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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(3):121-126
1，3-丙二醇（1，3-propanediol，简称 1，3-PD）是
一种重要的化工原料，被广泛应用于印染、涂料、
油墨、药物、抗冻剂、润滑剂等领域［1］，尤其作为
单体合成新型聚酯材料 PTT（聚对苯二甲酸丙二醇
酯）受到人们广泛关注。1，3-PD 的生产方法主要有
化学合成法和微生物发酵法，近年来条件温和、原
材料来源广泛以及环境污染小的微生物发酵法生产
1，3-PD 成为国内外研究的热点［2］，肺炎克雷伯氏菌
（Klebsiella pneumonia）是一种典型的微生物发酵产
1，3-PD 的菌种［3］，以甘油为代谢底物，K. pneumonia
收稿日期 ：2014-08-16
基金项目 ：济南青年科技明星计划（20090118）
作者简介 ：陈利飞，男，硕士研究生，研究方向 ：基因工程，微生物酶技术 ；E-mail ：chenlifei8810@126.com
通讯作者 ：马春玲，女，副教授，研究方向 ：基因工程，微生物酶技术 ；E-mail ：machunling20022@163.com
克雷伯氏菌产 1，3-丙二醇 ldhA 基因缺失菌株的构建
陈利飞  李猛  马春玲  杨建楼
（齐鲁工业大学食品与生物工程学院 山东省微生物工程重点实验室，济南 250353）
摘 要 ： 克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia）甘油歧化发酵生产 1，3-丙二醇（1，3-PD）的过程中，乳酸是氧化途径最主要的
副产物，乳酸的产生和积累，不仅限制了菌体本身的生长，而且严重影响了 1，3-丙二醇的转化率。利用 λRed 重组技术对 Klebsiella
pneumonia 中的酶乳酸脱氢酶基因（ldhA）进行改造。在 λRed 重组系统作用下，将带有 300 bp 的线性同源片段 ldhA1-Cm-ldhA2 与
基因组 DNA 的同源重组，经过抗性筛选和 PCR 鉴定最终获得了 ldhA 基因缺失菌株 K. pneumonia2-1ΔldhA。经过 24 h 发酵可知，
乳酸最大产出浓度由原来的 10.16 g/L 降为 0.49 g/L，1，3-PD 由原来的 78.83 g/L 增长为 85.76 g/L，甘油转化率由 60.64% 增长到
65.97%，提高了 5.33%。
关键词 ： 克雷伯氏菌 ；ldhA 基因 ；λRed 同源重组 ；1，3-丙二醇
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.017
Construction a Metabolic Engineering Strain to Produce
1，3-propanediol from Klebsiella pneumoniae by ldhA Gene Deletion
Mutation
Chen Lifei Li Meng Ma Chunling Yang Jianlou
（Shandong Provincial Key Laboratory of Microbial Engineering，School of Food and Bioengineering，Qilu University of Technology，
Jinan 250353）
Abstract: Production of 1, 3-propanediol from glycerol by Klebsiella pneumoniae is restrained by lactate formation. The increase of
lactate in the broth can inhibit cell growth and reduce 1, 3-propanediol conversion rate. The lactate dehydrogenase gene（ldhA）of production
lactate by Klebsiella pneumoniae was modified by λRed recombination system. One 300 bp homologous recombinant fragment ：ldhAl-Cm-ldhA2
was constructed for the gene knockout. After resistance experiments, PCR determination, K. pneumonia2-1ΔldhA with ldhA gene knocked out
obtained by λRed recombination. After 24 h fermentation, the maximum yield of lactate was reduced to 0.49 g/L from 10.16 g/L and the maximum
threonine yield of 1, 3- propanediol was increased to 85.76 g/L from 78.83 g/L, comparing with that of the original strain K. pneumonia2-1. The
conversation rate of glycerol was improved to 65.97% from 60.64%, increasing by 5.33%.
