全 文 ：
技术与方法

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
中国兰花资源分子标记鉴定研究进展
武海 蹇黎 朱利泉
(西南大学农学与生物科技学院,重庆 400716)
  摘  要:  系统阐述了 RAPD、SSR、RFLP、AFLP和其它几类分子标记在中国兰花种质资源鉴定及遗传多样性研究中的应
用进展。同时指出, 应用分子标记研究兰属植物的遗传多样性对兰属的科学分类及新品种选育等具有指导意义, 并提出
展望。
关键词:  RAPD SSR RFLP AFLP 分子标记 中国兰花
Current Status and Advances in Chinese Orchids
MolecularMarkers Research
WuH ai J ian L i Zhu L iquan
(College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716)
  Abstrac:t  Th is rev iew d iscussed the application of mo lecu la rma rkers ( RAPD、SSR、RFLP、AFLP and othe rs) in the research on
genetic d iversity of orch id. It has gu id ing significance for sc ientific c lassification and breed ing o f orchid. The futu re ofm o lecularm arkers
research in Chinese orch id w as prospec ted.
Key words:  RAPD SSR RFLP AFLP M olecularm arker Ch inese orch id
收稿日期: 2010
03
20
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 39770903) ,贵州省教育厅自然科学研究项目 ( 2007082)
作者简介:武海,男,在读硕士研究生,研究方向:基因组与生物信息学; E
m ai:l wuhai023047@ s ina. com
通讯作者:朱利泉,教授,博士生导师, E
m ai:l zhu liquan@ sw u. edu. cn
中国兰花也称国兰, 是兰科兰属中的一些多年
生草本植物的统称,主要种类有春兰、惠兰、建兰、墨
兰、寒兰等。我国是野生兰花资源大国,约有 173属
1 200多种和大量的变种、品种 [ 1 ]。由于国兰具有独
特的生物学特性,在近几十年来,许多学者都在不断
的对我国兰花资源进行调查、引种驯化、栽培繁殖、
筛选评估和种质资源保存等研究, 目的是对稀少的
野生兰花、兰属、兜兰属等资源进行保护 [ 2 - 7 ]。
分子标记技术是通过直接检测 DNA碱基序列
变异来鉴别研究材料的新型遗传标记。 DNA水平
的遗传多态性表现为核甘酸序列的任何差异。与其
它遗传标记相比,分子标记具有以下优点: ( 1)直接
以 DNA的形式表现,在植物体的各组织、各发育时
期均可检测到,不受季节、环境限制, 不存在表达与
否的问题; ( 2) 数量极多, 遍及整个基因组; ( 3)多
态性较高,自然存在许多等位变异,不需要专门创造
特殊的遗传材料; ( 4)表现为 中性 !, 即不影响目标
性状的表达,与不良性状无必然的连锁; ( 5)有许多
分子标记表现为共显性, 能鉴别出纯合基因型与杂
合基因型,提供完整的遗传信息 [ 8]。依据对 DNA多
态性的检测手段, DNA标记可分为以分子杂交为核
心, 以 PCR技术为核心, 基于 PCR与限制性酶切技
