全 文 ：园艺学报，2016，43 (6)：1186–1194.
Acta Horticulturae Sinica
1186 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0081；http：//www. ahs. ac. cn
收稿日期：2016–03–25；修回日期：2016–06–03
基金项目：国家自然科学基金项目（31272150）；国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-27）；国家科技支撑计划项目
（2012BAD19B06）；重庆市基础与前沿研究计划项目（cstc2015jcyjA80042）；中央高校基本科研业务费专项（XDJK2014C129）；中央高校
基本科研业务费专项（XDJK2014A018）；重庆市集成示范重点项目（cstc2015jcsf-kjfp80027）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zouxiuping@cric.cn；scchen@cric.cn；Tel：023-68349020）
转基因柑橘外源基因拷贝数的实时荧光定量
PCR 检测
许兰珍，何永睿，雷天刚，彭爱红，姚利晓，姜国金，李 强，邹修平*，
陈善春*
（西南大学/中国农业科学院柑桔研究所，国家柑桔工程技术研究中心，国家柑桔品种改良中心，重庆 400712）
摘 要：为分析转基因柑橘中外源基因整合拷贝数，基于实时荧光定量 PCR 法，建立通用、准确、
简便的转基因柑橘外源基因拷贝数检测体系，利用该体系成功检测了 150 个转基因柑橘单株系外源基因
整合拷贝数。结果表明，转基因柑橘中外源基因整合最低拷贝数为 1，最高达 5 个，其中 1、2 和 ≥ 3
拷贝的单株数分别占总数的 40.0%、18.0%和 42.0%；采用 Southern blot 技术进行检测，结果基本一致，
极少数单株经实时荧光定量 PCR 分析的拷贝数比 Southern blot 检测的数值高。说明本研究建立的实时荧
光定量 PCR 方法检测转基因柑橘外源基因整合拷贝数更加准确可靠。拷贝数为 1 ~ 2 的转基因株系可作为
将来开展转基因目标性状研究及转基因生物安全性评价有利用价值的试验材料。
关键词：柑橘；实时荧光定量 PCR；转基因；拷贝数；Southern blot
中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）06-1186-09

Identification of the Copy Number of Exogenous Gene in Transgenic Citrus
by Quantitative Real-time PCR
XU Lan-zhen，HE Yong-rui，LEI Tian-gang，PENG Ai-hong，YAO Li-xiao，JIANG Guo-jin，LI Qiang，
ZOU Xiu-ping*，and CHEN Shan-chun*
（Citrus Research Institute，Southwest University/Chinese Academy of Agricultural Sciences；National Citrus Engineering
Research Center；National Center for Citrus Varieties Improvement，Chongqing 400712，China）
Abstract：The copy number of exogenous gene is an important factor influencing the expression and
genetic stability of the target gene. Currently，transgene copy numbers by Southern blot，which is laborious
and time-consuming，requires relatively large amounts of plant materials and more experimental
technology. Here，based on quantitative real-time PCR（qRT-PCR）technology，a protocol for estimating
transgene copy number in GM citrus was constructed. The results showed that the low copy number of
exogenous gene in transgenic line was one，and the highest copy number was five. One，two and ≥ three
copies detected accounted for 40.0%，18.0%，42.0%，respectively，of the total. The exogenous gene copy
in the transgenic lines was further confirmed by Southern blot，and the copy number was consistent

许兰珍，何永睿，雷天刚，彭爱红，姚利晓，姜国金，李 强，邹修平，陈善春.
转基因柑橘外源基因拷贝数的实时荧光定量 PCR 检测.
园艺学报，2016，43 (6)：1186–1194. 1187

with the above two methods，although the copy number by qRT-PCR analysis in a few of plants was more
than that by Southern blot. Therefore，the evaluation result with Real-time fluorescent quantitative PCR
method was more accurate and reliable in comparison to that with Southern blot. And transgenic lines with
a copy number of 1–2 could be used as an experimental material for the evaluation of the GMO
bio-safety.
Key words：citrus；quantitative real-time PCR；transgene；copy number；Southern blot