Key words: Klebsiella pneumonia ；ldhA ；λRed recombination ；1, 3-propanediol
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3122
一方面通过还原途径在与 1，3-丙二醇氧化还原酶的
作用下产 1，3-PD ；另一方面通过氧化途径获取菌
体生长所需能量和还原氢［4，5］，与此同时氧化途径
还产出了大量的副产物，如乳酸等。乳酸的产生和
积累，不仅限制了菌体本身的生长，而且严重影响
了 1，3-PD 的转化率，并且为后续提取工艺带来了
不便，最终提高了生产成本［6］，可利用基因工程切
除乳酸的代谢途径解决此问题。λRed 重组系统是由
pKD46、pKD3、pCP20 三个质粒来共同完成使带有
一定长度同源臂的线性片段与基因组 DNA 实现基因
重组。pKD46 为温度敏感型质粒，在阿拉伯糖诱导
下使 exo、bet 和 gam 基因表达，以此来介导线性片
段与相应基因发生同源重组。pKD3 可作为克隆模
板来克隆两端带有 FRT 位点的氯霉素基因。pCP20
也是温敏型质粒，编码 FLP 重组酶，此酶能够识
别 FRT 位点，除去抗性基因，最终实现基因的无痕
敲除［7］。
本研究利用 λRed 重组技术［8］对 K. pneumonia
产乳酸代谢途径中的关键酶乳酸脱氢酶基因（ldhA）
进行敲除，以期获得高产 1，3-PD 的乳酸脱氢酶基因
缺失菌。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒和引物 具体详见表 1 和表 2。
1.1.2 主要仪器与试剂 限制性内切酶购自 TaKaRa
公司，Taq DNA 聚合酶、T4 连接酶及相关分子生物
学试剂盒均为上海生物工程技术服务公司产品，氨
表 1 本试验所用菌株和质粒
菌株和质粒 相关特性或序列 来源
菌株
E.coli DH5α F-，φ80dlacZΔM15，deoR，Δ（lacZYA-argF）U169，recA1，endA1，
hsdR17（rk-，mk+），phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1
实验室保藏
K. pneumoniae2-1［9］ 本实验出发菌株 实验室保藏
K. pneumoniaeΔldhA 本实验突变菌株 本实验构建
质粒
pMD19-T simple 克隆载体，Ampr，LacZ TaKaRa
pMD19T-ldhA Ampr 本实验构建
pMD19T -ldhA1-Cm-ldhA2 Cmr，Ampr 本实验构建
ldhA1-Cm-ldhA2 Cmr 本实验构建
pKD3 Cmr 杭州宝赛生物
pKD46 Ampr 杭州宝赛生物
pCP20 Cmr，Ampr 杭州宝赛生物
苄青霉素、氯霉素和 L-阿拉伯糖购自上海生物工程
技术服务公司，酵母浸粉和蛋白胨为北京奥博星生
物技术有限公司产品，其他试剂均为国产分析纯。
高效液相色谱仪为岛津公司产品，气相色谱仪为浙
江福立分析仪器有限公司产品，5 L 发酵罐为上海百
仑生物科技有限公产品。
1.2 方法
1.2.1 试验方法
1.2.1.1 培养基及培养方法 LB 培养基 ：10.0 g/L 蛋
白胨 ；5.0 g/L 酵母浸粉 ；10.0 g/L NaCl ；pH7 ；蒸馏
水 1 000 mL。种子培养基 ：甘油 20.0 g ；（NH4）2SO4
2 g ；K2HPO4 3.4 g ；KH2PO4 1.3 g ；MgSO4·7H2O 0.2
