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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 1期
抑制消减杂交法分离紫花苜蓿幼苗铝胁迫
诱导表达的 cDNA
樊奇1
王凭青1
杨青川 2
宋文静 1
邓腊梅 1
张宝云 1
( 1重庆大学生物工程学院,重庆 400030; 2中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 农业部畜禽遗传资源与利用重点开放实验室,北京 100193)


摘
要:
利用抑制消减杂交 ( SSH )技术分离铝胁迫诱导紫花苜蓿差异表达的基因, 以水培试验获取的中苜一号幼苗为
材料, 以 80
m o l/L铝离子胁迫的紫花苜蓿作为试验组, 未胁迫的为驱动组,构建了一个包含 456个克隆的 SSH文库。对构建
的文库进行鉴定, 随机选取 20个阳性克隆测序, 共获得 15条有效 EST序列,然后将测序结果提交到 GenB ank进行 B lastn比
对, 获得了 3条未知基因的序列,推测它们可能与植物的抗铝作用有关。检测结果表明, 构建的文库质量较好 ,可以进行进一
步深入研究, 为揭示植物耐铝性的分子机理提供理论基础。
关键词:
紫花苜蓿
铝胁迫
抑制消减杂交
差异表达
Isolation and Cloning of cDNA Induced by A lum inum Stress in A lfalfa
Seedling Using Suppression SubtractiveHybridization
Fan Q i
1
W ang P ingqing1
YangQ ingchuan2
SongW en jing1
Deng Lam ei1
Zhang Baoyun1
(
1
Bioengineering College, Chongq ing Univer sity, Chongqing 400030;
2
K ey Laboratory of Farm Animal Genetic R esources and
Utilization of M inistry of Agriculture, Institute of A nimal Science, Chinese A cademy of Agricultural Sciences, B eijing 100193)


Abstrac:t
The a lum inum stress induced genes o f alfa lfa w ere identified by suppression subtractive hyb rid ization ( SSH ) us ing
Zhongm u NO. 1 cultivar, in the exper im ent, ha lf seed lings w ere stressed in 80
mo l/L alum inum ion stress so lution fo r 24 h as tester,
and anothe r half seedlings were con tinuously cu ltivated in cu lture so lution w ithout A lum inum as drive r. A subtractive cDNA libraryw as
constructed by suppression subtractive hybr id ization ( SSH ), wh ich w as com posed of approx im a tely 456 clones. W e tested cDNA library
through random ly selecting and sequenc ing tw enty c lones, by wh ich 15 ESTs w ere ob tained. W e subm itted the EST sequence to NCBI,
the result o fw hich show ed that three ESTs had no homo logy from NCB I, thus, we suggest that theym ight be invo lved in A l resistance in
p lant. The result show ed that the constructed library perform ed h igh qua lity, wh ich can be used in further study on the a lum inum to le r