随着规模化、实用化转基因柑橘技术的发展，陆续得到了大量各类柑橘的转基因材料。外源功
能基因在基因组中的整合分析是转基因柑橘材料进行生物安全性评价中必不可少的研究内容。研究
表明，多拷贝外源基因，多数转基因转录后沉默，而单拷贝外源基因很少发生沉默（Tang et al.，2007；
Duan et al.，2010）。目前尽管有许多种成功的转化方法应用于遗传转化，但没有哪种方法可以有效
地可预见性控制外源基因的整合方式，因此，当面对大量转基因柑橘材料时，有必要建立一种有效、
快速、准确、简便的方法来确认外源基因在柑橘基因组中的整合拷贝数。Southern blot 是经典的检
测基因拷贝数的方法，但需要花费大量的试剂和时间，尤其需要大量高质量的基因组 DNA。如 DIG
标记法，首先需要制备数十乃至上百微克高纯度的 DNA 以及较高的转膜效率，其次还要进行探针
标记效率的评价，以获得准确的探针浓度等（许兰珍 等，2013；邹修平 等，2014）。随着 PCR 技
术的日益改进，实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR）已经被许多研究者成功应用于检测
转基因拷贝数，但在转基因柑橘中的应用还很少。
本研究中基于 SYBR Green 荧光染料法实时荧光定量 PCR 技术建立转基因柑橘外源基因整合拷
贝数的检测方法，并利用这一方法成功对 150 份柑橘转基因单株系中外源基因拷贝数进行检测，获
得一批低拷贝整合的转基因单株系，为今后开展转基因柑橘安全性评价提供了有效的实验数据和有
用的材料，更为柑橘生产提供了具有利用价值的转基因新种质。
1 材料与方法
1.1 供试材料及基因组 DNA 的提取
试验于 2013 年 2 月至 2014 年 6 月在中国农业科学院柑桔研究所国家柑桔品种改良中心完成。
用 Aidlab 公司试剂盒（cat. No. DN15）提取柚子、宽皮柑橘、甜橙等不同种类柑橘及 150 个转 Cecropin
B 基因（邹修平 等，2014）柑橘（本实验室经农杆菌介导法转化获得，于温室中保存）叶片 DNA，
1%琼脂糖凝胶电泳检测，以获得纯度高、完整性好且无 RNA 污染的 DNA，微量分光光度计检测各
样品 DNA 浓度，并稀释至 50 ng · μL-1，–20 ℃保存备用。
1.2 引物设计及通用性、特异性检测
参考文献资料，针对柑橘内源脂质转移蛋白基因 LTP（Wu & Burns，2003）、受生长素诱导反
应转录因子 CuAux（岳海林，2001）、铁螯合还原酶基因 CjFR01（GenBank 登录号：DQ98581）、愈
伤组织胚胎发生相关的 LECI-LIKE 基因 CsLIL（朱世平，2009），以及转基因外源功能基因 Cecropin
B（邹修平 等，2014），利用 NCBI 在线软件 primer-BLAST 设计引物（表 1）。


Xu Lan-zhen，He Yong-rui，Lei Tian-gang，Peng Ai-hong，Yao Li-xiao，Jiang Guo-jin，Li Qiang，Zou Xiu-ping，Chen Shan-chun.
Identification of the copy number of exogenous gene in transgenic citrus by quantitative real-time PCR.
1188 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (6)：1186–1194.
表 1 实时荧光定量 PCR 引物
Table 1 Primer pairs for quantitative real-time PCR
基因名称
Gene
引物序列（5′–3′）
Primer sequence
扩增长度/bp
Amplification length
LTP Forward primer：TTTACTTGAGATCGGGCGGC
Reverse primer：AGCAGTTGCATGCAGTTTGG
108
CuAux Forward primer：AGGAAAGGCCTCGTGCTAAC
Reverse primer：GCAGGTGCACTGCTACTGTT
76
CjFR01 Forward primer：ACATCACCGGCTTCATGGTT
Reverse primer：TGGGATTGGGTCTTTCACCG
112
CsLIL Forward primer：CACTGTTTACCTCCACCGCT
Reverse primer：TGCAACACCCAGTGTACGAA
112
Cecropin B Forward primer：GCTAAATGGAAAGTTTTCAAGAAAATCGAG
Reverse primer：ACCAAGAGCTTTAGCTTCACCCAGGACAGC
120

