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综述与专论

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
实时荧光定量 PCR在猪繁殖与呼吸
综合征病毒研究中的应用
祝秀梅  刘学荣  牟克斌
(中农威特生物科技股份有限公司,兰州 730046)
  摘  要:  猪繁殖与呼吸综合征病毒 ( po rc ine reproduc tive and respiratory syndrom e v irus, PRRSV )是一种严重危害种公猪和
繁殖母猪及其仔猪的一种接触性传染病, 是我国重要猪病病原体之一。建立一种快速、可靠的诊断方法, 对于控制和消灭
PRRSV至关重要。实时荧光定量 PCR技术的发展为 PRRSV在快速检测和鉴别诊断方面开辟了新思路。以下回顾了实时荧
光定量 PCR操作技术在 PRRSV研究应用方面的研究进展,同时提出了该领域目前面临的问题, 并对其未来发展方向进行了
展望。
关键词:  猪繁殖与呼吸综合征病毒 实时定量 PCR 应用
Applications ofReal
time FluorescentQuantitative PCR in Studying
Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome V irus
Zhu X ium ei L iu Xuerong Mu Keb in
(China Agricultural Veterinary B iological Science and T echnology Co, L td. , Lanzhou 730046)
  Abstrac:t  Po rc ine reproductive and resp iratory syndrom e v irus, wh ich is a ser ious hazard boa rs、breed ing sow s and p ig lets conta

g ious d isease, is an im po rtant pathogen o f sw ine diseaseTo estab lish a rap id and re liab le diagnosticm ethods, is essential fo r the contro l
and e radication of PRRSVRea l
tim e quantita tive PCR ( RQ
PCR ) techno logy for rap id de tection and differential d iagnosis of PRRSV
open up new ideasThis rev iew focused on the prog ress of applications o fRQ
PCR in PRRSV, and a lso discussed the problem s con front

ed now and prospec tive aspects in the study of PRRSV
Key words:  PRRSV RQ
PCR App lication
收稿日期: 2010
03
04
作者简介:祝秀梅,女,硕士,主要从事分子生物学研究; E
m a i:l beckyxium e@i 163. com
通讯作者:牟克斌, E
m ai:l m ukb@ chvst. com
实时荧光定量 PCR ( realtime fluoresenet qunat i

tative polymerase cha in reaction, RQ
PCR )技术是在
PCR定性技术基础上发展起来的高灵敏度的核酸
定量技术。该技术于 1996年由美国 Applie B iosys

tem s公司推出, 它作为一种核酸定量的手段, 以其
高灵敏性、高特异性、高精确度、实时性、污染少等优
点,目前已广泛用于分子生物学研究和医学研究等
领域。
1 实时荧光定量 PCR技术原理
所谓荧光定量 PCR技术, 是指在 PCR反应体
系中加入荧光基团, 利用荧光信号积累实时监测整
个 PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定
量分析。一般而言,荧光扩增曲线可以分成 3个阶
段: 荧光背景信号阶段, 荧光背景信号指数扩增阶段
和平台期。由于在荧光信号指数扩增阶段, PCR产
物的对数值与起始模板之间存在线性关系, 因而选
择在这一个阶段进行定量分析。为了定量和比较的
方便,引入了荧光阈值和 C t值。荧光阈值是在荧光
扩增曲线上设定的一个值, 它可以设在荧光信号指
数扩增期的任意位置上, 但一般将荧光阈值的缺损
设置是 3- 15个循环的荧光信号的标准差的 10倍。
C t值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定
2010年第 8期    祝秀梅等:实时荧光定量 PCR在猪繁殖与呼吸综合征病毒研究中的应用
的域值时所经历的循环数, 即 PCR扩增过程中, 荧
光信号开始由于本底进入指数增长阶段的拐点所对
应的循环参数。研究表明, 每个模板的 C t值与该模
板的起始拷贝数的对数存在线性关系, 起始拷贝数
越多, C t值越小。因此利用已知起始拷贝数的标准
品可作出标准曲线, 其中横坐标代表起始拷贝数的
对数, 纵坐标代表 C t值。只要获得未知样品的 C t
值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝
数 [ 1
4]。实时荧光定量 PCR技术分很多种类型, 但
在实际应用中,主要有 SYBR G reen I检测和 TaqM an
探针检测两种方法。
2 实时荧光定量 PCR技术在 PRRSV上的
应用
21 用于 PRRSV定量检测
由于 PRRSV给全世界养猪业造成了巨大的经
济损失,因此如能在早期诊断中加以鉴别,采取相应
的预防治疗措施,对动物群体疫病的防制具有重要
意义, 但常规的诊断方法由于其自身的缺陷很难满
足实际生产的需要。而常规的 PCR也存在自身的
缺点, 如:敏感性低、易出现假阳性、对 PRRSV不能
准确定量等,而实时荧光定量 PCR技术不仅实现了
对 PRRSV的定性,而且还实现了对 PRRSV的定量
检测的要求。
黄娟等 [ 5] 在国内首次建立了快速定量检测
PRRSV的实时 PCR方法, 并用该方法检测患病猪
的肺脏等样品, 具有较高的特异性和重复性, 对
PRRSV细胞培养物的检测下限为 001 TC ID50, 敏
感性比常规 RT
PCR高 100倍;对 10份 PRRS疑似
猪肺脏样品检测 5份为阳性,与病毒分离的阳性符
合率为 100%。该方法具有快速、灵敏、准确、低污
染等优点,在 PRRSV的早期检测、预防控制、进出口
检疫及基础研究中起到重要作用。宋志军 [ 6]等根
据 PRRSV保守基因序列设计合成了引物和探针,建
立了 TaqM an荧光定量 RT
PCR检测方法。同时用
建立的检测方法对组织病料进行了检测, 并与常规
RT
PCR做了对比。结果显示,所建立的 TaqM an荧
光定量 RT
PCR方法灵敏度可达 50 101拷贝 /