ance to prov ide theoretica l basis o f them o lecularm echanism.
Key words:
A lfa lfa
A lum inum stress
SSH
D ifferent expression
收稿日期: 2010
07
19
基金项目:国家科技支撑计划项目 ( 2008BADB3B05) ,现代农业产业技术体系建设专项资金项目 (农科教发 [ 2008] 10号 )
作者简介:樊奇,男,硕士研究生,研究方向:分子遗传学; E
m ai:l fanq i555@ yahoo. com. cn
通讯作者:王凭青,男,博士,研究方向:分子遗传学与基因工程; E
m ai:l w ang_pq@ 21cn. com
铝是地壳中最丰富的金属,在酸性环境中,土壤
中的铝以可溶性的铝离子 (A l3+ )形式存在, 而离子
态的铝对所有的活细胞都具有毒性。铝毒害的最初
反应是抑制铝敏感植物根的生长, 导致植物对水分
和营养的吸收降低 [ 1 ] ,影响植物的生长发育。铝毒
害最容易识别的症状是对根伸长的抑制, 且根尖是
铝毒害的最初位点。因此, 铝毒被认为是酸性土壤
中限制作物生长的主要限制因子, 而我国酸性土壤
的分布遍及南方 15个省区,约占全国可耕地面积的
21%
[ 2]
,筛选和培育耐铝作物是提高酸性土壤中作
物产量的一种经济有效的手段。
近年来,人们对植物铝胁迫的分子应答进行了
大量研究。有研究表明, 将细菌的柠檬酸合成酶基
因转化到烟草和番木瓜植物中,会超量表达柠檬酸,
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 1期
从而提高植物的耐铝性 [ 3]。在拟南芥 [ 4]和芸苔 [ 5]
中,提高柠檬酸合成酶的活性也会伴随植物耐铝性
的提高。酸性土壤中,紫花苜蓿对铝离子极为敏感,
将编码苹果酸脱氢酶的 cDNA转化到紫花苜蓿中,
转基因植物的耐铝性略有提高。然而, 目前的研究
还没有关于稳定遗传的耐铝紫花苜蓿品种的报道。
有一项研究已经在小麦中鉴定出一个耐铝基因
ALMT1(苹果酸盐转运子 1) , 控制苹果酸盐的释
放 [ 6] ,在模式植物拟南芥的研究中, 发现锌指蛋白
STOP1可以协同调控耐铝基因 ALMT的表达 [ 7 ] ,研
究中还未对 STOP1如何激活基因 ALMT1的表达途
径进行鉴定。然而,在植物的耐铝机制研究中,仅少
数耐铝基因被鉴定。随着分子技术的发展, 通过抑
制消减杂交技术筛选铝诱导基因, 将有助于理解铝
胁迫下植物的信号转导途径。
1
材料与方法
1. 1
材料
中苜 1号紫花苜蓿 (M edicago sativa L. cv
Zhong

mu NO. 1
),由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
牧草研究室提供。
1. 2
主要试剂
Trizol总 RNA提取试剂盒购自 B ioTech公司, O li

gotex
