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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
基于 DIG －化学发光法的 Southern blot方法优化
张晓1，2 张锐1 于源华2 史计1 孟志刚1 孙国清1 周焘1 郭三堆1
(1中国农业科学院生物技术研究所 国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程，北京 100081;
2长春理工大学生命科学技术学院，长春 130022)
摘 要: 目前，基于 DIG-化学发光法的 Southern blot 技术已在生物实验室广泛应用，但在试验过程中经常会遇到背景
黑、目的信号弱等问题，以致不能获得理想结果。在棉花线粒体基因组 RFLP 分析过程中结合前人经验对基于 DIG-化学发光
法的 Southern blot技术在探针标记、探针浓度、探针剥离等方面进行了优化。优化后的方法重复性好，一张转好的尼龙膜最多
可以反复使用 11 次;一份杂交液在两年内至少可以反复使用 5 次且不会明显降低杂交效果。
关键词: Southern blot DIG标记 化学发光法 尼龙膜 探针
Optimization of Southern Blot Analysis Based on
DIG-Chemiluminescent Detection
Zhang Xiao1，2 Zhang Rui1 Yu Yuanhua2 Shi Ji1 Meng Zhigang1 Sun Guoqing1 Zhou Tao1 Guo Sandui1
(1Biotechnology Research Institute，National Key Facility of Crop Gene Resources and Genetic Improvement，Chinese Academy of
Agricultural Sciences，Beijing 100081;2College of Life Science，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022)
Abstract: Southern blot technology based on the DIG-chemiluminescent detection has been widely used in Biology laboratory，but
various troubles were appeared in the experiment，such as high background and low sensitivity which can cause obtain ideal results． Ac-
cording to the RFLP analysis of cotton mtDNA and combined with others’experience，we optimized the Southern blot method based on
the DIG-chemiluminescent detection． We focused on labeling of probe，concentration of probe，stripping and reprobing of DNA blots．
With the optimized method，a nylon membrane can be used for 11 times，and a piece of hybridization solution can be used for 5 times
within two years without decreasing performance obviously．
Key words: Southern blot hybridization DIG labeling Chemiluminescence Nylon membrane Probe
收稿日期:2011-02-22
基金项目:国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2008ZX08005-004)
作者简介:张晓，男，博士研究生，研究方向:植物基因工程;E-mail:enerrgy@ 126． com
