGE显
示蛋白位于沉淀中 (也即包涵体表达 )。
125 表达产物的纯化 pET32a ( + ) /HA (截
短 )、pET32a( + ) /NA (截短 )重组质粒表达产物的
纯化时用 N iNTA agarose按 QAGEN手册方法纯化
包涵体, PBS透析复性。 pGEX4T1 /NA重组质粒表
达产物的纯化时,超声破碎后的沉淀溶于尿素中,用
PBS梯度稀释使其复性, 上 GSTrap 4B亲和层析柱,
按 GE手册方法纯化蛋白。
126 纯化产物免疫学活性的鉴定 以梯度稀释
的表达重组蛋白抗原铺板, 梯度稀释的兔抗禽流感
病毒 H5N1血清作为一抗, HRP标记的羊抗兔 IgG
为二抗,进行 ELISA检测, 并设空白对照和免疫前
小鼠血清为阴性对照,待测样本 OD值大于阴性对照
OD值 2倍以上为阳性。以重组蛋白为抗原, 兔抗
禽流感病毒 H 5N1血清作为一抗, HRP标记的羊抗
兔 IgG为二抗,进行Western b lo tt ing印迹检测,并设
未诱导的 BL21 /Rosetta为阴性对照。
2 结果
21 H1N1病毒全基因组提取以及 HA、NA基因的
克隆
病毒 RNA模板经逆转录及 PCR扩增后, 琼脂
糖电泳显示得到一条 1 700 bp和一条 1 400 bp左右
的条带 (图 1) ,此条带与 T载体连接转化后得到多
个阳性克隆, 测序结果分析, 此两条基因序列是
H 1N1病毒的血凝素和神经氨酸酶基因。
M. DNA M aker; 1. HA基因 PCR产物; 2. NA基因 PCR产物
图 1 HA、NA基因的 PCR扩增结果
22 HA、NA蛋白抗原片段表达质粒的构建
PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分离, 胶回收
纯化后,上下游酶切位点双酶切, 同时也用同样的酶
处理 pET32a( + )载体和 pGEX4T1载体, 连接, 转
化大肠杆菌 Ecoli DH5,小量抽提质粒后进行双酶
切和 PCR鉴定,电泳都显示出正确大小的条带 (图
2,图 3) ,测序结果也正确, 表明目的基因已经成功
亚克隆到 pET32a ( + )载体和 pGEX4T1载体载
体上。
23 HA、NA蛋白抗原片段的表达
质粒转化表达菌 Ecol i BL21/Rosetta,经 1 mmo l/
L IPTG诱导 3 h后, SDSPAGE, 可见特异性表达带,
分子量与预期大小相同。可溶性分析显示此蛋白为
包涵体形式表达。
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2010年第 2期 张烨等:猪流感病毒 H1N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达
1. pET32a( + ) ; 2. pET32a( + ) BamH I单酶切; 3. pET32a
( + ) /HA (截短 ) ; 4. pET32 a( + ) /HA (截短 ) BamH I单酶
切; 5. pET32a( + ) /HA (截短 ) BamH I /Xho I双酶切; 6. HA
(截短 )片段 PCR 产物; 7. pET32a ( + ) /NA (截短 ) ;
8. pET32a( + ) /NA (截短 ) EcoR I单酶切; 9. pET32 a( + ) /
NA (截短 ) E coR I/X ho I双酶切, 10. NA(截短 )片段 PCR产
物, MDNA M aker
图 2 重组表达质粒 pET32a( + ) /HA(截短 )、
pET32a( + ) /NA(截短 )的酶切及 PCR鉴定
1. pGEX4T1; 2. pGEX4T1 Sa l I酶切; 3. pGEX4T1 /NA; 4.
pGEX4T1 /NA Sa l I酶切; 5. pGEX4T1 /NA Sa l I/X ho I双
酶切; 6. NA片段 PCR产物; M. DNA M aker
图 3 重组表达质粒 pGEX4T1 /NA的
酶切及 PCR鉴定
24 表达产物的纯化
241 pET32a ( + ) /HA (截短 )、pET32a ( + ) /NA
(截短 )重组质粒表达产物的纯化 用 N iNTA agar
ose亲和层析柱纯化包涵体,在 8mol /L尿素 ( pH45)
洗脱时 Bradford试剂有强烈的颜色变化, 经 SDS
PAGE检测,表明目的蛋白得到纯化,其中表达蛋白
纯度占总蛋白的 90%以上,浓度为约 3mg /mL(图 4,
图 5)。纯化后的蛋白经 PBS透析复性后保存。
M蛋白质 M ark er; 1.未经 IPTG诱导的 BL21; 2. IPTG诱导
后的 BL21; 3.超声破菌后上清; 4. IPTG诱导后的不可溶蛋
白; 5.纯化后的蛋白
图 4 HA重组蛋白的表达和纯化
M.蛋白质 M arker; 1.未经 IPTG诱导的 BL21; 2. IPTG诱导
后的 BL21; 3.超声破菌后上清; 4. IPTG诱导后的不可溶蛋
白; 5.纯化后的蛋白
图 5 NA重组蛋白的表达和纯化
2. 4. 2 pGEX4T1 /NA重组质粒表达产物的纯化
超声破碎后的沉淀溶于尿素中, 用 PBS梯度稀释使
其复性, 上 GST rap 4B亲和层析柱,在 10mM还原型
谷胱甘肽洗脱时 Bradford试剂有强烈的颜色变化。
经 SDSPAGE检测结果表明 (图 6), 目的蛋白得到