g ；CaCl2 2×10
-3g ；FeSO4·7H2O 5×10
-3 g ；酵 母 浸
粉 1.0 g ；柠檬酸 0.42 g ；微量元素 A 液 2 mL ；蒸
表 2 本试验所用引物
引物
名称
引物序列（5-3）
酶切
位点
A1 ATGAAAATCGCGGTTTATAGTACGAAGCAG -
A2 TTAGACGATGGCGTTCGGACAGGTT -
A3 GGGTACCCCGTAAGCTGGAACGCGCACGACG Kpn I
A4 CCGCTCGAGCGGAACACCAGCCGCGGCGCCC Xho I
L1 GGGTACCCCAGCGATTGTGTAGGCTGGAGC Kpn I
L2 CCGCTCGAGCGGCATGGTCCATATGAATATCCTCCT Xho I
2015,31(3) 123陈利飞等：克雷伯氏菌产 1，3-丙二醇 ldhA基因缺失菌株的构建
馏 水 1 000 mL。 微 量 元 素 A 液 ：CoCl2·6H2O 0.2
g ；MnCl2·4H2O 0.1 g ；ZnCl2 0.07 g ；H3BO3 0.06
g ；Na2MoO4·2H2O 0.035 g ；CuCl2·2H2O 0.02 g ；
NiCl2·6H2O 0.025 g ；蒸馏水 1 000 mL。发酵培养
基 ： 甘 油 50.0 g ；（NH4）2SO4 6.6 g ；NaH2PO4 1.38
g ；Na2SO4 0.28 g ；KCl 0.75 g ；MgCl2·6H2O 0.26 g ；
CaCl2·2H2O 0.29 g ；酵 母 浸 粉 1.0 g ；柠 檬 酸 0.42
g ；微量元素 B 液 5 mL ；蒸馏水 1 000 mL。微量元
素溶液 B ：CuCl2·2H2O 0.17 g ；MnCl2·4H2O 2.0 g ；
ZnCl2·6H2O 0.68 g；H3BO3 0.06 g；Na2MoO4·2H2O 0.005
g ；CoCl2·6H2O 0.47 g ；FeCl3·6H2O 5.4 g ；蒸馏水
1 000 mL。以上培养基用 2.5 mol/L 的 KOH 溶液调节
pH 到 7.0，121℃灭菌 20 min 待用［10］。种子培养 ：
挑取 4℃斜面保存的菌种，在装有固体 LB 培养基的
平板上划线活化，挑取单菌落接入装有 100 mL 种子
培养基的 250 mL 摇瓶中，37℃，180 r/min 摇床培养
14 h。发酵罐培养：在 5 L 全自动搅拌发酵罐中发酵，
装液量 3 L（发酵培养基），接种量 10%（V/V），发
酵温度 37℃，搅拌转速 200 r/min，发酵过程通入 0.4
vvm 的氮气维持厌氧环境，并用 2.5 mol/L 的 KOH 溶
液自动调节 pH 为 7.0，在对数生长中期按照甘油反
馈流加方式，使底物甘油浓度保持在 20 g/L 左右［11］。
1.2.1.2 感受态细胞的制备与电转化 克雷伯氏菌
电转化感受态细胞的制备参见魏东［12］的方法，电
转化条件确定为 2 500 V，25 μF，200 Ω，2 mm 电击杯。
1.2.1.3 同 源 重 组 线 性 片 段 ldhA1-Cm-ldhA2 的 制
备［7，13，14］ 首先以 A1、A2 为 引 物， 以 克 雷 伯 氏
菌基因组 DNA 为模板克隆出 ldhA 基因，然后 ldhA
基因与载体 pMD19-T（simple）连接获得重组质粒
pMD19-T-ldhA ；其次以 A3、A4 为引物、pMD19-T-
