全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 12期
AFLP分子标记技术在中药研究中的应用进展
肖硕
(华中科技大学同济医学院附属荆州医院,荆州 434020 )
摘 要 : AFLP (扩增片段长度多态性 )分子标记技术是一种结合了 RFLP和 PCR技术的新型分子标记技术,在药物研究
领域的应用日趋广泛。简述了 AFLP分子标记技术的基本原理、技术特点与优势, 重点阐明其在中药研究中的应用进展, 并对
其前景进行了讨论与展望。
关键词: 扩增片段长度多态性 分子标记 中药研究 应用
Advances in the AFLP Application Research on ChineseM edicine
X iao Shuo
(T he Aff iliated J ingzhouH o sp ital, TongjiM edical School,H uazhong University of Science and T echnology, J ingzhou 434020)
Abstrac:t AFLP ( amp lified fragm ent length po lym orphism )m o lecu lar ma rker techno logy is a new type of m o lecularm arke r tech
nology com b ining RFLP and PCR techniques, wh ich has been w idely app lied in the fie ld o f drug research. Th is paper described the bas
ic princ iples, character istics and advantag es of the techno logy o f AFLP, focusing on its application progress in Ch inese m edic ine re
search, and re fe rs to the discussion and prospects.
Key words: AFLP M olecularm arker Ch inese med ic ine research App lica tion
收稿日期: 20100630
作者简介:肖硕,硕士,研究方向:医院药学; Em ai:l x iaoshuo980519@ yahoo com cn
AFLP ( amp lified fragm ent leng th po lymorphism )
技术由荷兰科学家 Zabeau与 Vos等 [ 1]创建的, 结合
了 RFLP和 PCR技术新型分子标记技术,具有 RFLP
技术的可靠性与 PCR技术的高效性。由于 AFLP扩
增可使某一品种出现特定的 DNA谱带,而在另一品
种中可能无此谱带产生,因此, 这种通过引物诱导及
DNA扩增后得到的 DNA多态性可作为一种高效的
分子标记。AFLP分子标记技术结合了 RFLP和 PCR
技术的优点,具有灵敏、稳定、所需 DNA量少、多态性
丰富、重复性好等优点,作为一种功能强大但是技术
难度最高的分子标记, 已经在植物育种遗传标记、遗
传多样性研究、遗传图谱的构建、种质资源评价等方
面得到了广泛的应用。
1 AFLP的基本原理
AFLP分子标记技术是把基因组 DNA先用限制
性内切酶切割,然后将双链接头连接到 DNA片段的
末端、接头序列和相邻的限制性位点序列, 作为引物
结合位点。限制性片段用两种酶切割产生, 一种是罕
见切割酶,一种是常用切割酶。由于引物的合成具有
特异性,从而使扩增产物也具有特异性。PCR产物变
性后,在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳, 分离扩
增的 DNA片段, 经放射自显影、银染或荧光技术,得
到扩增的 DNA片段谱带,通过比较,即可找出不同样
品 DNA谱带的差异。
2 AFLP技术的主要特点与技术优势
2. 1 所需 DNA量少
仅需 0. 5 g, 甚至可以分析线粒体与叶绿体