首先采用普通 PCR 对引物的通用性和特异性进行初步检测，然后进行实时荧光定量 PCR，并
对扩增产物进行融解曲线分析。20 μL 反应体系。普通 PCR 反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，
58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 次循环；72 ℃ 10 min。实时荧光定量 PCR 反应条件：95 ℃ 3 min，
94 ℃ 10 s；58 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40 次循环；72 ℃ 10 min。
试验重复 3 次。
1.3 单拷贝转基因株系的筛选
以转抗菌肽 Cecropin B 基因株系 AC9、AC14 为材料（邹修平 等，2014），采用大量提取方法
获得高纯度的叶片总 DNA，将上述转基因植株的总 DNA（50 µg）用 EcoRⅠ、HindⅢ两组限制性
内切酶分别进行酶切，酶切产物转移到尼龙膜上与以 DIG 标记的包含 Cecropin B 基因的特异性探针
进行杂交。
探针标记、杂交以及信号检测等操作按杂交试剂盒（DIG High Prime DNA Labeling and Detection
Starter Kit I，Roche）说明书进行。
1.4 实时荧光定量 PCR 检测转基因拷贝数
用 Real-time PCR 试剂盒（BIO-RAD iQTM SYBR Green Supermix，cat. No.170-8882AP）定量分
析 Cecropin B 基因的拷贝数，以 1.2 节中试验筛选获得的单拷贝基因为内源参照基因，Cecropin B
为外源基因，经 1.3 节试验获得的单拷贝转基因株系为参照因子，对 150 份转 Cecropin B 基因柑橘
单株系（经 PCR 检测为阳性）进行实时荧光定量 PCR 分析，每个样品试验重复 3 次，数据用 Bio-Rad
CFX Manager 2.0 软件进行统计分析。
不同转基因单株系外源 Cecropin B 基因拷贝数，以已知单拷贝转基因植株为对照，采用 2-∆∆Ct
法（Livark & Schmittgen，2001）计算：经内参 CsLIL 基因及外源 Cecropin B 基因均一化处理后，
采用 2-∆∆Ct 法计算转基因植株中 Cecropin B 基因的相对拷贝数，定义已知单拷贝转基因植株对照为
参照因子，即为 1，各样本相对于参照因子拷贝数的倍数为 2-∆∆Ct。
1.5 Southern blot 检测验证转基因拷贝数
随机选取经 1.4 节中初步确认外源基因在转基因植株中的整合拷贝数为 1 的 3 个单株，2、3、4
及 5 个拷贝整合的各 2 个单株为材料，提取叶片 DNA，分别用 EcoRⅠ、HindⅢ 两种限制性内切酶
酶切，进行 Southern blot 检测验证（方法同 1.3）。
许兰珍，何永睿，雷天刚，彭爱红，姚利晓，姜国金，李 强，邹修平，陈善春.
转基因柑橘外源基因拷贝数的实时荧光定量 PCR 检测.
园艺学报，2016，43 (6)：1186–1194. 1189

2 结果与分析
2.1 引物通用性、特异性检测
为了获得在各类转基因柑橘通用的实时荧光定量 PCR 引物，用表 1 中的引物分别对 16 个不同
种类柑橘样品进行 PCR 分析，筛选获得在所有样品中扩增出均一条带的 CsLIL 对应的引物（图 1），
且片段大小与预期一致。



