ldhA 为模板对其进行反向克隆，以期获得两端带有
300 bp 同源臂的线性片段 ldhA1-T-ldhA2 ；再次以 L1
和 L2 为引物、pKD3 为模板，克隆带有 FRT 位点的
Cm 基因，之后对 ldhA1-T-ldhA2 和 Cm 基因进行 Kpn I、
Xho I 双酶切，然后连接，获得 pMD19-T-ldhA1-Cm-
ldhA2 质 粒， 最 后 再 以 A1、A2 为 引 物、pMD19-T-
ldhA1-Cm-ldhA2 为模板，以期获得两端带有 300 bp
同源臂的同源重组线性片段 ldhA1-Cm-ldhA2（图 1）。
1.2.1.4 ldhA 基 因 的 敲 除 首 先 将 pKD46 质 粒 电
转入 K. pneumonia2-1，加入 LB 培养基 30℃复苏培
养 3-4 h，然后涂布到含有氨苄青霉素（100 μg/mL）
的 LB 固体培养基中 30℃培养 12-14 h，筛选出含
有 pKD46 质粒的菌株。其次，在 L-阿拉伯糖（10
mmol/L）诱导的条件下以含有 pKD46 质粒的克雷伯
氏菌为受体菌做电转化感受态，将带有 300 bp 同源
臂的同源重组线性片段 ldhA1-Cm-ldhA2 电转到含有
pKD46 质粒的菌株，LB 培养基中 30℃复苏培养 3-4
1
pMD19-T simple
2 692 bp
LacZ
ColE1 ori
Amp
ldhA
1
pMD19-T-ldhA
3 682 bp
ldhA
ColE1 ori
Amp
ldhA1-T-ldhA2
ldhA1 T Vector ldhA2
Cm
FRT FRT
1
pMD19-T-ldhA1-Cm-ldhA2
4 310 bp
LacZ
ldhA1
Cm
ldhA2
ColE1 ori
Amp
ldhA1-Cm-ldhA2
ldhA1 Cm ldhA2
图 1 同源重组线性片段 ldhA1-Cm-ldhA2 的制备流程图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3124
h 后涂布到含有氯霉素（100 μg/mL）的 LB 固体培养
基中，30℃培养，筛选出阳性转化子，升温到 42℃
培养 12-14 h 除去 pKD46 质粒。最后将 pCP20 电转
到阳性菌株中以去除其中的 Cm 抗性基因，再升温
到 42℃培养 12-14 h 去除 pCP20 质粒。
1.2.1.5 阳性菌株的鉴定 在电转 pCP20 质粒之前
和之后，分别以 A1、A2 和 L1、L2 为引物对突变
菌株和原始菌株进行菌落 PCR 鉴定，以期验证 ldhA
基因在原始菌株 K. pneumonia2-1 中实现完全敲除。
1.2.2 分析方法
1.2.2.1 生物量的测定 发酵液中的菌体密度以分
光光度计来测定，发酵液稀释一定倍数，以蒸馏水
为对照，测定 OD650 的吸光值。
1.2.2.2 1，3-丙二醇的测定方法［15］ 用气相色谱法
测定，色谱条件如下 ：氢火焰离子化检测器（FID）
检 测 器，2 m×Φ3 mm 填 充 柱， 填 料 为 GDX-401。
色谱条件 ：载气为 N2，柱温 220℃、进样口温度
260℃、 检 测 器 温 度 250℃ ；载 气 为 N2， 流 量 40
mL/min ；进样量为 1 μL。
1.2.2.3 乳酸的测定方法［16］ 采用高效液相色谱
法，用 KromasilC18 色谱柱进行测定。流动相为 0.2%
（V/V）磷酸和乙腈混合溶液（体积比为 96.5∶3.5），
