全 文 ：17 卷 1 期
2001年 1 月
生　物　工　程　学　报
ChineseJournal of Biotechnology
Vol.17 No.1
January　2001
　
收稿日期:2000-06-12 ,修回日期:2000-09-18。
基金项目:国家高技术研究与发展计划项目(Z-17-01-01)及 ICSC 的世界实验室的部分资助。
＊通讯作者。Tel:86-10-62550187;Fax:86-10-62560912;E-mail:tianyc@sun.im.ac.cn
苋菜凝集素基因的克隆及在转基因烟草中抗蚜性研究
周永刚　田颖川＊　莽克强
(中国科学院微生物研究所 ,北京　100080)
摘　要　通过 PCR从苋属植物千穗谷(Amaranthus hypochondriacus)的总 DNA 中扩增出苋菜凝集素(AHA)的核
基因片段。序列分析结果表明该基因为 2453bp ,含有一 1538bp 的内含子和两个分别为 212bp 和 703bp 的外显子。
采取反向 PCR的方法获得仅含该基因的编码区克隆。以此为基础与二元表达载体 pBin438 构建含内含子与不含
内含子 AHA 基因的植物表达载体 pBAHAg 和 pBAHAc 并通过土壤农杆菌介导转化了烟草。 转化再生植株的
PCR和 Southern blo t分析表明 , AHA 基因已整合到烟草的染色体中 ,有单拷贝和多拷贝的整合。用与 AHA 蛋白
高度同源的 ACA 蛋白的抗血清进行了免疫斑点(Immunodot blot)检测 , 结果初步表明转基因烟草有 AHA 蛋白的
表达。虫试结果表明转 pBAHAg 和 pBAHAc烟草对蚜虫的平均抑制率分别达 57.2%和 48.8%,有的高达 90%以
上。含内含子和不含内含子的 AHA 基因在转基因植株中的抗蚜性不同。
关键词　千穗谷苋菜 AHA 基因 , 转基因烟草 , 抗蚜性
中图分类号　Q789　　　文献标识码　A　　文章编号 1000-3061(2001)01-0034-06
　　蚜虫属于同翅目昆虫 ,通过吸取植物韧皮部的
汁液造成直接的危害 ,又通过传播植物病毒对植物
造成间接的危害 。植物抗虫基因工程的研究进展为
控制蚜虫的危害提供了新的途径。现阶段抗蚜基因
工程的关键是寻找新的高效的抗虫基因 。已报道的
有抗蚜活性的基因有 ipt 基因[ 1] , Mi 基因[ 2]和一
些植物凝集素基因。广泛应用于抗蚜转基因植物的
抗蚜基因为 GNA 和 ConA 基因 , GNA 基因已成功
的导入到烟草[ 3 ,4] 、马铃薯[ 5] 、小麦[ 6] 等植物中 ,
ConA 基因也导入到马铃薯中[ 7] 。这些转基因植物
对蚜虫的生长 、发育和繁殖能力有一定的抑制作用 。
Rahbe
[ 8]等系统地研究了 30种植物凝集素在体外
的抗蚜虫的活性 ,发现一种来源于尾穗苋种子中专
一性与 2-乙酰氨基-2-脱氧-D半乳糖结合的凝集素
ACA[ 9](Amaranthus caudatus agglutinin)在体外的
抗虫活性比GNA 和 ConA 更高 ,其对蚜虫的致死浓
度只有 GNA 和 ConA 的一半 , 而死亡率达到
100%。这表明 ACA 是一种潜在有效的抗蚜基因 ,
但在整体植物中的作用尚未见报道 。
千穗谷苋菜 A.hypochondriacus 和尾穗苋菜
A .caudatus 是同一属中不同的种 。来源于 A .
