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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 5期
东北梅花鹿居群内亲缘关系的 AFLP指纹分析
蔡志华 1, 2 蒋德梅 3 陶红梅1 姜计4 温新福 4
( 1重庆师范大学生命科学学院,重庆 400047; 2重庆市动物生物学重点实验室,重庆 400047;
3西南大学生命科学学院,重庆 400715; 4重庆市永川松溉职业高级中学,重庆 402186 )


摘
要:
用扩增片段的长度多态性 ( am plified fragm ent leng th po lym orphism, AFLP )标记分析研究了东北梅花鹿同一居群
内 27个个体的亲缘关系,并以此作为优良种鹿选育种的辅助手段。筛选出 9对 AFLP引物组合, 用 E coR
/M se
双酶切,对
27只东北梅花鹿基因组 DNA进行 AFLP检测,共获得 15 169条扩增带,检测出多态性条带 11 443, 多态性比率 78
43% , 平均
每对引物检测到 1 271个多态性位点。群体内相似系数 AFLP研究结果, 平均为 0
7841( 0
6809- 0
8648), 27只鹿聚为
和

两大类群,
大类群分为 5组,说明该鹿群个体间有较丰富的遗传变异 ,且与人工定向选配种有关。

4组群体内相似系
数最高, 在 0
82以上,个体之间遗传距离最小在 0
1354- 0
1563之间, 与繁殖记录的亲缘关系基本一致。该研究表明 AFLP
指纹技术用于梅花鹿遗传多态性分析,品种鉴定及亲缘关系分析是可行的。
关键词:
东北梅花鹿 群体遗传结构 AFLP标记 亲缘关系鉴定
AFLP F ingerprinting Analysis on Genetic Relationship of
Northeastern Sika Deer (Cervus nippon hortulorum ) Population
Cai Zhihua
1, 2
JiangDeme i
3
TaoHongm ei1
J iang J i4 W en X infu4
(
1
College of L ife Science, Chongqing N ormal Univercity, Chongqing 400047;
2
TheK ey Laboratory of AnimalB iology of
Chongqing, Chongqing 400047;
3
College of Life Science, Southw est Univercity, Chongqing 400715;
4
Songji Vocational Senior School, Yongchuan, Chongq ing 402186)


Abstrac:t
The genetic relationsh ip of 27 d ifferentC ervus nipp on hortulorum in one population w as stud ied to prov ide theore tica l
ev idence for identifica tion and utilization. The genom icDNAs o f 27 d ifferentCervus nipp on hortulorum we re ana lyzed by am plified frag

m ent leng th po lym orph ism ( AFLP ). 11 443 bands assoc iated w ith genetic po lym o rph ism am ong tota l 15 169 bands w ere obta ined w ith
9 kinds o f pr ime r pairs and restr iction endonucleasesE coR
/M se
. Pe rcentage o f polym o rph ic band was 78
43% , 1 271 po lymo rph ic
locus w ere shown per prim er pa ir. The AFLP data show ed that average gene tic sim ilar ity o f this popu la tion w as 0
7841 ( 0
6809 -
0
8648). 27 sam ples w ere c lassified intoG roup
and G roup
w ith cluster ana lys is, and G roup
w as div ided into five subgroups. The
resu lt o fAFLP and c luster analysis concluded that therew as high genetic variation, w hich asso ciated w ith or ientated a rtific ia l breed se

lection and breed ing in the popu la tion. Genetic sam ilar ity o f G roup

4 w as the h ighest, mo re than 0
82, wh ile genetic d istance in this
g roup w as the shortest, from 0
1354 to 0
1563, wh ich w as coord inated w ith breed ing record. A ll these show ed thatAFLP techn iquew as
a feasib le and e ffectiv em ethod applied to the analysis o f g enetic po lymo rph ism, identifica tion o f spec ies and genetic re lationship.
Key words:
Northeaste rn sika deer
Gene tic struc ture of population AFLP m arke rs Genetic identification relationsh ip
收稿日期: 2010
01
25
基金项目:重庆市科委自然科学基金项目 ( C STC, 2006BB1260 )
作者简介:蔡志华,男,副教授,主要从事动物细胞遗传研究; E
m ai:l ca i
65321836@ 163. com
东北梅花鹿 ( C ervus n ippon hortulorum )隶属偶
蹄目, 鹿科, 鹿属。野生的东北梅花鹿主要分布于我
国东北吉林省一带,其他省、区饲养的东北梅花鹿也
多由该省引入。梅花鹿主要产物鹿茸, 有很高的药
用和保健价值,具广阔的国内外市场和经济效益,是
重要的畜牧业资源。随着分子生物学技术的发展,
利用现代生物分子标记技术分析探讨居群内亲缘关
系具有重要的理论意义和实践意义。
2010年第 5期