dT30< Super> mRNA Purification K it购自 TaKa

Ra公司, PCR
SelectTM cDNA Subtract ion K it购自 C lon

tech公司, Advantage cDNA PCR K it& PolymeraseM ix
购自 C lontech公司, pUM
T PCR产物克隆试剂盒购自
TaKaRa公司,所用化学试剂均为分析级。
1. 3
铝胁迫浓度的筛选
将紫花苜蓿种子用 70%酒精消毒 5 m in, 去离
子水冲洗 5m in, 浸泡在蒸馏水中 4 h,在铺有湿润滤
纸的玻璃皿中 25
黑暗催芽 30 h。 30 h后选取根
长在 0. 8- 1. 2 cm之间的幼苗,并将其转移至盛有
不同浓度 A lC l3 ( 0、40、80、160和 200
mo l/L )的培
养液的试管中,每管植物试验苗 1株,每个浓度梯度
下处理 10株幼苗。之后, 将其整体置于培养箱中
(培养条件: 25
, 16 h光照 /8 h黑暗 ) , 胁迫 3 d后
测量其相对根伸长量。
1. 4
总 RNA的提取和 mRNA的分离
采用 1. 3方法对紫花苜蓿种子进行处理。培养
3 d后, 选取根长在 3. 5- 4. 5 cm之间的幼苗分为两
组,一组转移至 80
mo l/L A lC l3浓度下的培养液中
培养, 另一组仍在无铝的培养液中培养。铝胁迫
24 h后用于 RNA的提取。
按照 Trizol试剂盒提供的方法提取 RNA, 用琼
脂糖凝胶电泳鉴定后溶解于无 RNase超纯水中, 于
- 80
保存备用。利用 O ligo tex mRNA分离试剂盒
从总 RNA中分离 mRNA。
1. 5
抑制消减杂交及 SSH文库的构建
抑制消减杂交具体的试验步骤按照 SSH 试剂
盒说明书进行。其中,未经铝胁迫的根部材料为驱
动组 ( driver) , 而经 80
mol/L A lC l3胁迫的材料为
试验组 ( tester)。将 SSH 得到的 cDNA片段连接到
载体 pUM
T,并转化到大肠杆菌 DH5
中。对阳性克
隆进行菌液 PCR鉴定插入片段, PCR扩增采用通用引
物 M13。随机从文库中挑选 15个阳性克隆送样测序。
1. 6
序列分析与同源性比对
将序列测序的结果, 利用 DNAman5. 0软件获
取目的片段序列。将获得的 EST序列提交到 NCB I,
使用 BLASTN进行序列相似性搜索,并初步推断差
异表达的功能。
2
结果与分析
2. 1
铝胁迫浓度的筛选
测定并统计经不同铝离子浓度胁迫后的苜蓿幼
苗根相对伸长量,对统计的结果进行数据处理,结果
如图 1所示。结果表明, 随着溶液中铝离子浓度的
升高,苜蓿幼苗根的相对生长量逐渐降低,当铝离子
浓度高于 80
mol/L时, 其根生长已基本处于完全
抑制状态。铝迅速抑制苜蓿幼苗根的伸长, 在无铝
培养液中和铝浓度为 80
mol/L的培养液中生长 4
d后根长的对比如图 2所示。
图 1
根相对伸长量与铝浓度的关系
96
2011年第 1期