hypochondriacus的基因 AmA1 编码的蛋白是一种
种子贮藏蛋白 ,必需氨基酸的含量高 ,具有平衡营养
的作用[ 10] 。 AmA1 cDNA 推导的氨基酸序列与
ACA的氨基酸序列有高达 97.7%的同源性[ 11] ,所
以推测它们具有相似的生物学功能。为方便比较我
们将按 AmA 1基因序列设计引物经 PCR克隆的
AmA 1基因定名为 AHA 。国内外对 AHA 的核基
因结构及可能的抗蚜活性研究尚未见报道 。本文主
要介绍 AHA 基因克隆及其转基因烟草抗蚜活性的
研究结果 。
1　材料与方法
1.1　菌种与质粒
大肠杆菌 DH5α, 土壤农杆菌 LBA4404 ,质粒
pUC18 , pD12 ,pBin438为本实验室保存或构建 。
1.2　植物材料
制备总 DNA 的苋菜品种千穗谷(Amaranthus
hypochondriacus)由美国 IOWA 州立大学区域植物
引种站馈赠。4 ～ 5叶期的无菌培养烟草(Nicotiana
tabacum)SR1是土壤农杆菌转化实验的外植体。
1.3　酶与试剂
DOI:10.13345/j.cjb.2001.01.008
Taq Plus ,Pfu ,T4 DNA 连接酶购自上海生工生
物工程有限公司 , 各种限制酶和修饰酶购自
Boehringer mannheim , BRL , Promega , Takara 等公
司。T7 DNA Sequencing Kit 为 Pharmacia 公司产
品;α-35S-dATP 购自 NEN 公司 。PCR引物由上海
生工生物工程有限公司合成。
1.4　测试昆虫
采自本所温室非转基因烟草上的桃蚜(Myzus
persicae),在健康的烟草上繁殖 。
1.5　苋菜总 DNA的提取
参照文献[ 12] ,从苋菜叶片提取总 DNA。
1.6　目的基因的扩增和克隆
根据报道的苋菜 AmA 1 cDNA 序列[ 10] ,设计
PCR扩增反应的两个引物:
　 　P1(5′端)引物 5′>GGAAGATCTACCATGGCGG-
GATTACCAGTG3′
　 　P2(3′端)引物 5′>AGCGTCGACTTAGTTGTTG-
GATCCCAATTC3′
取 1μL 总 DNA 约 50ng在 20μL 体系中进行目
的基因的扩增。扩增条件为:94℃预变性 3min ,然
后以 94℃变性 1min , 49℃复性 40s , 72℃延伸
1.5min ,进行 30个循环 ,最后 72℃延伸 10min。
通过 Agrose凝胶电泳回收扩增片段 ,与来源于
pUC18的 T 载体(实验室制备)连接 ,转化大肠杆菌
感受态细胞 DH5α,在含有 IPTG 和 X-gal的氨苄青
霉素的 LB平板上筛选重组克隆。
1.7　DNA序列分析
挑选重组克隆按 Pharmacia T7 Sequencing Ki t
进行序列分析。选两端序列正确的克隆经 ABI 377
自动测序仪完成全序列测定。有完整 AHA 基因插
入的重组质粒命名为 pAHAg 。
1.8　反向 PCR扩增 AHA 基因编码区序列
反向 PCR引物为:
　 　P3 引物:5′>GTGGTCCCCCAATCATTATTG 3′
　 　P4 引物:5′>CTAACCAAATATT TGTTAGTG 3′
以质粒 pAHAg DNA 为模板 ,取 1uL(～ 1ng)在
20uL 体系进行 PCR 扩增。扩增反应条件为:94℃
预变性 3min ,然后 94℃变性 1min , 56℃复性 40s ,
72℃延伸 2.5min ,30个循环 ,最后 72℃延伸 10min 。
所得 PCR片段经 T4 DNA 多核苷酸激酶进行磷酸
