全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2008年第3期
收稿日期:2007-11-12
基金项目:国家植物转基因产业化专项“J2002-B-006”,国家863计划“2006AA10Z132”,北京林业大学自选课题资助基金;北京市教育委员
会-北京市学科建设项目
作者简介:姚娜(1982-),女,上海市人,在读硕士,研究方向:草坪生物技术育种;E-mail:yn.yhb2001-2999@163.com
通讯作者:韩烈保(1965-),男,汉族,博士,教授,研究方向:城市绿地节水、草坪管理、草坪草育种等;电话:010-62337982,E-mail:hanlb@tom.com
前言
世界首次转基因草的获得是 Horn在 1988年
转基因鸭茅(DactylisglomerataL.)的成功[1],自此草
的转基因领域不断发展并取得了诸多成果。1992
年苇状羊茅(FestucaarunIdinacea)成为第一个被成
功遗传转化并获得转基因植株的草坪草[2]。之后获
得了转基因的匍匐翦股颖(Agrostispalustris)植株[3]。
接着依次为草甸羊茅(Festucapratensis)[4]、紫羊茅
(Festucarubra)[5]和小糠草(Agrostisalba)[6]。1995年
获得了转基因的多年生黑麦草((Loliumperenn)[7]。
相比于冷季型草坪草,暖季型草坪草由于其再生体
系的建立有一定难度,其转基因操作比冷季型草坪
草难得多。但作为最重要的暖季型草坪草之一的结
缕草(Zoysiajaponica)在 1998年获得转基因植株 [8],
同样草地早熟禾(Poapratensis)转基因植株的获得
也是在 1998年[9]。Li和 Qu[10]及 Zhang等[11]用基因
枪方法对狗牙根(CynodondactylonVar.)进行过遗
传转化。从 1998年开始,柴明良在匍匐翦股颖
(Agrostisstolonifer)、细弱翦股颖(Agrostistenuis)和
结缕草上,以农杆菌为载体,首次获得了转基因的
草坪草[12,13]。日本国立草地研究所和日本草料种子
协会合作,于 2000年报道了 IANG等首次利用农
杆菌介导转化方法感染日本结缕草愈伤组织,获得
转基因植物,结缕草愈伤组织 GUS显色可达到
60%[14]。从第一例草转基因获得成功以来,已陆续
获得了匍匐翦股颖、高羊茅、紫羊茅、多年生黑麦
草、结缕草和草地早熟禾的转基因植株,并且至今
几乎所有主要的草坪草均建立了遗传转化体系。目
前,草坪草的转基因已进入了转抗性基因的时代。
1 再生体系的建立
再生体系的建立是草坪草转基因成功与否的
关键步骤。植物遗传转化主要的再生体系包括原
草坪草转基因育种技术的应用和发展
姚娜 1 韩烈保 1 曾会明 1 徐冰 2
(1北京林业大学草坪研究所,北京 100083;2长江大学园艺园林学院,荆州 430025)
摘 要: 转基因技术在草坪草育种中已得到广泛应用,成为转基因育种的主要手段之一。主要概述了转基因常用
的方法,转基因目标,转基因植株的检测主要方法和步骤,以及现在草坪草转基因面临的主要问题。
关键词: 草坪草 抗性 遗传转化 育种
ApplicationandDevelopmentofTurfgrassBreeding
TransgenicTechnology
YaoNa1 HanLiebao1,2 ZengHuiming1 XuBing2
(1TurfgrassInstituteofBeijingForestryUniversity,Beijing100083;2ColegeofHorticultureandGardeningofYangtze
University,Jingzhou430025)
Abstract: Transgenictechnologyinturfgrasbreedinghasbeenwidelyusedasbreedingtransgeniconeofthe
majormeans.Thispaperoutlinesthetransgeniccommonlyusedmethod,transgenicgoal,thedetectionoftransgenicplants
mainmethodsandsteps,andtransgenicturfgrasnowfacingmajorproblems.