纯化,其中表达蛋白纯度占总蛋白的 90%以上, 浓
度为约 3mg /mL。
25 纯化产物免疫学活性的鉴定
ELISA检测结果显示, 重组蛋白与兔抗禽流感
病毒 H5N1血清有阳性反应 (数值略 ) ,提示表达的
重组蛋白与病毒自身蛋白有相似的免疫原性。
W estern B lo tting结果显示重组蛋白与兔抗禽流感病
毒 H 5N1血清反应有特异性条带产生, 分子量大小
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
与预计一致 (图 7,图 8)。
M蛋白质 M arker; 1.未经 IPTG诱导的 Rosetta; 2. IPTG诱
导后的 Roset ta; 3.超声破菌后上清; 4. IPTG诱导后的不可
溶蛋白; 5.纯化后的蛋白
图 6 NA重组蛋白的表达和纯化
CK阴性对照 BL21; M预染蛋白 M arker; H 1HA重组蛋
白; N1NA重组蛋白
图 7 重组蛋白与兔抗禽流感病毒 H5N1血清的
western blotting分析 (截短 )
CK阴性对照 BL21; M预染蛋白 M arker; N1NA重组蛋白
图 8 重组蛋白与兔抗禽流感病毒 H5N1血清的
western blotting分析 (全长 )
3 讨论
猪流感病毒 ( sw ine influenza v irus, SIV )属于单
股负链 RNA病毒,基因组大约为 136 kb,由大小不
等的 8个基因片段组成。编码 PB2、PB1、PB3聚合
酶、血凝素 (HA)、神经氨酸酶 ( NA )、核蛋白 ( NP)、
基质蛋白 M1和离子通道蛋白 M2、非结构蛋白
NS1、NS2共 10种不同的基因产物 [ 11, 12]。其中血凝
素 ( hemagglutinin, HA )基因属于主要的保护性抗
原, 它不仅可以诱导特异性中和抗体产生,而且还可
以刺激机体产生细胞毒性淋巴细胞 ( CTL)反应。另
外, HA在病毒吸附、穿膜以及决定病毒的宿主特异
性和致病力方面均起着关键作用。因此, HA 基因
的变异程度将直接影响对该病毒的防治 [ 13, 14]。NA
基因编码的神经氨酸酶 ( neuram idinase, NA )蛋白也
是 A IV的主要表面抗原之一, 具有水解唾液酸的活
性, 当成熟的流感病毒经出芽的方式脱离宿主细胞
之后,病毒表面的血凝素会经由唾液酸与宿主细胞
膜保持联系,需要由神经氨酸酶将唾液酸水解,切断
病毒与宿主细胞的最后联系。有利于子代病毒粒子
的成熟和释放。NA的另一种作用是穿透呼吸道表
面的黏膜,促进病毒在机体内的传播,与病毒的宿主
嗜性及毒力有关。NA是体液免疫的靶抗原, 可诱
导机体产生特异性抗体,抗体具有免疫保护作用,可
抑制酶活性,抑制病毒从感染细胞释放,从而减少病
毒的增殖 [ 15- 17 ]。
猪可以同时感染不同种、不同亚型的流感病毒。
可见,猪在流感病毒大流行株的产生中起着重要作
用, 它是人与禽流感病毒间发生基因重排的重要场
所, 是人流感病毒和禽流感病毒的 搅拌器 ! [ 18]。
此次甲型 H1N1流感疫情自 4月份爆发以来, 全球
40多个国家和地区报告甲型 H1N1流感确诊病例
8 000多例, 尚有继续流行扩散的趋势。HA蛋白、
NA蛋白是甲型 H1N1流感病毒的主要结构成分, 具
有型别特异性,并能决定宿主范围,在流感病毒的诊
断和疫苗研制中具有重要作用。
H1N1流感病毒的流行范围遍及全球且目前尚
无有效地预防措施,因此, H1N1病毒基因工程疫苗
和快速诊断试剂的研制有着广阔的前景。在临床进
行 H 1N1病毒感染的快速诊断时常需要获得特异性
强的高效价病毒抗体。而传统的纯化病毒方法制备
病毒抗体费时、费力,且往往难以得到特异性较高的
抗体。
本研究应用原核表达系统具有成本低,操作简
166
2010年第 2期 张烨等:猪流感病毒 H1N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达
单,生产周期短, 适于大规模生产, 并且表达的蛋白
易于纯化等优点 [ 16]。利用基因工程手段将 HA, NA
基因的信号肽缺失掉, 采用两种原核表达载体:
pET32a( + )载体和 pGEX4T1载体表达缺失信号
肽的 HA和 NA基因。结果表明,不同表达系统中
蛋白表达水平相差大, pET32a( + ) /B l21中没有得
到表, pGEX4T1 /Rosetta中获得较高表达,说明所选
择的载体系统会影响蛋白基因的表达。 pET32a
( + ) /B l21体系不表达, 推测可能是因为其尾部序
列与头部序列会形成复杂的二级结构, 阻碍蛋白翻
译的起始, 故决定分别切去头部和尾部约 150 bp序
列试表达,因此基因为结构蛋白,一般 7个氨基酸即
可形成一个抗原决定簇, 故切去头部或尾部小段片
段不会影响免疫活性,结果截短头部还是未表达,截
短尾部获得了高效表达, 说明主要还是尾部序列影
响表达。采用 pGEX4T1载体表达缺失信号肽的
HA和 NA基因, 结果 HA未表达, NA获得了高效
表达。
免疫学鉴定确定所有表达成功的蛋白都具有较
好的免疫反应性,后续的试验将利用此重组蛋白进
行单克隆抗体和免疫学快速检测试剂的研制, 本工
作为研制开发相关的诊断试剂和基因工程疫苗打下
了基础。
参 考 文 献
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