化 ,然后参照文献[ 13]所述用 T4 DNA连接酶连接
转化大肠杆菌感受态细胞 DH5α后挑取转化子进行
全序列分析。质粒命名为 pAHAc。
1.9　植物表达载体的构建
重组质粒 pAHAg 经 Nco Ⅰ酶切 ,Klenow 补平 ,
Sal Ⅰ酶切后回收 AHA 基因片段与BamHI 酶切 ,
Klenow 补平 , Sal Ⅰ酶切的载体 pD12连接 ,所得重
组质粒命名为 pDAHAg 。用 Hin d Ⅲ和 Sal Ⅰ酶切
质粒 pDAHAg ,电泳回收 AHAg 基因表达框 DNA
片段与同样酶切的载体 pBin438连接[ 14] ,所得质粒
命名为 pBAHAg 。重组质粒 pAHAc 经 Bgl Ⅱ和
Sal Ⅰ酶切 ,回收基因片段与 BamHI 和 Sal Ⅰ酶切
的载体 pBin438 连接 , 所得质粒命名为 pBAHAc。
按文献[ 15]将质粒 pBAHAg 和 pBAHAc 转入土壤
农杆菌 LBA4404 中后即可用于植物的转化(资料
略)。
1.10　烟草外植体的转化和再生
参照文献[ 16]进行 。
1.11　转化烟草植物的 PCR分析
转基因烟草叶片总 DNA的提取按文献[ 12]的
方法 。转 pBAHAg 质粒的烟草用 35S 引物(5′CT-
GACG TAAGGGATGACGC3′)和 P4 引物扩增;转
pBAHAc质粒的烟草用 P1 ,P2引物扩增 。
1.12　转基因烟草的 Southern blot分析
按文献[ 12] 提取烟草总 DNA。取 20μg DNA
用 Hind Ⅲ完全酶解后在 0.8%Agarose上电泳。用
毛细管法将胶上的 DNA 转移到 Hybond-N+膜上。
按 Pharmacia公司 DNA标记盒提供的方法用α32P-
dCTP 标记的 AHA 基因片段 ,按文献[ 13]所述方法
进行转移和杂交。
1.13　转基因烟草的 Immunodot blot检测
参照文献[ 7] 方法 ,取 50mg 烟草叶片 ,液氮研
磨后加入 100μL 蛋白质提取缓冲液 ,混匀 ,4℃离心
取上清。取 10μL 的烟草总蛋白点在硝酸纤维膜
上 ,待蛋白完全干燥后 ,进行斑点杂交反应 。抗体为
本实验室制备的 ACA 蛋白的兔抗血清。
1.14　转基因烟草的抗蚜试验
当转基因烟草和非转基因烟草长到 3 ～ 5片叶
时 ,取 PCR检测阳性的植株中层叶片 ,插到装有无
糖的 MS固体培养基的 100mL 容积三角瓶中 ,在植
物光照培养箱中进行培养 。培养条件为每日光照
16h ,温度 25℃;黑暗 8h ,温度 22℃。每个培养瓶中
放置 1 片叶片 , 用毛笔小心接入 3 只 1 龄桃蚜
(Myzus persicae),隔日记录每片叶片上所有蚜虫的
数量 ,直至第 12天 。抗蚜试验重复 2次。按下式计
算参试植物对蚜口密度增长的抑制百分数:
蚜口密度抑制%=(对照植株虫数-参试植株虫数)对照植株虫数 ×100%
351 期 周永刚等:苋菜凝集素基因的克隆及在转基因烟草中抗蚜性研究
2　结果与讨论
2.1　苋菜 AHA核基因 AHAg 的 PCR扩增和克隆
以苋菜总 DNA 为模板进行 PCR扩增 ,产物经
琼脂糖电泳分析表明有 2条大小分别约为2.5kb和
1.0kb的 DNA 片段(图 1),分别回收这 2 个 DNA
片段后 ,克隆至载体 pUC18中 。通过抗生素筛选和
重组质粒的酶切分析 ,对每种片段都选到了一批克
隆。
图 1　苋菜 AHA 基因的 PCR扩增产物电泳图
Fig.1　Electrophoresis of PCR product from genomic
DNA of Amaranthus hypochondriacus.