樊奇等:抑制消减杂交法分离紫花苜蓿幼苗铝胁迫诱导表达的 cDNA
图 2
无铝胁迫与铝胁迫条件下根伸长量对比
2. 2
总 RNA的提取结果检测
提取的紫花苜蓿总 RNA用 1%琼脂糖凝胶电
泳检测,结果如图 3所示, 28S RNA和 18S RNA条
带清晰, 浓度比例符合要求, 表明提取的 RNA完整
性较好,可用于抑制消减杂交筛选差异表达基因。
2. 3
SSH消减文库质量检测
第 2次 PCR扩增结束后, 分别取消减、未消减
和阳性对照第 2次 PCR产物用 2. 0%琼脂糖胶检
测,检测结果 (图 4)显示,第 2次 PCR扩增片段主要
分布在 0. 3- 1. 0 kb之间,呈比较均匀的涂布状,分辨
不出明显的主带,与试剂盒所预期的要求大小符合。
经过两次选择性 PCR富集的消减产物第 2次
PCR产物纯化后克隆入质粒载体 pUM
T,转化大肠
杆菌感受态 DH5
进行文库扩增后共得到一个库容
量为 456的阳性克隆,随机选取其中的 9个, 用通用
引物 M13进行 PCR扩增, 鉴定消减杂交克隆的质
量。电泳结果 (图 5)显示, 8个克隆能够扩增出插
入片段, 插入片段长度主要分布在 200 - 500 bp之
间, 符合试验预期的要求。
图 3
从紫花苜蓿中
提取的总 RNA
M. DNA 分子量标准; C. PCR阳性对照;
UT.未消减产物巢式 PCR扩增结果; T. 消
减产物巢式 PCR扩增结果
图 4
消减产物巢式 PCR扩增结果
M. DNA m ark er; 1
9. 消减 cDNA文库中随机挑选的 9
个克隆菌液 PCR检测插入片段; 9.空载体
图 5
PCR检测消减 cDNA文库克隆插入片段
2. 4
差异表达的 EST序列分析
将 15个阳性克隆送样测序, 测序的结果通过
DNAman软件分析, 获得 15条 EST序列。将获得的
序列提交到 NCB I, 选择 B lASTN进行比对, 检索结
果 (图 6)表明, 有 3条未知基因的序列, 推测它们可
能参与紫花苜蓿的耐铝机制。多数 cDNA片段与已
知的苜蓿基因同源性最高, 如 S
2序列与截形苜蓿
中棉子糖合成酶基因序列的同源性最高, 已有研究
表明, 棉子糖合成酶与植物的逆境胁迫有关。
3
讨论
植物的耐铝性可以被一个基因或多个基因控
制,依赖于植物的种类。例如, 在大麦中耐铝是受到
单个显性基因控制的 [ 8] , 但在玉米中是受到多基因
控制的 [ 9]。水稻是一种耐铝性高的物种,已经从这
个植物中鉴定出几个耐铝的数量性状遗传位点 [ 10] ,
但控制高耐铝性的基因仍未被鉴定。近年来, 许多
研究将有机酸代谢酶转化到植物中, 在部分超表达
编码有机酸代谢酶基因的转基因植物中,植物的耐
铝性得到了显著的提高, 然而在某些研究中发现有
机酸离子的分泌并没有引起耐铝性的提高。例如,
在紫花苜蓿中超表达苹果酸盐脱氢酶 ( MDH )可以
显著地提高植物的耐铝性 [ 11 ]。在水培液或者酸性
土壤中,大麦超表达 ALMT1基因也可以显著地提高
植物的耐铝性 [ 12]。相比之下, 在芸苔中超表达一个
拟南芥线粒体柠檬酸合成酶基因却未引起植物耐铝
性的显著变化 [ 13]。
97
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 1期
S1
11序列
1
TTGCATCGAG CTCGGTACCG GGGATCCTCT AGAGATTGTA TCCACGATTA GCGTGGTCGC GGCCGAGGTA CCTAGGTTTA ATACAATTGC
91 TTATGTATAA ACTTAAAGCA TTGTTTCACC TAA
S2
2序列
1 TGGCATCGAG CTCGGTACCG GGGATCCTCT AGAGATTGTA TCCACGATTC GAGCGGCCGC CCGGGCAGGT TGATTTGTCT CTTATTGGTG
91 TATCTCTGCA TCTGATTGTG TATAACGATC AATTGAAAGA AAAAAATGAG ATATTAGTTG CACCATAAAA
S2
4序列
1 CGAGCGGCCG CCCGGGCAGG TACTAAGAAC GAAAAACGAG GTAATCGGAA AGGGAAGAGA ATTACTTCAA AACCTTAATT AAACAAAGGA
91 AATATTTTTT TTTGTTTTCA ATTAGTACCT CGGCCGCGAC CACGCTGCCC TATAGTGAGT CGTATTAG
图 6
未知基因的序列
紫花苜蓿的耐铝机制的研究和耐铝基因的克隆
一直是研究热点,但是由于苜蓿基因组的复杂性和耐
铝机制的多样性,紫花苜蓿的研究机制还没有被研究
清楚。已有研究利用抑制消减杂交技术,研究铝胁迫
下紫花苜蓿基因的表达情况,却未对筛选的差异表达
基因的生物学功能进行鉴定 [ 14]。本研究筛选出抑制
紫花苜蓿根伸长的最佳铝浓度,应用抑制性消减杂交
技术构建了包含 456个克隆的 SSH文库。从文库中
随机选出 15个阳性克隆送样检测,获得了 15条 EST
序列。对序列进行生物信息学分析,其中有 3条序列
的功能是未知的,推测它们可能参与紫花苜蓿的耐铝
机制,为进一步筛选、克隆紫花苜蓿耐铝性相关的基
因奠定了基础,对研究苜蓿耐铝机制以及苜蓿耐铝的
遗传育种具有重要意义。本研究初期克隆测序的结
果表明,构建的文库质量较好,可进行进一步序列的
克隆测序工作, 对获得的功能未知的序列, 我们将对
其验证,进而对其功能进行鉴定,为揭示紫花苜蓿的
耐铝机制提供一定的科学依据。
参 考 文 献
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(责任编辑
李楠 )
98