流动相流速为 1.0 mL/min，紫外检测波长为 214 nm，
柱温为 35℃，进样量为 20 μL。
2 结果
2.1 K. pneumonia2-1ΔldhA菌的构建与鉴定
重组片段 ldhA1-Cm-ldhA2 的双酶切验证（图 2）
表明，成功构建出 1 628 bp 的线性同源片段 ldhA1-
Cm-ldhA2。对突变菌株和原始菌株进行菌落PCR鉴定，
结 果（ 图 3） 显 示， 泳 道 1 为 K.pneumonia2-1 的
ldhA 基因 990 bp，泳道 2 验证了 K.pneumonia2-1 中
没有 Cm 基因，泳道 3 和 4 鉴定出 ldhA1-Cm-ldhA2
和基因组中 ldhA 基因发生同源重组，即实现了 ldhA
基因的非完全敲除。电转 pCP20 质粒，消除 Cm 基
因后，对突变菌株和原始菌株进行菌落 PCR 鉴定。
结果（图 4）显示，ldhA1-Cm-ldhA2 和基因组中 ld-
hA 基因发生同源重组，并确定实现了 ldhA 基因的完
全敲除。上述试验结果与理论值一致，说明 ldhA 基
因完成敲除，K. pneumonia2-1ΔldhA 菌的构建成功。
5000
bp
M 1 2
3000
2000
1500
1000
800
300
M ：5000 bp DNA Ladder Marker ；1 ：ldhA1-Cm-ldhA2 ；2 ：ldhA1-Cm-ldhA2/
Kpn I+ Xho I
图 2 重组片段 ldhA1-Cm-ldhA2 的双酶切验证
5000
bp
M 1 2 3 4
3000
2000
1500
1000
800
500
300
M ：5000 bp DNA Ladder Marker ；1 ：K. pneumonia2 -1 的 ldhA ；
2 ：K. pneumonia2-1 的 Cm ；3 ：K. pneumonia2-1ΔldhA 的 ldhA1-Cm-ldhA2 ；
4 ：K. pneumo-nia2-1ΔldhA 的 Cm
图 3 ldhA 基因非完全敲除的菌落 PCR 鉴定
5000
bp
M 1 2 3 4
3000
2000
1500
1000
800
500
300
M ：5000 bp DNA Ladder Marker ；1 ：K. pneumonia2 -1 的 ldhA ；
2 ：K. pneumonia2-1 的 Cm ；3 ：K. pneumonia2-1ΔldhA 的 ldhA1-Cm-ldhA2 ；
4 ：K. pneumonia2-1ΔldhA 的 Cm
图 4 ldhA 基因完全敲除的菌落 PCR 鉴定
2.2 K. pneumonia2-1ΔldhA菌株的生长特性
原始菌株与突变菌株生长特性结果（图 5）显
2015,31(3) 125陈利飞等：克雷伯氏菌产 1，3-丙二醇 ldhA基因缺失菌株的构建
示，与原始菌株 K. pneumonia2-1 相比，基因缺失菌
株 K. pneumonia2-1ΔldhA 菌 体 生 长 状 况 在 6 h 之 前
基本一致，进入对数期后 K. pneumonia2-1ΔldhA 菌
株比原始菌株生长旺盛，其 18 h 时 OD 达到最大为
14.34，比原始菌株最大 OD 值 12.67 要大。这说明
在对数生长期和稳定生长期突变菌株比原始菌株生
长旺盛。
敲除后，有足够的还原当量供给产 1，3-PD 的代谢
途径。
2.4 ldhA基因的敲除对乳酸产量的影响
原始菌株与突变菌株产乳酸比较的结果（图 7）
显示，改造前后乳酸的产量相差较大，原始菌株 K.