蔡志华等:东北梅花鹿居群内亲缘关系的 AFLP指纹分析
AFLP ( amp lified fragm ent leng th po lymorphism )
技术是 20世纪 90年代发展起来的一项 DNA指纹
技术 [ 1] , 原理上结合了 RFLP和 RAPD的优点。通
过对基因组 DNA的限制性酶切片段进行选择性扩
增而显示多态性的 AFLP技术, 不仅具备其它分子
标记技术的特点,还在一定程度上克服了其缺陷,是
继 RFLP、SSR、RAPD之后发展起来的建立于 PCR
之上的新一代 DNA指纹技术, 具有分析方法快速、
试验结果稳定可靠等优点,可用于连锁图谱的构建、
目的基因定位、品种鉴别、分类及系统发育研究等多
方面的遗传分析 [ 2- 6]。
目前还未见利用 AFLP技术对东北梅花鹿居群
内亲缘关系鉴定方面的报道。因此, 本试验将 AFLP
技术用于东北梅花鹿居群内基因组 DNA的遗传多
态性研究,并对该梅花鹿群体遗传结构进行分析,旨
在探讨 AFLP标记技术在梅花鹿遗传育种方面的应
用,为东北梅花鹿遗传结构、遗传关系研究以及种质
资源保护和产茸量标记辅助选择育种工作提供参考
依据。
1
材料与方法
1
1
材料
鹿血样 26头 (
24,
2)采自重庆永川区松溉
中等职业技术学校养殖场,该场种鹿 2003年分别引
自四川和东北两个不同居群的东北梅花鹿, 采取随
机抽样和部份定向交配样品, 样品占群体总数
10%; 1头采自重庆南川区茸鹿养殖场高产茸鹿
(
)。共 27头,编号为 C1- C27,其中 C3和 C4为
雌鹿, C6为重庆南川区茸鹿养殖场种茸鹿。松溉养
殖场采集了高产茸鹿及其子代和对照鹿 (随机 )。
耳静脉采血,每个样品各 5mL,柠檬酸钠抗凝。
1
2
基因组 DNA提取
试验采用广州市恺瑞生物科技有限公司提供的
AxyPreP
TM
B lood Genom in DNA M id iprep K it试剂盒
提取 DNA。方法参照试剂盒说明。
1
3
限制性酶切与连接
每个样品取 4
L基因组 DNA, E coR
和M se

进行双酶切,酶切片段与 EcoR
和M se
接头连接
E coR
/M se
序列见表 1。酶切和接头连接在同一
反应体系中同步进行。在 0
5 mL 离心管中加入
( 20
L体系 ): 4
L DNA模板; ( 50 ng /
L) 1
L接
头; 2
L EcoR
/M se
; 2
5
L 10
R eaction buff

er; 2
5
L 10 mmo l /L ATP; 1
L T 4连接酶; 7
L
AFLP
W ater。混匀离心数秒, 37
保温 5 h, 8
保温
4 h, 4
过夜。电泳检测。
1
4
预扩增
按照 F ish
AFLP试剂盒说明 (北京鼎国生物技
术有限公司 ), 使用含一个碱基的预扩增引物, 引物
序列见表 1。 25
L反应物体系含 2
L模板 DNA;
1
L Pre
ampm ix; 2
5
L 10
PCR buffer; 0
5
L
Taq DNA po lym ease; 0
5
L dNTPs; 18
5
L AFLP

water。离心数秒, 按下列参数进行 PCR扩增: 94

预变性 2m in, 94
30 s, 56
30 s, 72
80 s, 30个
循环; 72
延伸 5m in( GeneAmp PCR System 9600,
Perkim E lmer, USA )。反应结束后, 用 8%琼脂糖凝
胶 (含溴化乙锭 0
5
g /mL)电泳检测扩增产物 (图
1),再用 AFLP
TE将预扩增产物按 1
20稀释作为
选择性扩增模板备用。
图 1
预扩增产物电泳结果
1
5
选择性扩增
选择性扩增引物使用 3+ 3引物结合, 即 E coR