DNA;反应技术对模板浓度的变化不敏感, DNA浓度
在 1 000倍的范围内变化时对反应的影响都不太大,
所产生的指纹图谱十分相似。
2. 2 可重复性好
AFLP分析基于 DNA电泳条带的有或无, 高质量
的 DNA和过量的酶可以克服因 DNA酶切不完全而产
生的失真, PCR反应中较高的退火温度和较长的引物
可将扩增中的错误减少到最低限度,因而 AFLP分析具
有很强的可重复性。 Jones等在欧洲 8个实验室使用
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 12期
共同的样本,进行严格的试验,将得到的 DNA图谱进
行比较, 172条谱带中仅一条出错,误差小于 0. 6% [ 2]。
2. 3 多态性强
AFLP分析可以通过改变限制性内切酶和选择
性碱基的种类与数目,来调节扩增的条带数,具有较
强的多态分辨能力。设计不同的人工接头就会相应
地产生不同的 AFLP 引物, 引物 3 端的选择性碱基
数目、组成多样化。由于 AFLP 引物设计的多样化
及巧妙、灵活的搭配, 使得 AFLP理论上产生的标记
数目是无限的。迄今为止, 每个 AFLP 反应能检出
多态片段之多、信息量之大、效率之高是其它任何一
种分子标记所无法比拟的。
2. 4 分辨率高
AFLP扩增片段短, 适合于变性序列凝胶电泳
分离,因此片段多态性检出率高,而 RFLP片段相对
较大, 内部多态性容易被掩盖。
2. 5 安全性高
AFLP扩增不需要 Southern杂交, 故而试验无
放射性危害, 且不需要预先知道被分析基因组的
DNA序列信息,是一种半随机的 PCR。
2. 6 样品适用性广
AFLP技术适用于任何来源和各种复杂的
DNA,如 cDNA、质粒、某一个基因或基因片段等,且
不需要预知这些 DNA的序列特征。用同样的一套
限制酶、接头和引物, 可对各种生物的 DNA进行分
子遗传标记研究。
2. 7 遗传性稳定
AFLP标记在后代中的遗传和分离中符合 M en
del遗传规律,种群中的 AFLP标记位点遵循 Hardy
W einberg平衡。
总之,在技术特点上, AFLP实际上是 RAPD和
RFLP相结合的一种产物。它既克服了 RFLP 技术
复杂、有放射性危害和 RAPD稳定性差、标记呈现
隐性遗传的缺点;同时又兼有二者之长。近几年来,
人们不断将这一技术完善、发展,使得 AFLP迅速成
为迄今为止最有效的分子标记。
3 AFLP在中药研究中的应用
如上所述, AFLP具有可靠性好、重复性强、可
信度高等优点,近年来广泛应用于动植物遗传育种
及其他多方面的研究,如构建遗传连锁图谱、快速鉴
别与目的基因紧密连锁的分子标记、AFLP辅助的
轮回选择育种、利用 AFLP技术研究基因表达与调
控、分类和进化研究、DNA的甲基化研究等; 而且,
随着我国道地药材的研究技术迅速发展, AFLP在
中药研究中的应用日益广泛。
3. 1 遗传多样性研究与名贵药材优良品种的选育
遗传多样性是种内所有生物个体的全部基因和
染色体遗传变异的总和 [ 3] , AFLP分子标记技术在
中药研究中已经成为种质亲缘关系分析和检测种质
多样性的有效工具,可确定亲本之间的遗传差异和
亲缘关系,从而确定亲本间遗传距离,进而划分杂交
优势、提高杂种优势潜力。我国的天麻、人参等很多
名贵中药材的遗传育种基础研究非常薄弱, 许多重
要性状基因标记和定位还处于起步阶段,可供育种
工作者选择的标记未系统开展, 利用 AFLP分子标
记技术可进行各名贵药材的优良品种选育工作。谢
渊等 [ 4]于 2007年已利用 AFLP技术, 采用 D ICE系
数对 11个天麻标本进行遗传相似系数 Gs和遗传距
离计算,分析了天麻标本间遗传距离,研究结果表明
我国的天麻各品种遗传多样性十分丰富,可能与地
域、气候和繁殖方式有关,利用 AFLP技术可以更好
地进行优良品种天麻的选育。关萍等 [ 5 ]也以天麻
为试验材料, 对天麻 AFLP体系的建立及体系优化
做了一系列研究, 初步建立了适合于天麻 AFLP技
术的反应体系,为天麻的遗传多样性研究、分子图谱
的建立及分子鉴定等工作奠定了基础。
3. 2 中药种质资源鉴定
药用植物的种质资源是一切可用于药物开发的