通讯作者:郭三堆，男，研究员，研究方向:棉花基因工程研究;E-mail:gsdui@ mail． caas． net． cn
Southern blot方法是分子生物学中的一项基本
技术，它在检测目的基因拷贝数、鉴定转基因植株、
开发分子标记、筛选 DNA 文库中具有重要的作用，
但该技术步骤较繁琐，要想得到理想的结果，往往费
时费力。传统 Southern blot分析的探针通常是用32P
或35S标记。近年来，生物素、DIG 等非放射性标记
物越来越多地用来标记核酸探针，克服了放射性同
位素标记技术的固有缺点，并且能够得到可以与放
射性标记相媲美的结果［1］。由于非放射标记法所
需的步骤更多，因此要得到理想的结果就需要注意
更多的细节。本研究结合具体试验，从探针浓度、样
品处理、洗膜方法、探针标记及曝光时间等多个方面
对试验方法进行了改进，得到了结果理想、重复性好
的一套方法。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 植物材料 棉花细胞质雄性不育系 P30A、
P53A、P80A、S25-4A、96-48A、AP25MA、1081A、
CMS-D8;保持系 P30B、P53B、P80B、S25-4B、96-
48B、AP25MB、1081B;恢复系 Y18。
1． 1． 2 基因探针 Southern blot 所用探针及引物如
表 1 所示，引物由上海生工合成。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
表 1 探针名称及引物序列
探针 引物 引物序列(5→3) Tm(℃)
产物大
小(bp)
cb Forward GCATTTGATAGATTATCCAAC 55 1 061
Reverse GAATGGGCGTTATGGCAAAG 60
n9 Forward CATGGGAATAGATCTGATACC 59 463
Reverse CAAAATCGAAATAGCGAAATTC 55
a1 Forward ATTTTCAAGTGGATGAGATCGG 59 1 304
Reverse GATCACAGAATCCATTGACAGC 61
a6 Forward TATTTCTCATTCACAAATC 49 687
Reverse AGCATCATTCAAGTAAATACAG 55
a9 Forward ATGTTAGAAGGTGCAAAATCA 55 221
Reverse AAAACGAATGAGATCAGAAAG 55
c1 Forward CCACAAGGATATAGGGACTC 60 1 393
Reverse GATTGTTACGACCACGAAGAAAC 61
c2 Forward GATGCAGCGGAACCATGGC 64 625
Reverse CTGCACTGACCATAGTAAACTC 61
c3 Forward ATGATTGAATCTCAGAGGCAC 59 791
Reverse ACCACCCCACCAATAGATAGA 61
n6 Forward TTCTGTTTTGTCGAGCCTTGCTTTG 60 559
Reverse AGCATTTCGTCGGAATACATC 56
s5 Forward TGTCCGTCGTTCCGCTTTTTTCG 62 470
Reverse CTATGGAGGTTGCTGCTGATGC 62
n5 Forward TCACCACCCGTTGTGCGGAGCC 64 333
Reverse GTATGTACGCAGGGAGAGTTTC 64
1． 1． 3 试剂与仪器 DIG high prime labeling and
detection starter kit II 购自 Roche 公司。EcoR I，Hind
III限制性内切酶购自 Promega 公司。Taq DNA 聚
合酶购自天根生物公司。琼脂糖购自西班牙。其它
化学试剂购自北京拜尔迪生物技术公司，均为分析
纯。尼龙膜 Hybond-N + 购自 Amersham 公司;凝胶
回收试剂盒购自 Axygene公司。DNA ladder 0331 购
自 Fermentas公司。紫外交联仪为 CL-1000 Ultravio-
let Crosslinker(美国 UVP 公司)。紫外分光光度计
为 ND-1000(美国 NanoDrop公司)。