A.PCR product;M.1kb DNA ladder
　
2.2　苋菜 AHAg 基因的序列分析
对获得的克隆进行序列分析的结果表明 2.5kb
的片段含有目的基因 ,而 1.0kb的片段为非特异的
扩增片段。由于所用退火温度较低(49℃),在基因
组扩增时容易出现非特异性的扩增 。全序列分析发
现 AHAg 基因全长为 2453bp ,含有一个 1538bp的
内含子 ,其外显子 1为 212bp ,外显子 2为 703bp ,内
含子的剪切位点符合 GT/AG 的规则 。内含子的
AT 碱基的含量高达 73%,符合一般内含子中 AT
含量高的特征。任意选 3 个克隆进行了全序列分
析 ,结果一致 ,其外显子序列与 AmA 1 cDNA 的序
列基本一致 ,只在 219位由 T 变为 C ,但不影响氨基
酸的编码 。 AHA 基因的结构如图 2所示 ,这是对
AHA 核基因结构的首次报道。 AHA 基因的序列
已存入GenBank ,序列号为 AF143954。
图 2　AHA 基因结构示意图
Fig.2　AHA gene structure
　
2.3　AHA基因编码区序列的克隆
为获得 AHA 基因的编码区序列 ,以便在原核
体系中表达 AHA 蛋白 ,在体外研究其功能及制备
抗血清 ,同时研究该基因在其它植物中的功能。对
含 AHAg 基因的 pAHAg 进行了反向 PCR扩增 ,产
物经电泳分析约为 3.7kb(2.68kb 载体+0.9kb 编
码区)。对所得克隆的全序列分析证明两外显子已
正确地连接成完整的 AHA 编码区 ,未发生移码或
缺失突变(资料略)。
2.4　植物表达载体的构建
为了研究 AHA 在转基因植物中可能的抗蚜作
用及研究内含子对 AHA 基因表达的影响 ,利用二
元载体 pBin438[ 14]构建了组成型表达载体 pBAHAg
和 pBAHAc。重组质粒pBAHAg经 Hind Ⅲ/ Sal Ⅰ
双酶切能得到 3.2kb 的片段 ,重组质粒 pBAHAc为
1.6kb片段 ,酶切分析的结果证明其正确(资料略)。
AHA 基因表达载体的结构如图 3所示 。
图 3　AHA 基因植物表达载体的结构
Fig.3　Structure of plant expression
vector pAHAg and pAHAc
　
大部分植物基因 mRNA 前体含有一个或多个
内含子 ,其长度相差很远 , 2/3的内含子在 150bp以
下 ,很少有大于 2 ～ 3kb 的[ 17] 。我们克隆的 AHAg
基因含有一个 1538bp 内含子 。在高等植物转基因
的研究中发现有的内含子可被用来优化转基因的表
达 ,在合适的情况下 ,基因中的内含子有利于mRNA
的稳定和正确的加工 。为了能更好地利用 AHA 基
因 ,我们分别构建了该基因的核基因和cDNA的表
达载体 ,以期研究它们在植物中的表达水平的差异。
用含有 pBAHAg 或 pBAHAc的土壤农杆菌转化烟
草 ,在含 300μg/mL 卡那霉素的 MS 培养基上选择
不定芽 , pBAHAg , pBAHAc 分别获得一批再生植
株。
2.5　转化再生植株的 PCR检测
PCR方法可以快速测定外源基因的整合情况。
用 35S 启动子引物和 P4 引物扩增转pBAHAg转化
36 生　　物　　工　　程　　学　　报 17 卷
植株的 DNA ,应扩增得到一条 372bp 的片段 。用
P1 ,P2引物扩增 pBAHAc转化植株 ,应得到一条为
912bp的片段 。图 4(a、b)的结果显示扩增到正确大
小的 DNA 片段 ,初步证明外源基因很可能已整合
到植物的染色体中。在转 AHAg 和 AHAc 基因再
生植株中分别获得了 45和 35株 PCR阳性的植株 。
图 4a　转 AHAc基因烟草的 PCR分析
Fig.4a　PCR analy sis of tobacco
plants transformed with AHAc
M.DNA 1kb ladder;1.Posi tive control;2.Unit ransformed
tobacco;3～ 15.Transformed tobacco plants
　
图 4b　转 AHAg 基因烟草的 PCR分析
Fig.4a　PCR analy sis of tobacco
plants transfo rmed with AHAg
M.DNA 1kb ladder;1.Posi tive control;2.Unit ransformed
tobacco;3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 10.Transformed tobacco plants;
9.Nont ransgenic tobacco plant
　
2.6　转基因烟草的 Southern blot检测
在PCR 检测的基础上 , 选择阳性植株的总
DNA用 Hind Ⅲ完全酶解后进行 Southern blot分析
以进一步确定外源基因的整合情况 。其中正对照为
Hind Ⅲ酶切的质粒 pBAHAg(16.5kb)和 Nco Ⅰ ,