植物遗传资源, 是所有药用植物物种资源的总和。
种质资源是基因的载体, 植物种内的所有个体及遗
传性状的基因构成了该物种的种质资源。种质的优
劣对中药的产量和质量具有决定性的作用, 而传统
的田间表型性状鉴定等手段对种质资源的筛选与鉴
定作用不大。AFLP技术的迅速发展, 在探明物种
遗传背景和亲缘关系基础上, 为中药材物种种质资
源的分析与评价提供了分子水平上的理论依据, 确
定了原植物、确保药效、合理保存利用现有种质、寻
找开发新的药用植物等研究工作的基础,在药用植
物种质资源研究中具有重要作用 [ 6 ]。
目前, AFLP在药用植物种质资源鉴定研究中
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2010年第 12期 肖硕 : AFLP分子标记技术在中药研究中的应用进展
的主要应用方面包括构建某一种属植物的 DNA指
纹图谱等。 2000年, 罗志勇等 [ 7 ]采用 AFLP技术分
析了人参、西洋参基因组 DNA多态性, 并成功构建
出多态性丰富和重复性好的人参、西洋参 DNA指纹
图谱,使 AFLP技术在人参、西洋参等药用植物的鉴
定方面有望成为一种相对独立的技术。 2008年,王
志安等 [ 8 ]通过采取及栽培中药材白术样品, 采用双
酶切和印染技术结合 AFLP分子标记技术,获得了
3 003条白术的多态性扩增条带,建立了中药白术种
质 AFLP指纹图谱的分析体系,将 10种白术种质分
为四种种质类型,为我国道地药材白术的种质保存
和育种提供了重要依据。 2006年,张瑞等 [ 9 ]通过对
影响重楼 AFLP银染技术体系的关键因素作对比研
究,建立了一套优化的重楼 AFLP分子标记体系并
对系列的试验关键因素进行了优化组合: 提取 DNA
最佳方法为从幼叶中用 CTAB法; 酶切时间为 9 h;
选择性扩增的最佳退火温度为 56! ; 从 15对引物
中筛选出 4对进行选择性扩增, 得到扩增条带 276
条,其中多态性带 20 l条 (占 72. 83% )。其他如石
斛属、绞股蓝、白术等药用植物都有应用 AFLP对其
种质资源进行分析的报道, 为今后进一步应用
AFLP进行种质资源鉴定研究提供了参考 [ 10 - 12]。
3. 3 中药材真伪及道地性鉴定
我国幅员辽阔,中药资源极其丰富,但由于各种
原因造成大量宝贵资源的破坏已使部分药用资源濒
临绝迹,某些不法人员惟利是图, 以假乱真, 从而导
致中药市场的混乱, 严重影响了药材的质量和药效
的稳定。再者,中药十分讲究道地性,道地药材是传
统公认来源于特定产区的名优正品药材, 道地药材
和非道地药材本身即在形态、生药性状及化学成分
等特征上具有高度相似性, 因而传统的鉴别方法对
道地药材的鉴别往往不易。因此, 加强中药资源的
调查、道地性及种质的鉴定研究和分类保护是当务
之急。用作中药鉴定与种质研究的方法有多种,包
括最初的形态学标记研究、细胞学标记技术即核型
分析和解剖学鉴定, 随后产生的生化大分子标记包
括同功酶和蛋白质指纹标记,也有通过化学成分进
行种质鉴定和分类,但以上各种途径,特别是分子标
记技术的快速发展和应用使中药种质从分子水平即
真正意义上的鉴定成为可能 [ 13]。然而, 这些方法的
鉴定标识有的建立在个体形态等直观水平上, 有的
操作烦琐,花费较多人力、物力, 所获结果都要受环
境条件影响或植物本身的限制, 不能直接反映物种
的遗传特性。而物种遗传因素、生长发育阶段不同,
药材的加工炮制手段日益发展, 它们都存在一定局
限性,利用新型的 AFLP技术则能从分子水平上提
高鉴定技术,对于保证中药质量、促进中药材标准化
与国际化有重要科学意义和应用价值。
常用中药材石斛市场的主流品种有 30多种,大多
数非药典收载品种。这些植物的茎段加工成药材后外
形相似,性状及显微鉴定等无法解决真伪,理化分析也
很难区分。虞泓等 [ 10]用 AFLP技术对石斛属内外 5个
种群组进行了基因组 DNA多态性分析,构建了药用石
斛的 DNA分子指纹图谱,对石斛属种的鉴定及彼此亲
缘关系的鉴定具有快速、准确、可信度高的特点。郝明
干等 [ 14]首次将扩增片段长度多态性技术应用到中药