和 M se
选择性扩增均含 3个选择碱基, 引物序
列见表 1。 25
L反应体系中含: 2
5
L 10
PCR
buffer; 2
L预扩增稀释样品; 0
5
L dNTP; E coR I
引物和M se I引物各 1
L; Taq DNA聚合酶 0
5
L;
AFLP
W ater 17
5
L。按下列参数进行 PCR循环
(系用梯度 PCR法 ) : 94
预变性 2 m in; 第一轮扩
增参数: 94
30 s, 65
30 s, 72
80 s;以后每轮循
环退火温度递减 0
7
, 扩增 12轮; 接着按下列参
数扩增 23轮: 94
30 s, 55
30 s, 72
80 s; 延伸
加时 72
5 m in。将 1
L PCR产物、1
L内标、1

L变性液混合后, 95
2 m in,冰浴,准备上样。
1
6
凝胶电泳
扩增产物用 4% 变性聚丙烯酰胺胶 (厚度
0
4 mm)和 10
TBE电泳缓冲液电泳分离 (电压
167
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 5期
1 200 V, 2
5 h)。 选择性扩增产物检测采用 ABI
PR ISM 377 Sequener 进行 AFLP 多态性分析, 用
GENES CAN 3
1软件分析胶图和片段大小,根据内
标软件识别, 用 NTSYSpc2
11F 软件进行结果
分析 [ 7]。
1
7
数据处理与分析
结果记录的标准是在同一迁移率上, 有带记为

1
,无带记为
0
,转换为 0, 1矩阵, 遗传相似系数
( Genetin S im ilarity, Gs)按公式 G s= 2N ij (N i +N j )计
算 [ 8] ,式中N ij表示在 i和 j材料中共有的带, N i、N j
分别是材料 i、j的带数量。遗传相似系数 Gs值越
大, 遗传变异程度越小, 因此任意两个体间的遗传距
离 Gd可以根据两个体间的相似系数 Gs来计算, 即
Gd= 1- G s。根据遗传相似系数和遗传距离可以反
映个体间的亲缘关系和遗传变异的大小。数据统计
利用 NTSYSpc 2
11F软件分析对原始矩阵用 S im
Qua l程序求 DICE相似系数矩阵, 获得相似系数矩
阵 [ 9]。再用 SHAN程序中的 UPGMA ( unw e ighted
pair groupmethod using arithrnetic average)方法进行
聚类分析,并通过 T ree p lo t模块生成聚类图。
表 1
DNA接头和 AFLP引物序列
DNA接头及 AFLP引物 序列 ( 5
- 3
) 反应程序
EcoR I接头 Adapter 1: CTC GTA GAC TGC GTA CC
Adapter 2: AAT TGG TAC GCA GTC TAC
M se I接头 Adapter 1: GAC GAT GAG TCC TGA G
Adapter 2: TAC TCA GGA CTC AT
EcoR I引物
预扩增引物序列 GAC TGC GTA CCA ATT CA 预扩增
EcoR I
1 GAC TGC GTA CCA ATT CAA C 选择性扩增
EcoR I
2 GAC TGC GTA CCA ATT CAA G
EcoR I
3 GAC TGC GTA CCA ATT CAC A
EcoR I
4 GAC TGC GTA CCA ATT CAC T
EcoR I
5 GAC TGC GTA CCA ATT CAC C
EcoR I
6 GAC TGC GTA CCA ATT CAC G
EcoR I
7 GAC TGC GTA CCA ATT CAG C
EcoR I
8 GAC TGC GTA CCA ATT CAG G
M se I引物
选择性扩增引物序列 GAT GAG TCC TGA GTA A C 预扩增
FAM
labeledM se I
1 GAT GAG TCC TGA GTA ACA A 选择性扩增
FAM
labeledM se I
2 GAT GAG TCC TGA GTA ACA C
FAM
labeledM se I
3 GAT GAG TCC TGA GTA ACA G
FAM
labeledM se I
4 GAT GAG TCC TGA GTA ACA T
FAM
labeledM se I
5 GAT GAG TCC TGA GTA ACT A
FAM
labeledM se I
6 GAT GAG TCC TGA GTA ACT C
FAM
labeledM se I
7 GAT GAG TCC TGA GTA ACT G
FAM
labeledM se I
8 GAT GAG TCC TGA GTA ACT T
2
结果
2
1
AFLP的分析结果
在 64对 E+ 3 /M + 3的选择性扩增引物中筛选
出 9对 AFLP选择性扩增引物 (表 2) , 均扩增出了
清晰的条带 (图 2) , 片段大小在 70 - 750 bp, 符合
AFLP分析对酶切片段大小的要求, 数量合适, 分布
均匀,证明该组引物适于梅花鹿的 AFLP的分析。
每对引物组合扩增带的数目 1 543- 1 798条之间不
168
2010年第 5期