术结合和基于单核甘酸多态性等四大类型 [ 9]。这
四大类 DNA标记都是基于基因组 DNA水平上的多
态性和相应的检测技术发展而来的。
1 几类主要的分子标记
11  RAPD ( random amp lified polymorph ic DNA )
标记
RAPD标记是以基因组 DNA为模板, 以一个随
机寡核甘酸序列 (通常为 10个碱基对 )作引物通过
PCR扩增反应, 产生不连续的 DNA产物,用以检测
DNA 序列的多态性 [ 10, 11]。RAPD技术与经典的
2010年第 9期 武海等 :中国兰花资源分子标记鉴定研究进展
PCR反应相比,具有引物序列短 ( 10 bp) , 复性温度
低 ( 36∀ )以及随机扩增产物的特点。该技术用随
机引物非定点地扩增 DNA片段, 然后用凝胶电泳分
开扩增片段,该方法的优点有: # RAPD技术可以在
对物种没有任何分子生物学研究基础的情况下,对
其进行 DNA多态性分析,构建这些物种的基因指纹
图谱, 并通过统计分析为遗传分析和分类研究提供
DNA分子水平的证据。这是其它方法如 RFLP进行
此类研究所不能达到的。 ∃ 技术简单、快速, RAPD
分析不涉及 Southern杂交、放射自显影或其它技术。
% 成本较低, 因 Operon公司、上海生工等已设计销
售上千个随机引物, 其价格不高。&不需 DNA探
针, 设计引物也不需要知道基因组的序列信息。
∋用一个引物就可扩增出许多片段 (一般一个引物
可扩增几条至十余条片段, 但对某些材料可能不能
产生扩增产物 )不像 RFLP分析。(RAPD分析只
需少量 DNA样品。RAPD标记一般是显性遗传 (极
少数是共显性遗传的 ) , 这样对扩增产物的记录可
记为 有 /无 !,便于数据的统计分析, 但这也意味着
不能鉴别杂合子和纯合子。RAPD分析中存在的最
大问题是重复性和稳定性较差,因为在 PCR反应中
条件的变化会引起一些扩增产物的改变。 )由于存
在共迁移问题,在不同个体中出现相同分子量的条
带后,并不能保证这些条带就是同一条同源的片
段: 同时, 在胶上看见的一条带也可能包含不同的
扩增产物, 因为一般的电泳只能分开不同大小的
片段,而不能分开有不同碱基序列但有相同大小
的片段。
RAPD ( random amp lification polymorph ism DNA )
技术已经在植物品种或种质鉴定,分子系统学研究和
系谱分析,杂交种子遗传纯度鉴定,遗传多样性分析,
体细胞杂种、突变体等的鉴定,连锁图谱的构建,种间
基因流动分析和外源导入基因追踪,基因标记,育种
过程追踪等方面得到了广泛而有效的应用。
12 SSR( simp le sequence repeats)标记
SSR或称为微卫星 ( m icrosate llite)是近年来发
展起的一项新型分子标记, 其基础是动植物基因组
中串联重复 DNA序列重复次数的改变而引起重复
序列 DNA片段大小的变异。随机 SSR引物根据微
卫星重复序列两翼的特定短序列设计, 用来扩增重
复序列本身。一般检测到的是一个单一的多等位基
因位点,重复性高。为了提高分辨率,通常使用聚丙
胺酰凝胶电泳, 它可以检测出单拷贝差异。由于
SSR具有染色体特异性和相当高的多态性, 且大多
数 SSR标记以共显性方式遗传 [ 12 ]。与其它分子标
记相比, SSR标记具有以下优点: ( 1)数量丰富, 覆
盖整个基因组,揭示的多态性高; ( 2)具有多等位基
因的特性, 提供的信息量高; ( 3 )以孟德尔方式遗
传, 呈共显性; ( 4)每个位点由设计的引物顺序决
定,便于不同的实验室相互交流合作开发引物。因
而目前该技术已广泛用于遗传图谱的构建、目标基
因的标定、指纹图的绘制等研究中。
13 PCR
RFLP ( restr ict ion fragmen t leng th polymor