图 1 引物通用性 PCR 检测
N：ddH2O 为模板；M：DNA 分子 marker；1：马叙葡萄柚；2：日南 1 号；3：奥林达夏橙；4：尤力克柠檬；5：卡里佐枳橙；
6：不知火；7：飞龙枳；8：沙田柚；9：大红袍红橘；10：南丰蜜橘；11：塔罗科血橙；
12：纽荷尔脐橙；13：锦橙；14：资阳香橙；15：东 13 椪柑；16：罗浮金柑。
Fig. 1 PCR analysis of primers transferability
N：ddH2O；M：DNA molecular marker；1：Marsh Grapefruit；2：Nichinan 1；3：Olinda Valencia；4：Eureka Lemon；
5：Carrizo Citrange；6：Shinanui；7：Flying Dragon；8：Shatian Pomelo；9：Dahongpao Tangerine；10：Nanfeng Mandarin；
11：Tarocco（O.L.）；12：Newhall Navel；13：Jincheng Orange；14：Ziyang Xiangcheng（Citrus junos）；
15：Dong 13 Ponkan；16：Oval Kumquat.


进一步利用获得的内参CsLIL基因和外源Cecropin B基因引物进行实时荧光定量PCR及其扩增
产物的融解曲线分析，两对引物均获得惟一的吸收峰（图 2，图 3），结果表明上述两对引物可作为
实时荧光定量 PCR 检测拷贝数的引物。

Xu Lan-zhen，He Yong-rui，Lei Tian-gang，Peng Ai-hong，Yao Li-xiao，Jiang Guo-jin，Li Qiang，Zou Xiu-ping，Chen Shan-chun.
Identification of the copy number of exogenous gene in transgenic citrus by quantitative real-time PCR.
1190 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (6)：1186–1194.
图 3 外源 Cecropin B 基因熔解曲线
Fig. 3 The melting curve of exogenous Cecropin B gene
图 2 CsLIL 基因熔解曲线
Fig. 2 The melting curve of CsLIL gene
图 4 CsLIL 基因的标准曲线
Fig. 4 The standard curve of CsLIL gene
图 5 外源 Cecropin B 的标准曲线
Fig. 5 The standard curve of exogenous Cecropin B gene
















2.2 实时荧光定量 PCR 体系可重复性及灵敏度评价
建立内参基因和外源基因检测的标准曲线，用以评价建立的实时荧光定量 PCR 体系的可重复性
及灵敏度。
结果（图 4，图 5）显示，内参基因及外源基因标准曲线的斜率接近理想值–3.322，相关系数
R2 接近 1.00，说明本研究中建立的实时荧光定量 PCR 体系用于检测转基因中外源基因拷贝数是可
行的。















2.3 单拷贝转基因株系的获得
为获得单拷贝转基因株系作为实时荧光定量 PCR 计算拷贝数的参照因子，将 PC3、PC6 转基因
株系基因组 DNA 用 EcoRⅠ、HindⅢ两种限制性内切酶分别进行酶切。

许兰珍，何永睿，雷天刚，彭爱红，姚利晓，姜国金，李 强，邹修平，陈善春.
转基因柑橘外源基因拷贝数的实时荧光定量 PCR 检测.
园艺学报，2016，43 (6)：1186–1194. 1191















图 6 转基因植株 Southern blot 检测
Fig. 6 Southern blot identification of transgenic citrus plants
Southern blot 检测结果（图 6）显示，PC6
转基因株系基因组DNA在上述两种酶酶切下，
外源抗菌肽 Cecropin B 基因的整合拷贝数表现
为 1 个和 3 个拷贝；PC3 转基因株系均表现为
1 个拷贝整合。
因此，本研究中将 PC3 转基因株系作为实
时荧光定量 PCR 检测拷贝数的参照因子。
2.4 实时荧光定量 PCR 检测转基因柑橘外源
基因整合拷贝数
采用上述建立的实时荧光定量 PCR 体系
对 150 份转基因柑橘单株系进行外源基因整合
拷贝数检测。结果统计，外源基因整合最低拷
贝数为 1，最高整合拷贝数达到 5 个，其中 1
拷贝单株数 60 株，占总转基因株数的 40%；2 拷贝整合 27 株，占总转基因株数的 18.0%；3 拷贝以
上整合的单株数为 63 株，占总转基因株数的 42.0%。
2.5 Southern blot 检测验证
为验证本研究进行的实时荧光定量 PCR 检测转基因拷贝数的准确性，随机选取经实时荧光定量
PCR 初步确认为 1、2、3、4 及 5 拷贝共 11 个独立转基因单株进行 Southern blot 检测（图 7）。
