蔡志华等:东北梅花鹿居群内亲缘关系的 AFLP指纹分析
等。采用 9对 AFLP引物组合扩增共得到 1 5169条
扩增带, 检测出多态性条带 11 443, 多态性比率
75
43%。其中引物组合 9 - 1 ( AGC /CAA )、3 - 6
(AAC /CTC)、6 - 8 ( ACT /CTT )多态率分别达到
87
87%、85
34%、84
67%, 表明该鹿群个体间多态
性较为丰富。所用引物组合及统计结果见表 2。
2
2
群体内个体间的亲缘关系分析结果
从 9对 AFLP选择性扩增引物扩增结果来看,
27只梅花鹿基因组 DNA 片段的相似系数位于
0
6809- 0
8648之间,平均为 0
7841(表 3)。样品
C6来自另一茸鹿养殖场 (重庆南川区茸鹿养殖场 )
的高产茸鹿, 与本鹿群 (重庆永川区松溉中等职业
技术学校养殖场茸鹿养殖场 )的 26只鹿相比,其相
表 2 九种选择性引物组合对共试材料的扩增结果
引物编号 扩增带幅度
扩增总
带数
多态性
带数 多态率 (% )
3- 6 AAC /CTC 79- 48 1 703 1 460 85
73
5- 3 CAC /CAG 83- 50 1 670 1 238 74
13
6- 3 CAT /CAG 90- 49 1 653 1 221 73
87
6- 5 ACT /CTA 69- 44 1 543 949 61
50
6- 6ACT /CTC 79- 56 1 793 1 280 71
39
6- 8 ACT /CTT 105- 41 1 585 1 342 84
67
8- 2 ACG /CAC 112- 48 1 644 1 212 73
72
9- 1AGC /CAA 94- 49 1 780 1 564 87
87
10- 8 AGG /CTT 75- 54 1 798 1 177 65
46
合计 786- 439 15 169 11 443 75
43
平均 87- 49 1 685 1 271
图 2
引物对 E+ AAC /M + CTC扩增结果
图 3 AFLP分析的 27份东北梅花鹿样品的聚类图
169
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 5期170
2010年第 5期




蔡志华等:东北梅花鹿居群内亲缘关系的 AFLP指纹分析
似系数与 C2之间是 0
7172, 最高与 C3之间是
0
7428,最低与 C4之间 0
6809。群体内相似系数最高
的是 C22与 C20之间, 达到 0
8648, C22与 C27是
0
8613, C20与 C27是 0
8471。根据繁殖记录, C22、C20
与 C27之间是父与子的关系, C20与 C22是同父异母
的兄弟关系。其次, C24与 C25之间相似系数是
0
8428, C24与 C27是 0
8243, C25与 C27是 0
8481,这
三者也同样是父与子的关系。根据 27只鹿间的相似
系数,得到相互间的遗传距离。在 27只个体中,彼此
间的遗传距离最大为 0
3191,最小为 0
1354(表 3)。
2
3
群体内单个样品 AFLP聚类分析
使用 NTSYSpc2
11F分析软件对所获数据进行
分析, 利用 UPGMA方法进行聚类分析, 通过 Tree
plot模块得到 AFLP指纹图谱的分析树状图 (图 3)。
绘制的聚类图表明, 不同梅花鹿个体之间相似系数
为 0
71- 0
86之间。在相似系数 0
71水平可将 27
个检测样品分为两大类群。
类包括 C6,相似系数
0
71,来自重庆南川区茸鹿养殖场种茸鹿, 为对照高
产茸鹿,与
类群的亲缘关系较远。
类包括重庆
永川松溉茸鹿养殖场的 26个样, C1- C5, C7- C27,
该类群在 0
74水平上可分为 5组;

1包括 C4、
C14,二者在 0
74处相聚,表明 C4与 C14两者亲缘
关系最近,根据繁殖记录 C4为 C14的母本;

2包
括 C1、C5、C9、C11, C9与 C11在 0
82处相聚, 表明
C9与 C11亲缘关系最近, 而 C1、C5分化程度相对
较高, 不能聚在一起。

3类包括 C2、C3、C13、
C21、C23、C17、C15、C19、C7。在 0
78处 C2与 C3
相聚, 而 C3为母鹿, 二者极可能是姊妹关系 (随机
样本 )。 C15与 C19相聚后, 再与 C7聚在一起。