1． 2 方法
1． 2． 1 棉花基因组 DNA提取 改良的 CTAB 法［2］
提取棉花嫩叶。液氮研磨时要做到快速充分，苯酚:
氯仿抽提时要多抽提几次，尽量使有机相和水相之
间无白色物质。
1． 2． 2 基因组的酶切 电泳检测提取的基因组
DNA，确保没有明显的蛋白、RNA 残留后，用紫外分
光光度计进行定量。每个样品取 40 μg 进行酶切，
酶切体系为 400 μL，其中包含 40 μL 10 × buffer，300
U 的限制性内切酶，4 μL 的 100 × BSA。酶切时，先
将基因组 DNA、ddH2O、10 × buffer 加好，反复混匀，
然后再加入 BSA 和内切酶，再充分混匀［3］。然后
37℃反应 6 － 8 h。期间每隔 2 h弹动混匀一次。反
应结束后，取 5 μL进行电泳检测，一是看酶切是否
完全，二是看各样品间亮度是否一致，若某个样品亮
度明显弱，则应再补切适量的基因组 DNA。若酶切
完全且各样品间 DNA量一致，则用 0． 8 倍体积异丙
醇和 0． 1 倍体积 3 mol /L NaAc沉淀酶切产物，然后
用 75%乙醇涮洗 1次，晾干后加入 30 －40 μL ddH2O
重溶，准备上样。
1． 2． 3 电泳 使用大孔梳齿和大胶板配胶，梳孔容
量要达到 40 μL以上;缓冲液为 1 × TAE，琼脂糖浓
度为 0． 8%;电泳条件为 35 V，16 h，即通常要跑足
500 Vh。
1． 2． 4 转膜 电泳结束后，用 0． 25 mol /L HCl 溶
液浸泡凝胶 15 min 后，用碱变性液(1． 5 mol /L
NaCl，0. 5 mol /L NaOH)处理 1 h。然后使用 Bio-
Rad 公司的 785 型真空转印仪进行转膜。转膜条
件:5 inch Hg，75 min。10 × SSC 转膜，转完后，用 2
× SSC涮洗尼龙膜 2 － 3 次。
1． 2． 5 紫外交联 将尼龙膜放到紫外交联仪中交
联 1 min，照射剂量大约为 0． 1 J /cm2。
1． 2． 6 预杂交 交联结束后，直接将尼龙膜放入杂
交管中，加入预杂交液，在杂交炉中慢速转动 1 h。
1． 2． 7 探针的制备与处理 做 4 管 50 μL 的 PCR
反应体系来扩增目的基因片段，凝胶回收后用紫外
分光光度计进行定量，取 1 μg DNA 按照试剂盒中
的要求进行标记，标记条件为 37℃，20 h，期间弹动
混匀数次。同时，将 DNA Marker也进行标记。标记
结束后，沸水浴处理 10 min，－ 20℃冻存备用。使用
时，将目的基因探针和 Marker 探针同时加到预杂交
液中，探针总浓度为 25 ng /mL，其中 Marker 探针占
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2011 年第 9 期 张晓等:基于 DIG －化学发光法的 Southern blot方法优化
1 /6(如果不需要指示条带的精确大小，Marker 探针
也可以不加)。将杂交液用 0． 22 μmol /L 或 0． 45
μmol /L 滤膜进行过滤后，便可用来杂交尼龙膜。
1． 2． 8 杂交 杂交时间为 20 － 36 h，杂交液体积为
3． 5 mL /100 cm2尼龙膜。探针浓度 25 ng /mL。即:
配置 3． 5 mL 杂交液，则所需的探针量为［(25 ×
3． 5)/2 300］× 20 = 0． 76 μL。
1． 2． 9 洗膜 2 × SSC /0． 1% SDS，室温，5 min，洗
两次。0． 5 × SSC /0． 1% SDS，66℃，每次 45 min －
2 h，洗两次。
1． 2． 10 封闭 100 mL blocking buffer，室温，1 h。
抗体:1 ∶ 12 500，1． 6 μL antibody，20 mL blocking
buffer。
1． 2． 11 洗涤 washing buffer(blocking buffer，
0. 3% Tween 20)洗 2 h后过夜。
1． 2． 12 加反应底物 洗涤完成后，将膜浸到 de-
tection buffer中充分浸透，然后尼龙膜放到保鲜膜
上，迅速均匀滴加上 CSPD，然后用尼龙膜覆盖保鲜
膜。置于 37℃培养箱中孵育 15 min。
1． 2． 13 压片 根据尼龙膜上信号强弱，将 X 光胶