图 7 Southern blot 检测外源基因整合拷贝数
N：非转基因植株；GA-1 ~ GA-11：转基因植株；1：EcoRⅠ；2：HindⅢ.
Fig. 7 Copy number of exogenous gene in transgenic citrus by Southern blot
N：Non-transgenic plant；GA-1–GA-11：Transgenic plants；1：EcoRⅠ；2：HindⅢ.

与实时荧光定量 PCR 分析结果相比较（表 2），两种方法检测到的外源抗菌肽 Cecropin B 基因
在转基因植株基因组中的整合拷贝数基本一致，其中仅 2 个株系的拷贝数不一致，GA-9 实时荧光
定量 PCR 检测为 4 个拷贝，而 Southern blot 检测为 3 个拷贝；GA-10 实时荧光定量 PCR 检测为 3
Xu Lan-zhen，He Yong-rui，Lei Tian-gang，Peng Ai-hong，Yao Li-xiao，Jiang Guo-jin，Li Qiang，Zou Xiu-ping，Chen Shan-chun.
Identification of the copy number of exogenous gene in transgenic citrus by quantitative real-time PCR.
1192 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (6)：1186–1194.
表 2 实时荧光定量 PCR 与 Southern blot 检测拷贝数结果比较
Table 2 Copy number of exogenous gene in transgenic citrus
by Southern blot and quantitative
real-time PCR
Southern blot 转基因单株编号
Code of transgenic plant
qPCR
EcoRⅠ HindⅢ
GA-5 1 1 1
GA-6 1 1 1
GA-3 1 1 1
GA-4 2 2 2
GA-7 2 2 2
GA-2 5 2 5
GA-1 5 5 2
GA-9 4 3 1
GA-11 4 4 1
GA-8 3 2 3
GA-10 3 2 2