L,比常规 RT
PCR灵敏度高 100倍。研究建立的
荧光 RT
PCR方法不仅可用于 PRRSV的临床诊断,
还可用于 PRRSV疫苗效价的评估和致病机理等方
面的研究。
国外和国内建立的检测 PRRSV的 TaqM an荧
光 RT
PCR多数是针对 N基因,并没有针对 M基因
的 TaqM an荧光 RT
PCR检测 PRRSV的报道 [ 7, 8]。
范忠军等 [ 9]根据 M基因设计的引物和探针建立的
荧光 RT
PCR技术具有灵敏、特异和快速等优点, 可
用于 PRRSV的早期检测、预防控制、进出口检疫及
基础研究等,同时解决了此类检测方法所用的 RNA
阳性对照普遍易于降解的难题。王荣等 [ 10]也根据
M基因设计特异性引物建立了 SYBR G reen I实时
定量 PCR检测 PRRSV的方法, 该方法特异性强, 操
作简单,耗时短,只需 3 h即可完成整个试验过程,
可初步用于临床检测。
虽然用荧光定量 PCR检测 PRRSV的方法已有
很多报道,但是关于最近发现的对于 HP
PRRSV的
检测却没有相关报道。针对中国的高致病性猪蓝耳
病, 2008年 X iao等 [ 11 ]建立了专门针对 HP
PRRSV
的荧光定量 RT
PCR方法, 该方法敏感性可达到 1
个 TC ID 50 /mL。但该方法不能检测到经典美洲型
PRRSV, 也不能判定样品是否有经典毒株和高致病
性变异株混合感染。为了弥补这一遗憾, 王小武
等 [ 12]根据 PRRSV GP5蛋白基因序列设计了 2对特
异性引物,应用 SYBR G reen I荧光定量 PCR技术,
建立了检测 PRRSV的定量 PCR方法。该方法具有
很高的敏感性、特异性和重复性,其敏感性可达 1
10
1拷贝 /
L, 与普通 PCR相比, 其灵敏度高约 100
倍, 与其他学者建立的 PRRSV荧光定量 PCR方法
的敏感性处于同一水平, 并且该方法既可用于检测
较早发现 PRRSV毒株, 也可用于检测近期发现的变
异 PRRSV毒株。杨宗照等 [ 13]根据 GenB ank中的高
致病性猪繁殖与呼吸综合征病 (HP
PRRSV )基因组
序列设计特异性引物, 建立一种基于 SYBR G reen I
实时 PCR检测 HP
PRRSV的方法。结果表明,该方
法能够检测到 HP
RPRSV的存在,不与其它猪源病
毒发生非特异性反应, 标准曲线线性范围为 101拷
贝 /反应– 102拷贝 /反应。与常规 PCR方法相比,
两者的符合率 100%。该方法具有快速、简便、敏感
等优点,具有重要的实用价值。郭杨等 [ 14 ]根据高致
病性猪生殖与呼吸综合征病毒 ( PRRSV ) N sp2变异
株 Nsp2基因保守区的核苷酸序列设计合成了引物,
41
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 8期
建立了 Pow er SYBR Green模式的实时荧光定量 RT