Sal Ⅰ双酶切的 pAHAg 质粒回收的 AHAg 基因片
段(2.5kb)。由于所构建的表达载体上只含有 1个
HindⅢ酶切位点 ,用 AHA 基因的探针杂交可以反
映外源基因的拷贝数。Southern blot 结果显示(图
5)所检测的 5个植株有 1 ～ 3个特异的杂交带 ,非转
基因植株没有杂交带 。阳性对照在预期的位置有 2
条杂交带 。这样初步证明了 5个植株均有 AHA 基
因插入 ,其插入的拷贝数有的为 1个 ,有的为 2个或
3个。
图 5　转基因烟草的 Southern blot分析
F ig.5　Southern blot analy sis of transgenic tobacco plants
1 ～ 2.pBAHAg transformed plants;3 ～ 5.pBAHAc transformed
plants;6.Untransformed plan t;7.Posit ive cont rol 32P labeled 0.9kb
　　　 AHA gene fragment w as used as probe.
　
2.7　转基因烟草的 Immunodot blot检测
在免疫斑点反应中来自转基因烟草的总蛋白提
取物与抗 ACA 蛋白的抗血清有特异的免疫反应。
　　　　
图 6　转基因烟草的 Immunodot blo t分析
Fig.6　Immunodot blo t analysis of transgenic tobacco plants
CK+.ACA protein;CK-.unt ransformed tobacco plants;
1～ 4.AHAc t ransformed plants;5～ 8.AHAg t ransformed plants
　
图 7　转 AHAg 和 AHAc 基因烟草蚜虫抑制率分布
Fig.7　Inhibition rate of aphid population
development on trangenic tobacco
Ordinate:aphid reproduct ion inhibition rate;35 , 45 and 4
plan ts w ere used for AHAC , AHAg and nontransf romed plants
respect ively.t/12d
　
371 期 周永刚等:苋菜凝集素基因的克隆及在转基因烟草中抗蚜性研究
虽然非转基因的植物蛋白(CK-)与抗血清也有微弱
的反应 ,但转基因植株反应显色强度明显高于对照 ,
扫描定量的结果显示转基因植株的杂交反应强度为
对照植株的 2 ～ 5倍(资料略),所以这一结果初步表
明在转基因植物中有 AHA 蛋白的合成 。
2.8　转基因烟草对蚜虫生长发育的抑制作用
pBAHAg 和 pBAHAc转基因烟草的抗蚜试验
结果(图 7)表明:pBAHAg 和 pBAHAc 植株对蚜虫
密度有明显的抑制作用 ,平均抑制蚜口密度分别约
57.2%和 48.8%,有些植株有强烈的抗蚜活性 ,最
高可抑制 90%的蚜口密度。
植株抗蚜性的分布主要集中在平均值区域 ,转
AHAc基因植株抗蚜性分布在 45%～ 65%,而转
AHAg 基因抗蚜性分布于 50%～ 75%。取部分抗
性植株进行了抗蚜活性的连续观察 ,结果如图 8。
由图 7 和图 8 可知 , 转 pBAHAg 的植株比较
pBAHAc植株能更好的抑制蚜口密度。这表明转含
内含子的 AHA 基因比不含内含子的基因有更好的
抗蚜性 ,可能是由于内含子的存在影响了 AHA 基
因在异源植物烟草中的转录 ,使之形成了更多或更
稳定的 mRNA ,提高了外源基因的表达量 ,从而提
高了抗虫性 ,但确切的原因还必须有更多的分子生
物学证据来证明 。
图 8　转基因烟草对蚜口密度增长的抑制作用
Fig.8　Inhibition effects of transgenic tobacco plants
on the population development of M.persicae
rdinate:Aphid population(number);Abscissa:time(days);12 , 16 and
4 plants w ere used for AHAc , AHAg and unt ransformed
plants repectively
　
目前已用于转基因抗蚜研究的植物凝集素基因
有 GNA 和ConA 。Hilder[ 3]等利用CaMV 35S启动
子驱动下转 GNA 基因烟草对桃蚜平均抑制率为
50%,周岩[ 4]等为 45%～ 60%。35S启动子驱动下
转 ConA 基因马铃薯对马铃薯蚜的平均抑制率为
45%[ 7] 。本文构建的 35S 与 AHAc 和 AHAg 基因
的转基因烟草对蚜虫平均抑制率为 48.8%～
57.2%。与 GNA 和ConA 基因表现出相似的抗蚜
活性 。表达 AHA蛋白的转基因烟草主要表现出对
蚜虫繁殖作用有抑制 ,影响其群体的形成 ,对蚜虫的
死亡率没有大的影响 。这与转 GNA 和 ConA 基因