Keywords: Turfgras Resistance Genetictransformation Breeding
2008年第3期
生质体再生系统、悬浮细胞再生系统、愈伤组织再
生系统、直接分化再生系统和生殖细胞再生系统
等[15]。草坪草的转基因研究中,愈伤组织、胚性悬浮
细胞和原生质体是最常用的转化受体。
资料显示,草坪草的重要属种都已成功建立了
再生体系,并找到从原生质体再生出植株的方法。
如黑麦草属[16]、羊茅属[4,5,17~19]、剪股颖属[20]、早熟禾
属[21]、鸭茅属[22]、钝叶草属(Stenotaphrum)[23]、狗牙根
属[24~27]、蜈蚣草属(Eremochloa)[28,29]、雀稗属(Paspalum)[30]、
野牛草属(Buchlo)[31]、结缕草属[32]等。这些为草坪植
物导入基因创造了必要的前提条件。
2 转基因育种目标
2.1 增强草坪草抗性
我国特别是北方地区严重缺水,而且土地盐渍
化现象不断加剧,培育耐旱、抗盐碱的草坪新品种
刻不容缓[33~35]。传统的方法虽然已经筛选出了一些
耐盐、抗旱的品种,但是,这些品种远远不能满足干
旱和盐碱地区对多用途草坪草的需求。选择耐旱、
耐盐性较差、但是其它性状优良的草坪品种,利用
转基因技术或者将抗旱、耐盐的抗性基因或启动子
转入草坪草内,使其整合入草坪草体内或将启动基
因调控的转录因子转入植物体,以提高其耐盐、耐
旱、耐寒的特性,培育出抗旱、耐盐的草坪新品种,
为在干旱地区和盐碱地区种植草坪创造条件[36]。这
样不仅绿化、美化生态环境,而且可以减少草坪灌
溉用水,或用含盐分高的非饮用水进行灌溉[37,38]。
Aswath[39]在匍匐翦股颖上引入了明显提高了抗干旱
和耐盐性的胁迫诱导基因。Devereaux[40]将烟草的
Mn2SOD基因导入多年生黑麦草,并证实 Mn2SOD
在转基因植株中表达,田间试验结果显示出转基
因植株的越冬能力、返青能力比对照植株显著提
高。
2.2 增强抗病虫能力
草坪的病害很多,如腐霉病、全蚀斑病、白粉病
等。这些病害多是由真菌造成的,个别真菌病害会
造成极为严重的损失,如腐霉菌可使整个高尔夫球
场的果领草坪死亡,雪霉菌可以造成几乎整个球道
草坪的死亡。目前,草坪病害主要是通过化学方法、
生物方法等防治,但根本上还是要选择抗病性新品
种。传统的抗病选育方法周期较长,难度大,利用转
基因技术可以将抗病或抗虫基因转入草中,提高草
坪草的抗病虫能力[37,38],在部分草中已有成功转入
抗病虫基因的报道[41,44]。
3 转化方法
3.1 基因枪法
随着基因枪方法的成熟,基因枪法(微粒轰击
法)已成为草坪草转基因的主要方法[45]。此法不受
寄主范围的影响,由于外源基因整合的复杂性,获得
稳定遗传的转基因植株也有较大的困难。利用该方
法已经成功地获得了匍匐翦股颖[46~49]、结缕草[50,51]、
狗牙根[10,11]、草地早熟禾[52,53]、高羊茅[54,55]、多年生黑
麦草[56]、紫羊茅[57]、一年生黑麦草等品种的转基因
植株。
3.2 农杆菌法
农杆菌介导法是一种非常理想的转化方法,转
化效果好,费用相对低廉,操作程序也不复杂,更主
要的是通过此法获得的转基因植株通常仅含 1~3
个拷贝的完整的外源基因,因而可较稳定地表达和
遗传到子代。而且通过此项技术,现在可将大片段
的 DNA(150kb)转入到植物核基因组中。虽然农杆
菌介导法对禾本科单子叶植物不敏感,但近年来已
取得很大进步。郭振飞和卢少云试探用农杆菌介导
法开展结缕草转基因研究并获得初步结果[58]。2002