个拷贝，而 Southern blot 检测为 2 个拷贝。
这两个转基因单株实时荧光定量 PCR 检
测外源基因整合拷贝数均多于 Southern blot 检
测的结果，这与其他研究者的试验结果
（Ingham et al.，2001；Weng et al.，2004；杨
立桃 等，2005；杨晓杰 等，2011）一致。说
明本研究中采用的实时荧光定量 PCR 检测转
基因拷贝数的结果与 Southern blot 检测结果基
本一致。
3 讨论
随着规模化、实用化转基因技术的发展，
已经成功陆续得到了大量各种柑橘转基因材料（Gong & Liu，2013；Pinheiro et al.，2014；Zou et al.，
2014；Peng et al.，2015）。实时荧光定量 PCR 检测外源基因拷贝数是近几年迅速发展起来的新方法，
它分为荧光染料法与特异性探针法两种，目前已经建立了大豆、玉米、水稻、番茄、柑橘等许多作
物 Taqman 探针法以检测外源基因拷贝数（Mason et al.，2002；Ding et al.，2004；Omar et al.，2008；
Wen et al.，2012），但其设计探针的费用与 SYBR Green 染色法相比较昂贵，不适合大批量转基因材
料检测。SYBR Green 荧光染料由于灵敏度高、价格低、简单易用，而被广泛采用（冀志庚 等，2011；
杨晓杰 等，2011；Pinheiro et al.，2014；Zhang et al.，2015）。因此，本研究中首先从多个候选基因
中筛选出可通用于多种类转基因柑橘检测拷贝数的内参基因 CsLIL，并进行引物特异性分析，同时
选取确认为单拷贝的转基因植株为参照因子，建立了通用、简便的转基因柑橘外源基因拷贝数 SYBR
Green 荧光染料实时荧光定量 PCR 检测体系，采用该体系检测的转基因拷贝数结果与 Southern blot
检测结果基本一致。
本研究中成功对 150 份转基因柑橘进行了实时荧光定量 PCR 检测，初步得出外源基因的整合特
点，其中以1 ~ 2拷贝整合的所占比例为58.0%，而3拷贝及以上整合的转基因事件发生概率达42.0%，
与文献中报道的以农杆菌介导转化一般外源基因以低拷贝（1 ~ 2）整合为主（占 70%以上），不太
一致。如 Tan 等（2009）对 15 份转基因柑橘采用 Southern blot 分析拷贝数，结果 1 ~ 2 拷贝的单株
达 13 株，占整个转基因植株数的 86.6%；Wen 等（2012）采用 Southern blot 对 26 株转基因柑橘进
行拷贝数分析，结果 1 ~ 2 拷贝整合的占 73%；Zou 等（2014）对 100 份转基因柑橘中的 12 株进行
转基因拷贝数分析，1 ~ 2 拷贝的占 83.3%；Peng 等（2015）对 25 份转基因柑橘分析转基因拷贝数，
Southern blot 结果显示，仅 1 个拷贝的比例就达到 76.0%。而采用实时荧光定量 PCR 检测拷贝数时，
得到低拷贝所占比例要比 Southern blot 检测的低。如 Omar 等（2008）对 34 份转基因柑橘采用实时
荧光定量 PCR 检测转基因拷贝数时，发现 1 ~ 2 拷贝所占比例仅为 20%，而 3 拷贝以上的多拷贝占
了 80%。由此说明采用实时荧光定量 PCR 检测转基因拷贝数更接近其真实值。
本研究中，就单个转基因植株而言，实时荧光定量 PCR 检测的转基因拷贝数常多于 Southern blot
检测的结果，如 GA-9 和 GA-10 单株实时荧光定量 PCR 检测的拷贝数分别为 4 和 3，而采用 Southern
blot 检测的拷贝数分别为 3 和 2。又如杨晓杰等（2011）对转基因棉花外源基因拷贝数的分析，其
中有的株系采用 Southern blot 分析拷贝数结果为 3 个，而采用实时荧光定量 PCR 检测结果为 6 个。
许兰珍，何永睿，雷天刚，彭爱红，姚利晓，姜国金，李 强，邹修平，陈善春.
转基因柑橘外源基因拷贝数的实时荧光定量 PCR 检测.
园艺学报，2016，43 (6)：1186–1194. 1193

另一方面，本研究中在进行 Southern blot 检测时，均采用两组不同的限制性内切酶酶切，在一定程
度上避免了只采用一种酶进行酶切引起拷贝数偏低的情况。分析上述结果，可以推测以农杆菌介导
的柑橘遗传转化存在 T-DNA 串联重复整合现象，即在同一个插入位点有多拷贝的 T-DNA 片段插入
时，转基因植株的基因组在用一种内切酶完全酶切时会产生相似的 DNA 片段，在电泳时难以分辨
清楚，导致 Southern blot 检测拷贝数结果偏低，而采用实时荧光定量 PCR 检测时避免了这种情况的
发生。因此，在进行 Southern blot 分析转基因整合拷贝数时，至少采用两组不同的限制性内切酶进
行酶切，以得到更加准确的结果，不足之处是增加了 Southern blot 检测转基因拷贝数的工作量。
柑橘基因工程育种中关键的一步是从中筛选低拷贝或者单拷贝的转基因株系，以供进一步开展
转基因生物安全性评价试验。本研究中建立的实时荧光定量 PCR 估算转基因拷贝数较 Southern blot
检测简单、快速，且所提供转基因拷贝数的准确度足以满足基因工程育种工作的需求。