ph ism )标记
RFLP是按孟德尔式共显性标记遗传。用
RFLP标记定位时, 只要有单一序列就可以。由于
能够得到大量的这种 DNA顺序标记,所以对不同物
种 DNA来说,利用其它位点与 RFLP位点的连锁分
析,最终可以得出整个基因组的基因图谱。与传统
遗传标记相比, RFLP标记具有以下优点: # 无表型
效应, RFLP标记的检测不受环境条件和发育阶段
的影响。 ∃ RFLP标记在等位基因之间是共显性
的, 因此在配制杂交组合时不受杂交方式的影响。
%在非等位的 RFLP标记之间不存在上位效应, 因
而互不干扰。RFLP标记源于基因组 DNA的自身变
异, 在数量上几乎不受限制。
RFLP可分为单碱基突变型和结构重排型两大
类。单碱基突变型是由于在限制性内切酶识别位点
上发生了单个碱基替换, 使这一限制性位点丢失或
获得而产生的多态性, 称为点多态性。只要能获得
靠近这些多态性位点的 DNA序列或基因探针,就可
用不同的限制性内切酶检出这类多态性。结构重排
型是由于 DNA序列内部发生较大的顺序变化,结构
重排型还可以进一步分成两类:一类是由于 DNA序
列发生突变引起的,这些突变包括缺失和插入等;另
一类是近年来发现的高变区。高变区由多个串联的
重复顺序组成,一般位于基因的附近,在不同的个体
中高变区所串联的重复顺序拷贝数相差悬殊, 因此
高变区的长度变化很大, 从而使高变区两侧限制性
内切酶识别位点的固定位置随高变区而发生相对位
57
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 9期
移,所以这一类的 RFLP是由于高变区内串联重复
顺序的拷贝数不同所产生的。
14 AFLP ( amplif ied fragment leng th ploymo rph ism )
标记
扩增长度片段多态性 ( amp lified fragment leng th
po lymorph ism, AFLP)是 1992年由荷兰 Keygene公
司的科学家 Zabeau和 Vos发展起来的一种检测
DNA多态性的分子标记方法, 1993年获欧洲专利局
专利 [ 13] , 该方法是继 RFLP、SSR和 RAPD之后发
展最快的 DNA指纹技术,它结合了 RFLP的可靠性
和严格的 PCR退火条件, 有高度特异性, 既克服了
RFLP技术中 Southern杂交的繁琐和耗时的缺点,又
解决了 RAPD等技术中非特异 PCR扩增引起的可
信度问题。基因组 DNA经限制性内切酶双酶切后,
形成分子量大小不等的随机限制性片段, 将特定的
双链接头 ( adaptor)连接在这些 DNA片段的两端,
形成一个带接头的特异片段,通过接头序列 ( adaptor
sequence)和 PCR引物 ( primer) 3∗
末端的选择性碱
基 ( selective extension, ENT )的识别, 扩增那些两端
序列能与选择性碱基配对的限制性酶切片段。通过
聚丙烯酰胺凝胶电泳, 将特异的限制性片段分离开
来,然后利用成像系统和分析软件检测凝胶上 DNA
指纹的多态性。
15 其它分子标记
近年在中国兰花资源鉴定中应用的分子标记还
有 ISSR ( intersimple sequence repeats)和 RMAP( ran