PCR方法,用于检测高致病性 PRRSV Nsp2变异株。
结果表明,建立的 N sp2 Pow er SYBR G reen RT
PCR
方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。王秋泉
等 [ 15]应用荧光定量 PCR技术实现高致病性猪繁殖
与呼吸综合征病毒变异株的快速鉴定。用该荧光定
量 PCR检测方法检测高致病性猪繁殖与呼吸综合
征病毒变异株不仅特异性好、灵敏度高, 且快速
简便。
22 用于 PRRSV的鉴别诊断
221 区别欧洲型和美洲型 1987年, PRRSV首
次在美国的北卡罗莱纳州暴发,并在全美迅速蔓延。
根据病毒基因组序列, PRRSV可分为欧洲型和美洲
型,它们的基因组序列差异较大。经学者证实我国
流行的 PRRSV毒株均为美洲型。为了鉴别这两种
抗原型,国外学者 Spagnuo lo
W eaver等在 2000年首
先建立了检测 SYBR G reen I荧光信号的欧洲型和
美洲型 PRRSV的荧光定量 PCR方法。 2001年, Eg

li等 [ 16]建立的 TaqM an荧光定量 RT
PCR方法用于
鉴别检测欧洲型和美洲型 PRRSV, 但是该方法不能
鉴别样品是否为欧洲型和美洲型混合感染。 Chris

toph等 [ 8]建立的 TaqM an RT
PCR法,对美洲毒株和
欧洲毒株混合接种的一群猪进行鉴别诊断, 结果表
明,该方法重复性好、敏感性高、特异性强,可在很短
时间内确诊, 且能避免交叉污染。K leiboeker等 [ 17]
于 2005年建立了同时检测欧洲型和美洲型 PRRSV
的荧光定量 RT
PCR方法, 能够同时检测鉴别欧洲
型和美洲型 PRRSV单一感染或者混合感染。 2008
年, Lurchachaiwong 等评价了以荧光染料 SYBR
Green I和 TaqM an探针为基础的检测鉴别 PRRSV
的荧光定量 RT
PCR方法, 证实这两种方法均有理
想的效果。
222 区别经典株和高致病株 2006年春季以
来,猪 !高热综合征 ∀在我国南方大部分地区流行,
该病流行范围广、传播速度快、持续时间长, 蔓延到
全国大部分地区。经查明导致该疫情的病原是高致
病性 PRRSV。它的基因组结构与经典的 PRRSV有
所不同,主要表现为其 N sp2基因有 90 nt的缺失,此
变异毒株可能对猪有较强的致病性。目前, 国内普
遍流行的猪繁殖与呼吸综合征毒株均属于这两种毒
株类型,且它们引起的临床症状相似,难于区分。鉴
于上述情况,为了快速诊断猪繁殖与呼吸综合征并
区分两种 PRRSV毒株, 建立鉴别诊断方法是十分必
要的检测手段。
柴政等 [ 18]依据基因序列的缺失特征,设计了能
够区分 PRRSV高致病性毒株和经典毒株的特异性
引物,同时根据 PRRSV N蛋白基因高度保守的特点
设计了能同时扩增 2种毒株的通用引物, 用这 2对
引物对 PRRSV高致病性毒株和经典毒株进行 du

plex rea l
tim e PCR扩增, PRRSV高致病性毒株可采
集到 2个荧光信号, 获得 Tm1和 Tm2, 而经典毒株
仅能采集到 1个荧光信号,获得 Tm3,因此能够有效
地鉴别这 2种毒株。刘圆圆等 [ 19]根据该类病毒在
Nsp2基因 1594- 1680处缺失 87个碱基的特点, 设
计引物和探针,建立了荧光定量 PCR检测方法。该
方法不仅特异性强,灵敏度高,能很好地区分高致病
性猪繁殖与呼吸系统综合征病毒和其它病毒, 而且
没有发现假阳性和假阴性现象, 检测病毒滴度达 1
TC ID50,克服了常规检测方法特异性差、敏感性低、
耗时长、操作繁琐等缺点。徐引弟等 [ 20] 参考
PRRSV的 N sp2基因序列,在 N sp2大缺失区下游的
保守区设计了 1条下游引物, 在小缺失区设计 1条
上游引物,用于变异株的扩增。在大缺失区内部设
计 1条上游引物,与变异株共用下游引物,用于普通
株的扩增,建立了 PRRSV变异株与普通株二重 RT