年柴明良已获得农杆菌介导的转基因匍匐翦股颖
植株[12],国际上已获得农杆菌介导的转基因的日本
结缕草植株[59],近年来本实验室也有人通过农杆菌
法获得了黑麦草转基因植株。
基因枪转化法和农杆菌介导法是目前在草坪
草转基因上最常用的方法。
3.3 硅碳纤维旋涡介导法
转基因的技术还有硅碳纤维旋涡介导的 DNA
转移技术。前者是指将质粒 DNA和长 10~80μm,半
径 0.6μm的硅碳纤维混入悬浮培养细胞,然后进行
旋涡处理,硅碳纤维起显微注射针的作用,使 DNA
导入细胞核。碳化硅纤维介泞转化法操作简便、成
木低,而且能较好地控制转化的 DNA的数量,但也
有不足之处:一是转化后细胞的生活力下降;一是
目前为止转化的受体细胞只限于悬浮细胞[59]。利用
该方法成功地进行了匍匐翦股颖、高羊茅、多年生
黑麦草、一年生黑麦草的基因导入[37]。
姚娜等:草坪草转基因育种技术的应用和发展 67
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
3.4 PEG法、电激法
在基因枪方法发明以前 PEG法和电激法广泛
用于草坪草的转基因研究中。这两种方法都是利用
去除细胞壁的原生质体本身具有摄取外来物质的
特性,经过化学法处理,即聚乙二醇渗透处理,或通
过电激处理,可诱导原生质体摄入外源基因,获得
转基因草坪草[60~64]。
4 转基因草坪草的检测
4.1 转基因草坪草的分子生物学检测
转基因植物的分子鉴定一般包括转基因的整
合、表达和生物功能的检测。通常采用 PCR扩增标
记基因或目的基因序列,对再生的转基因植株进行
初步鉴定。用 Southern杂交分析外源基因在受体染
色体组中的整合情况 (位点及拷贝数)。再用 RT-
PCR、Northern和 Western印迹技术鉴定所转基因的
表达情况。最后,用生物测定技术对转基因产品的
功能进行鉴定[65]。
4.1.1 聚合酶链式反应技术 聚合酶链式反应技
术 (简称 PCR技术)。PCR可扩增 DNA特异性片
段,其特异分析通常依凝胶电泳上的靶片段产物来
评估。由于其具有快速、简便及灵敏等特点,而成为
目前进行转基因产品检测的主要技术之一。PCR技
术有着检测范围广,取样不受组织特异性影响,灵
敏度高等特点在转基因草坪草分子检测中也非常
广泛的被使用[46,51,53,66~69]。
因为 PCR技术非常灵敏,很容易出现假阳性、
假阴性结果。所以,PCR的结果只能初步证明样品
中已转入目的基因,一般而言,还需要通过更加严
密的方法证实目的基因的存在性,排除假阳性情
况。
4.1.2 Southern杂交分析 Southern杂交是以外源
目的基因的同源序列作为探针与转化植株的总
DNA进行杂交。根据这种 DNA样品的杂交片段的
信号强弱,来确定不同转基因个体中的转基因拷贝
数。此外,还有一种基于 PCR的 Southern,即 PCR-
Southern杂交,是一种近年来开始检测外源基因整
合的方法。首先对被检测的材料进行外源基因的
PCR扩增,然后再用目的基因的同源探针与扩增的
特异性条带进行杂交[70]。是目前草坪草转基因检测
中常用的手段。在多年生黑麦草[67,68]、高羊茅[69,71]、
匍匐翦股颖[46]、结缕草[51]和草地早熟禾[53]等转基因
草坪草检测中普遍应用。
4.1.3 Western、northern杂交分析 Southern杂交
是以外源目的基因的同源序列作为探针与转化植
株的总 DNA进行杂交,主要是 DNA水平上的分子
鉴定方法。基因的表达分为转录和翻译两阶段,为
了证明外源基因在转录水平上是否表达的主要检