dom m icro
sate llite amplify p loymo rph icDNA)等 [ 14, 15]。
ISSR ( inter
simp le sequence repeats,简单重复序
列区间扩增多态性 )标记技术是 Z ietkiew icz等 [ 16]于
1994年建立的。该技术稳定性好, 多态性高, 试验
操作简便且快速,还可以揭示基因组水平的某些特
征,且呈孟德尔式遗传,因此该技术一经问世就被广
泛用于植物分子水平上的研究。
RMAP ( random m icro
sate llite amplify ploymor

phic DNA )是张永德等 [ 17]在研究朱鹮群体的遗传
多样性时提出的,它是利用随机引物与微卫星引物
的单个引物结合,该方法既能揭示微卫星的多态性,
又能显示 RAPD的多态性, 具有一定的优越性。吴
振兴等 [ 15]利用 RMAP分子标记技术对兰属植物间
亲缘关系的研究是该分子标记首次用于植物亲缘关
系鉴定的报道。
2 分子标记在中国兰花植物资源鉴定中的
应用
21 遗传多样性研究和种质资源评价
在种质资源收集考察时, 遗传多样性的研究与
资源的收集、保存和更新密切相关,而且是种质资源
创新和品种改良的基础。通过遗传多样性检测, 可
以对植物品种遗传变异的大小和遗传结构 (即遗传
变异在品种内和品种间的分布 )进行分析, 进而评
价种质资源的遗传潜力。这对种质资源研究工作的
各个环节如种质资源收集考察, 保存种质资源遗传
完整性,核心种质的筛选以及种质资源的分类等具
有重要的参考价值 [ 8]。
目前,针对 RAPD分析中存在的重复性和稳定
性较差的问题也得到解决。目前,国内外均有报道,
Cho i等 [ 18]在杂交中发现春兰与建兰, 寒兰和墨兰具
较高的亲和性;而与蕙兰、纹瓣兰、鼓褪石解和蝴蝶
兰杂交则无亲和性, 经 RAPD分析发现, 春兰与建
兰、寒兰和墨兰的亲缘关系较近, 与蕙兰和纹瓣兰亲
缘较远, 与石解兰和蝴蝶兰更远。文李等 [ 19] 利用
RAPD技术分析了兰属 5个种 2个变种共 13个品
种间的亲缘关系,从 5种 10个碱基随机引物中筛选
出 4种引物, 扩增出 93条多态性带, 多态率为 100%,
通过聚类分析表明,建兰、墨兰和春兰的亲缘关系较
近, 而春剑、寒兰、独占春和兔耳兰与建兰的亲缘关
系较远。李钧敏等 [ 20]用 RAPD分子标记技术对 30
个西兰花栽培新品种进行分析,结果显示 22个引物
在 30个品种中共扩增出 229条谱带,其中多态性条
带有 109条, 多态位点百分率为 4760%, 表明品种
间丰富的遗传多样性。在栽培品种的鉴定上, 梁红
健等 [ 21]使用 10种 20个碱基引物对 19个中国兰花
品种的基因组 DNA进行扩增, 共产生 83条扩增带,
其中 80条为多态性带。每个兰花品种都有其各自
的扩增带,这种特异的条带可作为品种的分子标记
为其遗传多样性鉴定提供依据。Obara
Okeyo等 [ 22]
利用 RAPD技术对 36个大花蕙兰栽培种进行了品
种鉴定和遗传分析, 利用 OPA
1引物, 可将已混淆
的品种明确地区别出来。高丽等 [ 23]利用 ISSR技术
对湖北 11个野生春兰居群进行遗传多样性分析, 11
个 ISSR引物共扩增出 127位点,其中 112个为多态
58
2010年第 9期 武海等 :中国兰花资源分子标记鉴定研究进展
性位点,表明品种间遗传多样性丰富。
22 亲缘关系研究和品种鉴定
长期以来, 各种兰花由于不同地域的相互引种
栽培, 出现了许多同物异名和同名异物的现象,品种
名和品种分类十分混乱, 而且用传统手段进行杂种
纯度鉴定很费时,而且易受环境条件的影响。因此,
对现有花卉品种准确的鉴定和分析十分重要, 分子
标记技术为品种鉴定提供了新手段并克服许多弊
端。文李 [ 19]用 RAPD技术分析了兰属 ( Cymbidium )
5个种 2个变种共 13个品种间的亲缘关系, 从 55
个随机引物中筛选出 4种引物, 扩增出 93条多态性
带,多态率为 100%, 聚类分析表明,建兰、墨兰和春
兰的亲缘关系较近, 而春剑、寒兰、独占春和兔耳兰
与建兰的亲缘关系较远。明凤等 [ 24]利用筛选到的
25个特异引物对蝴蝶兰不同花色品种作 RAPD分
析,将 12个品种分为 2个家族: 第一家族中包含基
色为白色的花色品种,花蕊颜色略有不同;第二家族
为具有条纹的花色品种; 确定品种间遗传距离最大
为 07832,最小为 01034。这为近缘杂交获得不同
类型的新品种提供了理论依据。梁红健等 [ 21]用
RAPD技术对 19个中国兰花品种的基因组 DNA进
行扩增, 共产生 83条扩增带, 其中 80条为多态性
带。每个兰花品种都有其特有的扩增带可与其它品
种区别开来。Obara