4类: C8、C18、C10、C16、C20、C22、C27、C24、C25、
C26。C8与 C18相聚后与 C10聚在一起, C20与 C22
相聚后再与 C27聚在一起, 然后再与 C16相聚; C24
与 C25相聚后再与 C26聚在一起。该类群中个体相
似系数都较高, 在 0
82以上。表明它们之间的亲缘
关系很近,基因纯化程度较高。

5包括 C12, 由于它
与其它所有个体无法相聚, 且聚类树枝长度较大, 表
明 C12的分化程度较高,因此单独归为一组。
3
讨论
3
1
AFLP方法分析梅花鹿遗传关系的有效性
AFLP是近来出现的一项较新的分子标记技
术, 它具备高效率多态检出率引物通用性及重复性
好等特点,被广泛应用于分子遗传标记图谱构建,目
的基因定位, 品种鉴别及系统发育研究 [ 10, 11]等方
面。本研究采用 AFLP荧光内标分析技术对东北梅
花鹿养殖群体进行遗传多态性分析。由于 FISH

AFLP标记分析方法与传统方法相比较, 该法分辨
率高,带纹清晰,多态性强且无污染, 因而本试验更
加快捷、方便。在 8对 64个组合中筛选了 9种组
合,均表现出不同程度的遗传多态性。平均每对引
物扩增条带数 1 685,检测到 1 271个多态性位点,
多态率 75
44%。单个样品最多扩增条带数 112
条, 最少扩增条带数 41条。而其中 3对引物组合
(引物 6 - 8、3 - 6、9 - 1)标记多态率在 84
67%、
85
34%、87
87% (表 2)。这不仅表明该鹿群内个
体间具较高多态检出率, 同时说明 AFLP标记技术
完全适用于种群内个体遗传多样性的分析。
3
2
居群内个体间的亲缘关系
本研究采用对 AFLP标记技术对东北梅花鹿种
群内的亲缘关系进行了初步分析, 试验结果表明,
AFLP标记在东北梅花鹿中与植物一样也能产生丰
富的多态性 [ 12- 15] ; 适宜于梅花鹿的遗传检测, 尤其
事宜对高度近亲繁殖的基因型和种群家系多样性的
分析。AFLP 标记技术亦可作为个体特异性标
记 [ 16]。这种高效的遗传标记技术, 必将对其遗传检
测起到积极的作用。
研究表明, DNA指纹相似系数是衡量个体间遗
传变异程度的可靠参数。G s值越大,个体间的血缘
关系越近,遗传变异性越小。本研究中东北梅花鹿
的 DNA指纹相似系数为 0
6809 - 0
8646, 平均为
0
7841, 2001年吴丰春等对贵州小香猪基因组 DNA
的 AFLP检测中得出的遗传相似系数为 0
769 -
0
967之间,平均为 0
866[ 17]。 2001年王志勇等 [ 18]
对中国沿海真鲷群体的遗传变异研究得出的遗传相
似系数为 0
8200 - 0
8425。仅从相似系数这一数
值比较看,东北梅花鹿的 AFLP研究结果相似系数
偏低,这与样本 C6源于另一养殖场亲缘关系较远,
从而使平均遗传相似系数偏低 (表 3) ,同时, 这也表
明 AFLP适合于群体内的遗传相似性分析。
本研究的样本主要采自重庆永川区松溉同一养
殖群体,除部分样品为定向交配个体外,其余为随机
171
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 5期
样品。最初,该养殖群体在 2003年引自四川、东北
两个不同居群,后经几年的人工定向配种、繁育、选
择,从而分化为 5个组群。

4组群体内的相似系
数比

1、

2、

3组高,个体相似系数在 0
82以
上,尤其该组群中 C16、C20、C22、C24、C25、C26、C27
个体之间遗传距离最小, 在 0
1354 - 0
1563之间
(表 3) ,这与繁殖记录的亲缘关系基本一致。且茸
产量也相对较高, 平均产茸 1
743 kg /只,血缘关系
也较近。
综上所述, 本研究应用筛选出的 9对 AFLP引
物组合,对同一梅花鹿居群个体的遗传检测表明,具
有较好遗传多态性,从

1、

5两组群可见个体之
间有较大的遗传变异和分化程度。仅比较每对引物
组合扩增出的带数及多态性条带来看, F ish
AFLP
标记不仅具备高效多态检出率,且条带分辨率高,带
纹清晰,完全适合于种群内个体遗传多样性分析。
尤其对近交程度较高, 遗传背景差异较小的同一种
群内的梅花鹿,这种高效的分子标记技术,作为优良
茸鹿选育的辅助手段是可行的。
参 考 文 献
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