的转基因植物对蚜虫的影响一致。 GNA , ConA ,
AHA 这 3种凝集素属于不同的凝集素家族 ,在基
因及蛋白序列和结构上同源性不大 ,它们分别结合
不同的糖基位点 ,对蚜虫的作用机制可能也不相同 ,
这有助于构建多基因载体以获得更有效的抗蚜转基
因植物。
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Aphid Inhibitory Effect in Transgenic Tabacco Plants
ZHOU Yong-Gang　T IAN Ying-Chuan＊　MANG Ke-Qiang
(Institute o f Microbiology , Chinese Academy of Sciences , Beijing 100080, China)
Received:June 12 , 2000
This w ork w as supported by the S tate “ 863” High-Tech Project(Grant No.217-01-01)and Partly by the World Laboratory of the International
Center of Science and Culture(ICSC).
＊ Corresponding author.Tel:86-10-62550187;Fax:86-10-62560912;E-mail:tianyc@sun.im.ac.cn
Abstract　Using total DNA isolated from Amaranthus hypochondriacus as template , Amaranthus hypochondriacus ag-
glutinin AHA gene was amplified by PCR and cloned.Sequence analysis results showed that this gene is consisted of 2453
base pairs including one 1538 bp int ron and two exons of 212 bp and 703 bp respectively.Af ter inverse PCR amplifica-
tion , coding region of AHA gene was obtained.AHA gene with it′s int ron(AHAg)and withou intron(AHAc)were in-
serted dow nst ream of 35S promotor in the binary vector pBin438 resulting in the construction of two plant expression vec-
tors pBAHAg and pBAHAc repectively.Leave explants of Nicotinana tabacum var.SR1 were transformed with A.
tumefaciens LBA4404 harbouring the above expression vectors.Results from PCR and Southern blot analysis showed that
AHA genes were inserted into the genome of t ransformed tobacco plants.Immunodot blot analysis indicated that AHA
was expressed in t ransgenic plants.The results f rom insect bioassay with peach aphid (Mizus persicae)showed that the
transgenic plants of pBAHAg and pBAHAc were aphid resistant , evidenced by a 57%～ 48% reduction in insect popula-
tion density , some plants were more than 85%.The aphid resistance of t ransgenic plants transformed with AHAg gene as
judged by aphid inhibition rate was higher than that of plants t ransormed with AHAc gene indicating that the int ron in
AHAg may be favorable for expression of AHA in transgenic plants.
Key words　AHA gene , t ransgenic tobacco , aphid resistance
391 期 周永刚等:苋菜凝集素基因的克隆及在转基因烟草中抗蚜性研究