Okeyo等 [ 22 ]利用 RAPD技术对
36个大花蕙兰栽培种进行了品种鉴定和遗传分析,
利用 OPA
1引物,可将已混淆的品种明确地区别出
来。张俊祥等 [ 25]采用 AFLP技术对云南兰属的 14
个种和 3个变种的 38个样本进行亲缘关系分析,在
相似系数 058的水平下, 将 38个样本分成 3组。
吴振兴等 [ 14, 15]先后用 ISSR和 RMAP技术对兰属植
物间亲缘关系进行研究, 所得结论均与前人形态学
分类结论相似,表明这两类分子标记技术均能在分
子水平上对传统兰属分类进行必要补充。
23 遗传图谱构建和辅助育种
遗传图谱构建是对基因组进行系统研究的基
础,也是在分子水平上进行育种的依据。兰花遗传
图谱的构建工作已经开展,谢伟等 [ 26]利用随机扩增
多态 DNA技术 ( RAPD)对兰属的 3个品种春兰、春
剑、蕙兰进行了分析与研究, 建立了它们之间的
DNA指纹图谱,找到了参试样品的特征谱带,并探
讨它们之间的亲缘关系。谭文澄等 [ 27 ]采用分子技
术对兰属 23个样株和石斛兰属 1个样株进行分
析,获得了清晰易读的由 6- 15条带组成有特异
性的遗传指纹图谱。随着分子标记的发展, 也可
以在兰花中产生 RFLP、AFLP、SSR等分子标记的
遗传图谱。
选择是作物育种的重要环节。以往都根据植株
性状的表型进行选择,这种选择对于质量性状或便
于观察的性状是有效的, 但对数量性状或不容易观
测、易受环境影响、表现不稳定的性状来说, 依靠性
状的表型进行选择就比较困难。作为辅助育种的分
子标记可以通过连锁标记对这些性状进行早期间接
选择,可以实现有利基因的定向转移而减少连锁累
赘; 可以实现目的基因的累加和大大缩短育种周期。
利用分子标记进行辅助选择需要一定的前提, 即首
先要有足够的数量性状和质量性状位点;其次位点
与标记有相当紧密的连锁程度; 第三需完善的分子
标记辅助选择的理论和技术。目前, 在花卉中如康
乃馨、亚洲杂交百合等利用分子标记辅助育种相对
比兰花较多一些。这些说明在兰花中利用分子标记
辅助选择育种具有一定的可行性。
3 结语
近年来,分子标记技术已经得到很大的发展,但
利用标记辅助选择育成品系或品种的报道还相对较
少。究其原因主要有: ( 1)功能标记研究尚处于起
步阶段,功能标记的开发利用将更直接的代表性状
的表现; ( 2)标记信息的丢失。标记并不是基因, 由
于重组使标记与基因分离, 导致选择偏离方向。针
对上述现象, 在分子标记研究中需加强以下工作:
( 1)加强新型标记的开发。发展饱和遗传图谱, 寻
找与目的基因紧密连锁的两侧标记, 提高基因型与
表现型的一致性; ( 2)将常规选择与标记辅助选择
相结合, 针对不同性状的特点, 研究高效的选择
方法。
此外, 针对中国兰花品质资源鉴定还大多集中
于形态学标记, 有分子标记鉴定也多是利用 RAPD
标记,鲜有 RFLP、SSR、AFLP、ISSR、RMAPD等分子
标记技术用于兰花品质资源鉴定报道。因此, 结合
国内外已有研究成果,运用多种现代分子生物学和
遗传学手段对我国特有种质资源进行深入研究, 分
59
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 9期
离和鉴定优良性状基因, 将加速培育具有自主知识
产权的中国兰花品种的进程。
参 考 文 献
[ 1] 陈心启, 吉占和. 中国兰花全书 [ M ] . 北京: 中国林业出版社,
2003: 70
99.
[ 2] 杨琪.浅议云南兰科植物种质资源保存和种源基地建设.林业调
查规划, 2002, 27(增刊 ) : 16
19.
[ 3] 李昂,罗毅波,熊治廷,等.三种兰科植物的保护遗传学研究初
探.植物学报, 2001, 44( 2) : 250
252.
[ 4] 罗毅波.中国兰科植物的保护策略.中国林业, 2003, 11: 24
25.
[ 5] 丁慎言,黄少华,赫齐贤.海南:中国野生兰花的宝库.中国花卉
园艺, 2004 ( 2) : 32
33.
[ 6] 关文灵,李枝林,余朝秀,等.云南野生兰花资源的多样性及其引
种驯化.西南农业学报, 2006, 19( 4 ) : 688
691.
[ 7] 刘仲健,刘可为,陈利君,等.濒危物种杏黄兜兰的保育生态学.
生态学报, 2006, 26( 9) : 2791
2800.
[ 8] 贾继增.分子标记种质资源鉴定和分子标记育种. 中国农业科
学, 1996, 29( 4) : 1
10.
[ 9] 方宣钧,刘思衡.品种纯度和真伪的 DNA分子标记鉴定及其应
用.农业生物技术学报, 2000, 8( 2 ) : 106
110.
[ 10 ] W illiam s JG, Kubelik AR, Livak KJ, et a.l DNA polym orph ism s am