References
Ding J Y，Jia J W，Yang L T，Wen H B，Zhang C M，Liu W X，Zhang D B. 2004. Validation of a rice specific gene sucrose phosphate synthase，
used as the endogenous reference gene for qualitative and real-time quantitative PCR detection of transgenes. Journal of Agricultural and Food
Chemistry，52：3372–3377.
Duan Y X，Fan J，Guo W W. 2010. Regeneration and characterization of transgenic kumquat plants containing the Arabidopsis APETALA1 gene.
Plant Cell，Tissue and Organ Culture，100：273–281.
Gong X Q，Liu J H. 2013. Genetic transformation and genes for resistance to abiotic and biotic stresses in Citrus and its related genera. Plant Cell，
Tissue and Organ Culture，113：137–147.
Ingham D J，Beer S，Money S，Hansen G. 2001. Quantitative real-time PCR assay for determing transgene copy number in transformed plants.
Biotechniques，31：132–140.
Ji Zhi-geng，Gao Xue-jun，Ao Jin-xia，Zhang Ming-hui，Huo Nan. 2011. Establishment of SYBR Green-base quantitative real-time PCR assay for
determining transgene copy number in transgenic soybea. Journal of Northeast Agricultural University，42 (10)：11–15. (in Chinese)
冀志庚，高学军，敖金霞，张明辉，霍 楠. 2011. SYBR Green 实时定量 PCR 检测转基因大豆中外源基因拷贝数. 东北农业大学学报，
42 (10)：11–15.
Livark K J，Schmittgen T D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real- time quantitative PCR and the 2-∆∆Ct method. Methods，25：
402–408.
Mason G，Provero P，Vaira A M，Accotto G P. 2002. Estimating the number of integrations in transformed plants by quantitative real-time PCR. BMC
Biotechnology (http：//www.biomedcentral.com/1472-6750/2/20) (online)
Omar A A，Dekkers M G H，Graham J H，Grosser J W. 2008. Estimation of transgene copy number in transformed Citrus plants by quantitative
multiplex real-time PCR. Biotechnology Progress，24：1241–1248.
Peng A H，Xu L Z，He Y R，Lei T G，Yao L Y，Chen S C，Zou X P. 2015. Efficient production of marker-free transgenic‘Tarocco’blood orange
（Citrus sinensis Osbeck）with enhanced resistance to citrus canker using a Cre/loxP site-recombination system. Plant Cell，Tissue and Organ
Culture，123：1–13.
Pinheiro T T，Figueira A，Latado R R. 2014. Early-flowering sweet orange mutant‘x11’as a model for functional genomic studies of Citrus. BMC
Research Notes，7：511.
Tan B，Li D L，Xu S X，Fan G E，Fan J，Guo W W. 2009. Highly efficient transformation of the GFP and MAC12.2 genes into precocious trifoliate
orange（Poncirus trifoliate [L.] Raf），a potential model genotype for functional genomics studies in Citrus. Tree Genetics & Genomes，5：
529–537.
Tang W，Newton R J，Weidner D A. 2007. Genetic transformation and gene silencing mediated by multiple copies of a transgene in eastern white pine.
Journal of Experimental Botany，58：545–554.
Wen L，Tan B，Guo W W. 2012. Estimating transgene copy number in precocious trifoliate orange by TaqMan real-time PCR. Plant Cell，Tissue and
Xu Lan-zhen，He Yong-rui，Lei Tian-gang，Peng Ai-hong，Yao Li-xiao，Jiang Guo-jin，Li Qiang，Zou Xiu-ping，Chen Shan-chun.
Identification of the copy number of exogenous gene in transgenic citrus by quantitative real-time PCR.
1194 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (6)：1186–1194.