片曝光 15 min － 2． 5 h。
1． 2． 14 X 光胶片的冲洗 显影 3 min;定影 45 s，
然后用清水反复冲洗。
1． 2． 15 探针剥离方法 用尼龙膜完成对一个基因
探针的检测后，及时将之置于无菌水中浸泡 5 min，
然后放入杂交管中，加入适量 0． 2 mol /L NaOH /
0. 1% SDS 溶液，37℃，慢速转动，洗两次，每次 15
min;用足量 2 × SSC 浸泡两次，然后用保鲜膜包裹，
置 4℃冰箱中保存。
2 结果
2． 1 探针效率检测
探针效率直接决定 Southern blot 的试验结果，
所以首先要确保探针具有足够的活性。为获得活性
足够高的探针，着重注意以下方面。首先是探针模
板的量，用 PCR 法扩增获得足够的探针模板，从中
取 1 μg 进行标记。其次是标记时间，为便于后续试
验杂交液中探针浓度的确定，我们将标记反应时间
定为 20 h。通过固定起始模板量和标记时间这两个
参数，在对 a6、c1、n6 等不同基因探针进行标记后，
获得了产量较一致的探针(图 1)。这为试验结果的
重复性打下基础。
图片上方的数字表示探针溶液梯度稀释后的浓度(pg /
μL) ;control为试剂盒中所带的 DIG标记的对照探针
图 1 探针效率检测
2． 2 最适探针浓度的确定方法
为获得清晰的 Southern blot 杂交图片，合适的
探针浓度至关重要。试剂盒中的推荐浓度是 25 ng /
mL，但是开始做出来的片子背景值很高，出现这个
问题主要因为探针浓度不准确，不知如何获得 25
ng /mL的探针浓度，在试剂盒说明书上，并没有给出
确切的定量方法。为获得合适的浓度，对标记模板
和标记时间这两个指标进行了定量，即:标记反应的
模板用紫外分光光度计进行精确定量后，从中取 1
μg进行标记，标记时间定为 20 h。这样就认为 20
μL标记反应液中的探针产量为 2 300 ng。根据这
个数值以及所需的杂交液体积，来确定标记反应液
的量。例如，如果需要 N mL杂交液，则标记产物为
{［(25 × N)/2 300］× 20}μL。为验证这个定量方
法是否可行，根据这个公式确定了 28 ng /mL 和 25
ng /mL这两个浓度，按照 6 mL 的杂交液用量，分别
取了［(28 × 6)/2 300］× 20 = 1. 46 μL 和［(25 ×
6)/2 300］× 20 = 1． 3 μL探针进行杂交反应。
电泳时，只对分子量Marker、阳性对照进行了上
样，制备两块相同的胶和相同的上样量，然后进行转
膜杂交。结果(图 2)表明，28 ng /mL 的浓度明显偏
高，X光胶片曝光后，背景高、有较多的黑点和黑团;
而 25 ng /mL这个浓度则比较合适，信号明显，背景
清亮，说明按照之前定量的方法可以比较精确地获
得合适的(25 ng /mL)探针浓度。用该合适探针浓
度的杂交液对正式酶切的样品进行检测，通常都能
得到理想的结果。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
M． DNA 分子量 Marker;1． 质粒 pBI4ABC;
2． pBI4ABC EcoR I 单酶切回收的大片段;
图片下方的数字代表探针浓度
图 2 探针浓度对结果的影响
2． 3 同一张尼龙膜的反复使用
转好一张尼龙膜费时费力，所以尼龙膜的再生
具有意义。本研究在对棉花线粒体基因组进行
RFLP分析时，需要对同一组样品进行多个基因探针
的 Southern blot检测，因此尝试了对探针进行剥离
和对尼龙膜进行反复使用。剥离探针时，要着重
注意两个方面:一是如何剥离干净;二是如何少损
失膜上的 DNA。为剥离干净，需要在杂交和检测
过程中始终保持尼龙膜的湿润;用 NaOH /SDS 溶
液处理尼龙膜时，要保证溶液与尼龙膜正面充分
接触，推荐使用杂交管和杂交炉来剥离探针。为
减少膜上 DNA 的损失，需要调低杂交管的转速、
缩短剥离时间。
结果(图 3)显示，对尼龙膜进行 10 次探针剥离
处理，即可以对同一张膜进行 11 次的反复使用，并
且这 11 次的杂交结果都较为理想，完全可以达到探
索杂交条带多态性的要求。例如，本研究依次使用
了 c2、s5、a1、n5、a6、n6、n9、cb、c1、c3 和 a9 进行了
Southern blot试验，发现 s5、a1、n5 和 n6 基因在棉花
不同品系之间显示出明显多态性。