材道地性的鉴别中,绘制不同产地中药材的 AFLP指纹
图谱和遗传多样性,确定道地性产区药材的特异性差
异带, 从而鉴别道地药材的真伪。在此基础上, 将
AFLP标记转换成简单实用的特征性片段扩增区域
( sequence characterized amplified reg ion, SCAR )标记。
将 SCAR标记片段进行胶回收, PCR或克隆测序,然后
根据序列特点设计特异性引物,通过简单的 PCR,即可
鉴别道地性产地中药材。在种质资源调查、鉴定研究
的基础上,建立中药材道地性评价体系,为最终从分子
生物学水平上建立中药材道地性的统一质量控制标
准,提供简便、快速、准确的鉴别技术。丹参是我国重
要的道地药材, 2007年,郝岗平等 [ 15]采用 AFLP技术对
山东产 15个丹参样本进行 DNA多态性分析,利用 4
对引物结合构建了 15个丹参样本的 DNA指纹图谱,
分析结果表明 AFLP技术可用于丹参道地性鉴别。
3. 4 活性成分基因表达与调控的研究。
生物体内的各种功能蛋白质和酶都是相应基因
编码、表达的产物, 研究中药材活性成分基因的差异
表达对其不同特性、调控机理及基因功能的研究都
具有重要意义。药用植物的生长周期受到基因的严
格调控,在不同生长期伴随着相应的此生代谢产物
的合成。AFLP技术与 cDNA等技术有机结合, 建
立药用植物在不同生长期转录、表达的指纹图谱,阐
明药用植物不同生长期的分子调控机制,可为现代
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分子生物学技术调控中药材的生长周期提供作用靶
点,从而达到筛选品质基因、改变此生代谢产物合成
量,提高药材品质的目的。张伟峰等 [ 16]用 cDNA
AFLP技术,从白菜低温要求型晚抽薹性的相关基
因序列研究,为我国道地药材当归的早薹的问题解
决提供了新的研究思路。红花是传统的活血化瘀中
药,红花中的查尔酮成分 ∀ ∀ ∀ 羟基黄色素 A是其主
要活性成分,其含量的高低, 直接影响红花品质的优
劣,因此,高羟基黄色素 A含量是筛选红花优良品种
的重要依据。在我国,红花的干燥管状花, 是传统的
活血化瘀中药,具有活血通经, 去瘀止痛之功效。由
于长期的自然选择和人工选择,红花种内产生了明显
的分化,形成了丰富的种质资源。不同红花品种从外
部的形态特征到内部的化学成分组成及含量上均呈
现出很大的差异,这为红花的品种选育提供了丰富的
遗传基础,也为进一步开发红花的利用价值提供了更
多的选择。单凭表型性状的差异进行选择已不能满
足红花育种工作的需要。张阵阵等 [ 17]采用分类策
略,以个体高、低羟基黄色素 A含量的极端值为依据,
构建了品质性状的两个近等基因池。采用 AFLP结
合 HPLC法对红花亲本及杂交 F2代植株的品质进行
综合分析,发现红花品质性状为主多效基因控制的数
量性状,从表达水平上探讨了与红花羟基红色素 A高
含量相关的基因片段, 初步得到 6条多态性标记, 为
红花新品种的高效选育及品质的定向调控提供了了
有效途径。de D iegoa等 [ 18]将 eDNAAFLP技术应用
于种子萌发相关的基因筛选研究中,研究方法同样可
以借鉴到药用植物有效成分相关基因的研究中。
4 讨论与展望
综上所述, AFLP技术已经逐渐成为中药材研究中
的重要工具与手段,不仅利用其对道地药材的经典性
能、种质资源等有重要意义,更利用新型的基因工程学
的新方法在分子水平上对中药材的分子结构、基因表
达与调控进行了研究, 在中药的研究工作中产生了划
时代的意义,具有广阔的应用前景。然而,其还是具有
一定的局限性。首先, AFLP产生的标记是显性的,因
此不能区分某一位点是杂合体还是纯合体,不能准确
估算种群遗传变异,对种群遗传机构的分析不能提供
更多的统计信息;其次,试验操作要求较高,比较复杂,
需要酶切、连接、预扩增和扩增等多个步骤。很多研究
者将其与其他技术结合使用,如与 cDNA技术结合,但
获得的有意义的扩增片段仍然不全面。随着新技术的
出现、以及技术间的相互结合使用,将会在更全面、方
便的在中药材研究中发挥更大的作用。
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