Organ Culture，109：363–371.
Weng H B，Pan A H，Yang L T，Zhang C M，Liu Z L，Zhang D B. 2004. Estimating number of transgene copies in transgenic rapeseed by real-time
PCR assay with HMG I/Y as an endogenous refence gene. Plant Molecular Biology Reporter，22 (3)：289–300.
Wu Z，Burns J K. 2003. Isolation and characterization of a cDNA ecoding a lipid transfer protein expressed in‘Valencia’orange during abscission.
Journal of Experimental Botany，54：1183–1191.
Xu Lan-zhen，He Yong-rui，Peng Ai-hong，Lei Tian-gang，Liu Xiao-feng，Zou Xiu-ping，Yao Li-xiao，Chen Shan-chun. 2013. Analysis of the
inheritance and expression of antibacterial peptide gene ShivaA in transgenic citrus（Citrus sinensis）during its asexual propagation. Journal of
Agricultural Biotechnology，21 (7)：820–827. (in Chinese)
许兰珍，何永睿，彭爱红，雷天刚，刘小丰，邹修平，姚利晓，陈善春. 2013. 抗菌肽 ShivaA 基因在转基因柑橘无性繁殖后代中的遗
传与表达分析. 农业生物技术学报，21 (7)：820–827.
Yang Li-tao，Zhao Zhi-hui，Ding Jia-yu，Zhang Cheng-mei，Jia Jun-wei，Zhang Da-bing. 2005. Estimating copy number of transgenes in transformed
rice by real-time quantitative PCR. Chinese Journal of Food Hygiene，17 (2)：140–144. (in Chinese)
杨立桃，赵志辉，丁嘉羽，张承妹，贾军伟，张大兵. 2005. 利用实时荧光定量 PCR 方法分析转基因水稻外源基因拷贝数. 中国食品卫
生杂志，17 (2)：140-144.
Yang Xiao-jie，Liu Chuan-liang，Zhang Chao-jun，Wu Zhi-xia，Zhang Xue-yan，Liu Kun，Fang Wei-ping，Li Fu-guang. 2011. Comparative analysis
of exogenous gene copy numbers in transgenic cotton transformed by different methods. Journal of Agricultural Biotechnology，19 (2)：221–
229. (in Chinese)
杨晓杰，刘传亮，张朝军，武芝霞，张雪妍，刘 坤，房卫平，李付广. 2011. 不同转化方法获得的转基因棉花外源基因拷贝数分析. 农
业生物技术学报，19 (2)：221–229.
Yue Hai-lin. 2007. Cloning and expression of calmodulin and Aux/IAA genes in developing ovariesl fruitlets of pear and citrus，and in citrus somatic
embryogenesis[Ph. D. Dissertation]. Wuhan：Huazhong Agricultural University. (in Chinese)
岳海林. 2007. 钙调素（CaM）和 Aux/IAA 基因克隆及其在柑橘子房/幼果和体细胞胚胎发生中的表达研究[博士论文]. 武汉：华中农业
大学.
Zhang Y W，Liu Y，Zhang J，Wang G Y，Wang J H，Liu Y J. 2015. Assessment of transgene copy number and zygosity of transgenic maize
overexpressing Cry1Ie gene with SYBR Green qRT-PCR. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，51：125–134.
Zhu Shi-ping. 2009. Embryogenic callus induction and the cloning and analysis of LEAFY COTYLEDON 1-LIKE（CsLIL）gene in Citrus [Ph. D.
Dissertation]. Wuhan：Huazhong Agricultural University. (in Chinese)
朱世平. 2009. 柑橘胚性愈伤组织诱导和 LEAFY COTYLEDON 1-LIKE（CsLIL）基因的克隆和分析[博士论文]. 武汉：华中农业大学.
Zou X P，Song E L，Peng A H，He Y R，Xu L Z，Lei T G，Yao L X，Chen S C. 2014. Activation of three pathogen-inducible promoters in transgenic
citrus（Citrus sinensis Osbeck）after Xanthomonas axonopodis pv. citri infection and wounding. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，117：
85–98.
Zou Xiu-ping，Peng Ai-hong，Liu Qi-qi，He Yong-rui，Wang Jun-zheng，Xu Lan-zhen，Lei Tian-gang，Yao Li-xiao，Chen Shan-chun. 2014. Secreted
expression of Cecropin B gene enhances resistance to Xanthomonas axonopodis pv. citri in transgenic Citrus sinensis‘Tarocco’. Acta
Horticulturae Sinica，41 (3)：417–428. (in Chinese)
邹修平，彭爱红，刘琦琦，何永睿，王军政，许兰珍，雷天刚，姚利晓，陈善春. 2014. 分泌型 Cecropin B 抗菌肽基因转化血橙提高其
抗溃疡病水平. 园艺学报，41 (3)：417–428.