M． DNA分子量标记;S． CMS系 P30A;N．保持系 P30B;R．恢复系 Y18R
图 3 同一张尼龙膜反复进行 11 次杂交分析
2． 4 同一份杂交液的反复使用
要获得一份探针浓度合适的杂交液往往需要进
行摸索，而摸索工作比较费时。如果能将一份摸索
好的杂交液反复使用来检测不同的样品，不仅可以
省去重新摸索条件的步骤，避免浪费，而且更容易获
得重复性好的结果。本研究在对不同的棉花品种进
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行 Southern blot分析时，使用了同一份 a1 基因的杂
交液。该杂交液 － 20℃冻存，每次使用之前 65℃水
浴化开即可，两年内反复使用了 5 次，每次都获得了
较理想的结果(图 4)。当杂交信号减弱，背景升高
时，要停止杂交液的反复使用。
S． P30A;S1． P53A;S2． P80A;S3． S25-4A;S4． 96-48A;S5．
AP25MA;S6． 1081A;S7． CMS-D8;N． P30B;N1. P53B;N2．
P80B;N3． S25-4B;N4． 96-48B;N5． AP25MB;N6． 1081B;
R． Y18;1 －5代表杂交液的使用次数
图 4 同一份杂交液反复使用 5 次后的杂交效果
3 讨论
将基于 DIG化学发光法 Southern blot试验中的
注意事项根据重要性不同进行如下排序:
探针浓度。25 ng /mL 的浓度非常重要。DIG
化学发光法的 Southern blot试验最常见的问题是试
验初期，片子背景高，其主要的原因就是探针浓度
过高。如果控制好标记反应的模板量 1 μg 和标记
时间 20 h这两个条件，在 20 μL 反应体系中，最后
的探针产量大概都可以达到 2 300 ng。根据这个估
测的产量，如果杂交液体积是 N mL，那么所需的探
针量就是{［(25 × N)/2 300］× 20}μL。如果想要
得到较理想的杂交结果，则需要对杂交液进行预试
验，即配一块胶，只加 Marker 和阳性对照，快速电泳
后，进行转膜杂交。如果最后得到的片子背景清亮，
信号清晰，则杂交液可以用来进行正式试验。如果背
景较重，则需要往杂交液中添加适量的预杂交液来稀
释探针浓度。如果检测不到目的信号，则需要从探针
标记效率、DNA 样品酶切量、转膜是否充分、地高辛
试剂盒是否过期、溶液配置是否正确等方面来查找问
题所在。这些步骤虽然耗时，但很有必要。
基因组 DNA的酶切处理。DNA提取结束后，先
进行电泳以确保无明显的蛋白和 RNA 残留，然后用
紫外分光光度计定量，根据定量结果确定加入 DNA
样品的量。如果所检测物种的基因组较大，则需要增
加酶切 DNA的量。例如，拟南芥基因组较小，酶切 5
μg基因组即可得到较浓重的信号条带;而棉花的基
因组较大，要想得到同等强度的信号，基因组的酶切
量通常需要 30 μg以上。酶切结束后，从酶切反应液
中取出少量进行电泳检测，确保酶切充分、样品间亮度
一致后，再进行下一步试验。有研究认为，酶切后的样
品需要酚仿抽提，但本研究认为这一步不是必需的。
杂交时间和杂交液体积。杂交时间说明书要求
4 h后过夜，但我们认为杂交时间不要低于 18 h，本
研究所用的杂交时间是在 18 － 30 h。杂交液的用量
说明书要求 3． 5 mL /100 cm2膜，本试验中需要对杂
交液反复使用，所以将杂交液体积增加到 6 － 8 mL /
100 cm2膜。提高杂交时间和杂交液体积都可以增
强杂交效果，只要保证探针浓度不变，杂交液体积的
增加不会提高片子背景。按照经验，杂交液反复回
收使用 5 次，不会明显影响杂交效果。
洗涤时间。洗涤步骤分两步:一是杂交结束后
用 SSC /SDS 溶液洗涤:二是加抗体后用马来酸 /
Tween20 溶液洗涤。这两步的时间都可以延长，特
别是马来酸 /Tween20 洗涤步骤。地高辛与抗体的
结合力是比较牢固的，我们曾将尼龙膜用马来酸 /
Tween20溶液在 55℃高温洗涤了 2 h，但最后得到的杂
交信号仍然比较强。通常将膜放在杂交管里或大培养
皿里用马来酸/Tween20溶液室温洗涤一整夜，这样不
仅可以得到重复性较好的结果，而且使试验时间的安
排更有弹性。
尼龙膜的封闭。Blocking buffer 要足量，封闭时
间要延长，这有助于降低背景。封闭液的用量可以
在说明书要求的基础上稍微多加，例如 80 cm2尼龙