pneumonia2-1 乳酸产量随发酵时间增大，其最大产
出浓度为 10.16 g/L。然而，K. pneumonia2-1ΔldhA 突
变菌株乳酸的产量一直变化不太，最大浓度仅为 0.49
g/L，降低了 95.17%。因此 ldhA 基因的敲除对乳酸
产量的影响较大，也证实了 ldhA 基因已被完全敲除。
16
14
12
10
8
6
4
2
0
O
D
65
0
0 5 10 15 30 3025ᰦ䰤hK. pneumonia2-1K. pneumonia2-1ΔldhA
图 5 原始菌株与突变菌株生长特性比较
2.3 ldhA基因的敲除对1，3-PD的影响
原始菌株与突变菌株产 1，3-PD 比较的结果（图
6） 显 示， 原 始 菌 株 K. pneumonia2-1 发 酵 到 20 h
时 1，3-PD 浓度达到最大值 78.83 g/L，生产强度为
3.28 g/（L·h），质量转化率为 60.64%。经过改造
后 K. pneumonia2-1ΔldhA 产 1，3-PD 能 力 有 所 提 高，
发酵到 20 h 时 1，3-PD 的最大浓度为 85.76 g/L，生
产 强 度 为 3.57 g/（L·h）， 质 量 转 化 率 为 65.97%，
比 原 始 菌 株 K. pneumonia2-1 提 高 了 5.33%。 表 明
ldhA 基因的敲除提高了 1，3-PD 的产量，主要是因
为乳酸的代谢会竞争性的消耗还原氢，而 ldhA 基因
100
90
80
70
60
50
40
301
,3
-P
D
g·L-1 
20
10
0
0 10 20 30ᰦ䰤hK. pneumonia2-1K. pneumonia2-1ΔldhA
图 6 原始菌株与突变菌株产 1，3-PD 的比较
La
ct
at
eg·L-1  121086
4
2
0
0 5 10 20 302515ᰦ䰤hK. pneumonia2-1K. pneumonia2-1ΔldhA
图 7 原始菌株与突变菌株产乳酸的比较
3 讨论
肺炎克雷伯氏菌的甘油代谢主要有两个代谢途
径，分为氧化途径和还原途径。在氧化途径中，甘
油在相关酶的作用下生成磷酸二羟丙酮，之后进入
糖酵解途径生成丙酮酸，进一步代谢生成乳酸、甲
酸、乙酸、琥珀酸等大量副产物，其中乳酸含量最
高，并且乳酸对 1，3-PD 的抑制最为明显［17］，其一
般形成于对数生长期，并在稳定生长期积累，乳酸
的积累对菌体有毒害作用，不利于菌体生长，此外，
乳酸代谢途径会消耗大量的还原当量 NADH［18］，对
1，3-PD 的代谢途径还原当量和碳流量起竞争作用，
不利于底物甘油向 1，3-PD 途径转化。因此，为了
提高还原途径中 NADH 的利用率，在不影响辅酶
NADH 再生的同时来提高 1，3-PD 的得率，降低分离
提取成本，利用基因工程切除乳酸代谢途径是解决
此问题的方法。
本研究通过基因工程的方法，实现了 ldhA 基因
的敲除，使 1，3-PD 的发酵浓度由 78.83 g/L 增长到
85.76 g/L，这与蔡忠贞等［19］的研究结果 1，3-PD 产
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3126
量提高 11%，乳酸产量降低 98% 保持一致。Oh 等［14］
构建了乳酸和 2，3-丁二醇副产物双缺失菌株，优化
发酵条件后 1，3-PD 达到 102.7 g/L。本研究将进一步
改造克雷伯氏菌的代谢途径，敲除其他副产物相关
基因，实现两种甚至多种基因的共敲除，优化发酵
体系，以期提高 1，3-PD 的产量。
4 结论
本研究以 ldhA 基因为研究对象，采用 λRed 重
组技术对 K. pneumonia2-1 中的 ldhA 基因进行敲除，
通过将带有 300 bp 的线性同源片段 ldhA1-Cm-ldhA2
导入宿主菌株，在 λRed 重组系统相关质粒的作用
下，实现了与基因组 DNA 的同源重组，经过平板抗
性筛选最终获得了 ldhA 基因缺失菌株 K.pneumonia2-
1ΔldhA。经过初步发酵研究可知，乳酸最大产出浓度
由原来的 10.16 g/L 降为 0.49 g/L，降低了 95.17%，
1，3-PD 由原来的 78.83 g/L 增长为 85.76 g/L，其质
量转化率由 60.64% 增长到 65.97%，提高了 5.33%。
由此知 ldhA 基因的敲除不仅阻断了乳酸的产生，并
且提高了 1，3-PD 的产量。
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（责任编辑 马鑫）