测方法为 Northern杂交,它是以外源目的基因的同
源序列作为探针与转化植株的总 RNA进行杂交;
为了证明外源基因在翻译水平是否表达,常用
Western杂交。其主要原理是依据外源目的基因的
碱基序列,与含有标记的探针发生同源配对,杂交
后能产生杂交印迹或杂交带的转化植株为转基因
植株;未产生杂交印迹或杂交带的为非转基因植株
或者是转入基因失活或者沉默的转基因植株。现已
用于烟草和枸杞等转基因植物的鉴定中[72],但在草
坪草上的应用还少见报道[57]。
4.2 转基因草坪草的生理检测
因为转基因的目的多种多样,因而相应的测定
生理生化指标也不尽相同。一般对于转抗性基因的
草坪草来说,除了通过表型观察来鉴定转入抗性基
因的植株抗性以外,还要通过生理指标的测定来鉴
定植株的抗性。常用的指标只要是 POD、SOD、
MDA、细胞膜透性、CAT、脯氨酸等,这些生理指标
含量的变化在一定程度上说明了植物体抗性的强
弱,从而说明了转基因植株的抗性[71,73]。李志亮等[71]
在对转入 P5CS基因的高羊茅进行脯氨酸含量的测
定的同时得出转基因植株与对照非转基因植株相
比脯氨酸含量明显提高,因此抗旱性高于对照。
4.3 转基因草坪草子代的遗传检测
转基因植物的成功与否,关键在于外源基因插
入受体植物能否在子代中稳定遗传和表达。外源基
因在子代中常出现基因沉默或丢失现象,为了检验
外源基因在后代中的遗传多样性通常用转基因植
株和非转基因植株杂交,转基因植株和转基因植株
自交产生的后代用 Southernbloting来分析[74]。再结
合表型观察、生理指标的检测来判断转基因植物的
子代是否稳定遗传了所导入的外源基因,并具有这
些外源基因赋予的优良特性。由于外源基因的遗传
存在太多的变化和不可预测性,所以转基因草坪草
68
2008年第3期
子代的稳定遗传仍是转基因草坪草所要解决的关
键问题。在草坪草转基因研究前期,仅匍匐翦股颖
和苇状羊茅有子代遗传稳定性的研究[2,12]。近些年
来其他种类的转基因草坪草后代中也检测到导入
的外源基因。Wang[75,76]等在采用基因枪法和农杆菌
介导法获得的高羊茅转基因后代中观察到,外源基
因能够按照孟德尔分离比正常传递。Zhang,Liu等[77]
在转基因狗牙根的后代中检测到目的基因的存在。
5 结语
由于冷季型草坪草转化后的愈伤组织或分生
组织再生植株的能力较强,遗传转化相对容易,并
且也获得了多种转基因的冷季型草坪草。而暖季型
草坪草转化前已固有的低再生能力,大大降低了转
化的效率,限制的暖季型草坪草的转基因发展。目
前,提高草坪草转基因的效率仍是第一步,要继续
探索哪些细胞或组织更容易转化,是否存在一个转
化效率高的生理阶段,能否进行调控取得较高的转
化效率用于转化的不同组织,是否影响转基因表达
的程度。
另外,目前草坪草的转基因仍停留在小片段基
因的导入,今后转基因的目标之一是朝着引入编码
代谢途径的大片段 DNA,并且避免或减少基因丢
失或沉默现象,使这些多基因性状的功能在转基因
草中有效地表达。转基因育种弥补传统育种缺陷的
同时,将传统育种与转基因育种有效的结合,育成
能稳定遗传的草坪草新品种。另一尝试是将某些抗
性基因转移到叶绿体或线粒体的基因组中去,而不
是转移到核基因中去,这样就可避免由于花粉的途
径,将抗性基因传播到近缘种属的杂草中去[78]。
目前和今后相当长时间是草坪草最重要的育
种阶段,并要把重点向将所育成的品种向商品化和
产业化的转移。
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