膜，封闭液可以使用 100 cm2膜的用量为 100 mL，并
且封闭时间不短于 2 h。
标记探针时注意事项。探针标记效果直接影响
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信号强度。本研究所用探针模板的长度为 200 －
1 300 bp，探针模板太短会降低杂交信号。探针模
板一般用 PCR 法制备，200 μL(50 μL /管 × 4 管)
PCR反应液，经凝胶回收用 30 μL 洗脱，可以保证
100 ng /μL 以上的浓度，取 10 μL即可达到 1 μg，这
样在 20 μL标记反应液里，可以最少留出(16 － 10 =
6)μL的体积给 ddH2 O，以稀释探针模板中的标记
反应抑制物或干扰物(如凝胶纯化过程中残留的凝
胶颗粒)。标记时，标记反应液(试剂盒中的 1#管)
每次用完后要及时放回 － 20℃冻存，防止其中的
Klenow 酶失活，因为 Klenow 酶的活性是确保标记
效率的关键因素。探针标记反应之前和之后都需要
煮沸，每次煮沸时管中的 DNA溶液都会蒸发到管盖
内壁，所以每次煮沸结束后，都要快速离心一下，再
放到冰浴中。为充分防止 DNA 复性，采用乙醇 /冰
浴(－ 5℃)。按照经验，标记好的探针在 － 20℃放
置两年不会明显降低杂交效果。
胶片曝光(压片)时间。试剂盒中要求压片 15 －
30 min，但本研究在用 40 μg 棉花总 DNA 做 South-
ern blot时，平均的压片时间是 2 h。CSPD发光底物
经碱性磷酸酶催化后，可以持续发光 24 h 以上，在
这期间可以进行多次摸索，以获得最佳曝光效果。
我们发现加上 CSPD 后，发光强度在一定时间内是
逐渐提高的。例如，第 11 － 13 h 之间的发光强度高
于第 1 － 3 h之间，但背景值也相应升高。冲洗胶片
时，显影 3 min，定影 30 s即可。红光灯很容易漏光
导致胶片背景灰暗，所以可以不用红光灯，事先开灯
熟悉一下每种容器的位置，然后关灯洗片。
抗体处理。抗体在使用前，要预先 10 000 r /
min，4℃，离心 5 min。该步骤可降低片子背景中的
黑点颗粒。试剂盒中推荐的抗体浓度是 1∶ 10 000，
降低抗体浓度可减轻背景值，所以选用 1 ∶ 12 500。
即取 1． 6 μL抗体加到 20 mL Blocking buffer中。
电泳方法。推荐低电压，长时间电泳，本研究采
用 35 V，16 h，即要跑足 500 Vh。由于长时间电泳
对电泳缓冲液中离子浓度消耗较大，所以可以适当
提高电泳缓冲液浓度，例如可以将 1 × TAE 提高到
1． 05 × TAE;同时电泳缓冲液要尽量适量。电泳一
般在晚间进行，以提高时间安排的弹性。电泳结束
后，将膜用 2 × SSC 涮洗 2 － 3 次，以去除黏附在膜上
的凝胶颗粒，从而避免杂交过程中凝胶颗粒非特异
结合抗体，产生大黑点。
交联方法。研究发现，UV 交联法要好于干烘
法(120℃，30 min;或 80℃，120 min) ，使用 30 W 的
紫外灯管，与尼龙膜相距 40 cm，照射 1 min［4］。
CSPD 的使用方法。将膜在 detection buffer 中
浸透放到保鲜膜上后，要马上往膜上滴加 CSPD，防
止膜变干燥，导致背景高(呈现圆形灰斑)［5］。
探针的剥离。尼龙膜每次使用完以后，要尽快
剥离探针，然后湿润保存。剥离探针的方法是将膜
放在杂交管里，0． 2 mol /L NaOH /0． 1% SDS，37℃，
15 min，洗两次，然后用 2 × SSC 浸泡后备用。增加
尼龙膜的使用次数可显著降低试验成本，如果一张
膜可以反复使用 10 次，则每个基因的 Southern blot
检测成本可下降 70%［6］。
依照经验，一张转好的尼龙膜可反复使用 11
次;一份配好的杂交液可反复使用 5 次以上。也就
是说，一张尼龙膜可以检测 11 个基因探针;一份杂
交液在两年内可检测 50 样次。由于省去了重新转
膜所需的 DNA 提取、酶切、电泳、转膜，以及重新摸
索探针浓度所需的预试验等繁琐步骤，尼龙膜和杂
交液的反复使用可明显加快试验进度。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫)
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