pl if ied by arb itrary prim ers are usefu l as gen et ic m ark ers. Nucleic
Acid R es, 1990, 18: 6531
6535.
[ 11 ] W elsh J, M cC lellandM. F ingerprin ting genom es us ing PCR w ith ar

b itrary p rim ers. Nucleic Acid sR es, 1990, 18: 7213
7218.
[ 12 ] DevosKM, M il lian T, G aleMD. Com parative RFLP m aps of th e ho

m oeologous group
2 ch rom osom e of w heat, rye and barley. Theor
App lGenet, 1993, 85: 784
792.
[ 13 ] ZabeauM, Vos P. Selective restriction fragm en t am pl if icat ion: gen

eralm ethod for DNA f ingerprint ing: Fran ce, European PatentA pp li

cat ion 942026297 ( Pub l icat ion No. 0534858A 1 ) [ P] . 1993.
[ 14 ] 吴振兴,王慧中,施农农,等.兰属 Cym bidium 植物 ISSR遗传多
样性分析.遗传, 2008, 30( 5) : 627
632.
[ 15] 吴振兴,施农农,赵艳,等. 应用 RMAPD分子标记技术研究兰
属植物间的亲缘关系. 分子细胞生物学报, 2008, 41 ( 2 ):
145
149.
[ 16] Zietk iew iczE, Rafalsk iA, Labuda D. G enom e fingerprin ting by sim

p le sequence repeat ( SSR )– anchored polym erase cha in reaction
am p lificat ion. G enom ics, 1994, 20: 176
183.
[ 17] 张永德,范光丽,雷初朝, 等.朱鹮随机微卫星扩增多态 DNA
( RMAPD)研究.遗传, 2005, 27( 6 ): 915
918.
[ 18] Choi JY, S o lS, Pak CH, Kw ack BH. R andom ly am p lified polym or

ph ic DNA ( RAPD ) ana lysis on com patib ility of Korean n at ive
Cym bidium goering ii w ith other Cym bid ium species. K orean JH ort
S ciTeach, 1998, 16: 361
363.
[ 19] 文李,叶庆生,王小菁,等利用 RAPD技术分析兰属品种问的亲
缘关系.应用与环境生物学报, 2001, 7( 1) : 29
32.
[ 20] 李钧敏,金则新,柯喜丹.西兰花品种的随机扩增多态 DNA分
析.江苏农业科学, 2006, 4: 66
70.
[ 21] 梁红健,刘敏,钟志宇,等.中国部分兰花品种 RAPD分析.园艺
学报, 1996, 23 ( 4) : 365
370.
[ 22] Obara
Okeyo P, K ako S. G enetic d iversity and iden tif icat ion of
Cym bidium cu lt ivars as reassured by amp lif ied polymorph ic DNA
( RAPD)m arkers. E uphyt ica, 1998, 99: 95
101.
[ 23] 高丽.湖北野生春兰的遗传多样性研究 [ D] .武汉:中国科学院
武汉植物园, 2006.
[ 24] 明凤,董玉光,娄玉霞,等.蝴蝶兰不同花色品种遗传多样性的
RAPD分析.上海农业学报, 2003, 19( 2 ) : 44
47.
[ 25] 张俊祥,李枝林,范成明,等.云南野生兰属主要种间亲缘关系
的 AFLP分析.园艺学报, 2006, 33( 5) : 1141
1144.
[ 26] 谢伟,乐超银,林直,等.兰属品种的 RAPD鉴定和亲缘关系分
析.江苏农业学报, 2005, 21 ( 4 ): 369
373.
[ 27] 谭文澄,方盛国,谢海,等. 兰属植物 DNA指纹图的研究.四川
师范大学学报:自然科学版, 1999, 23( 4 ) : 407
411.
60