PCR鉴别方法。建立的 RT
PCR方法用于临床病料
的检测,部分阳性结果测序, 变异株序列与报道的序
列同源性在 97%以上。结果表明, 该方法特异、快
速、简便, 可以用于 PRRSV变异株和普通株的鉴别。
郭杨等 [ 21]根据已发表的 PRRSV经典病毒和高致病
性变异 PRRSV的 Nsp2基因序列,设计引物和探针,
建立了 TaqM an荧光定量 RT
PCR检测方法。研究
结果表明, N sp2 T aqM an RT
PCR能对现在流行的高
致病性 PRRSV变异病毒与以往经典毒株进行鉴别
诊断。该方法已成功用于对高致病性变异 PRRSV
( N sp2缺失株 )的检测, 灵敏度高,具实时性和准确
性等特点,还能定量给出高致病性 PRRSV cDNA载
量, 定量检测仅需 75m in,优于现在已有的高致病性
变异 PRRSV ( Nsp2缺失株 )检测方法, 将其应用于
实践可满足对高致病性变异 PRRSV检测的要求。
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2010年第 8期    祝秀梅等:实时荧光定量 PCR在猪繁殖与呼吸综合征病毒研究中的应用
何丹等 [ 22]根据猪繁殖与呼吸综合征病毒 ( PRRSV )
美洲型标准株 VR2332保守序列与近年 PRRSV自
然变异株序列分析研究,设计合成了特异性引物,建
立了可同时检测 PRRSV标准株和 NSP2变异株的
二重 PCR诊断方法。试验结果表明, PRRSV标准
株与变异株二重 PCR诊断方法具有高度特异性、敏
感性和实用性,可用于临床诊断,为目前流行的猪高
热病病原研究提供了一定科学依据。
23 用于混合感染的检测
Chung等已经建立了 PRRSV和 PCV2的实时荧
光 PCR方法, 并分别对自然感染、攻毒猪的脏器进
行了检测。该方法的建立对混合感染的研究无疑是
十分有用的工具,它可以对感染病猪体内的病毒数
精确到个位数,同时还可以动态地监测病原的产生、
持续以及消失的时间。王小武 [ 23]等根据 GenBank
中登录的 PRRSV N蛋白基因、PCV2 rep蛋白基因
和 PRV gE基因的核苷酸序列分别设计特异性引
物,利用多重 SYBR Green I实时荧光 PCR技术对 3
种病原进行了扩增, 建立了同时检测这 3种病原的
多重 SYBR G reen I实时荧光 PCR方法。本试验利
用 Tm值的不同进行核酸片段的区分。该试验成功
建立了同时检测 PRRSV、PCV 2、PRV的多重 SYBR
Green I实时荧光 PCR方法, 结果表明,该方法具有
较好的特异性、重复性和敏感性,为这 3种病原的检
测提供了一种新的方法。成丹等 [ 24] 建立了用于
CSFV与 PRRSV鉴别诊断的复合荧光定量 RT
PCR
方法, 建立了一种能区分 CSFV和北美洲型 PRRSV
的敏感、特异、重复性好的复合荧光定量 RT
PCR鉴
别诊断方法。本方法可以及早对猪瘟和猪繁殖与呼
吸综合征爆发作出准确快速诊断,防止疫情蔓延;以
将 CSFV和 PRRSV感染猪迅速从免疫猪群中筛查
出来并予以清除;该方法敏感、特异、重复性好,分别
可检测到可检测到 36 TC ID50的 CSFV RNA和 18
TCID50的 PRRSV RNA, 与常规 RT
PCR的符合率
均为 994%。
3 存在的问题
虽然实时荧光定量 PCR技术有很多优点, 但随
着应用领域范围的不断扩大,研究的层次不断深入,
它也开始显现出不足。主要有: # 在标准曲线定量
中,标准品的制备是一个必不可少的过程。目前由
于没有统一标准, 各个实验室所用的生成标准曲线
的样品各不相同,致使试验结果缺乏可比性; ∃ 无
法检测到发生在转录后的基因沉默事件中的选择性
剪接或部分转录降解等生物相关进程 [ 25] ; % 自动
化仪器和试剂成本较高; &结果分析的灵敏度及试
验重复性需要提高。
4 展望
RQ
PCR技术自面世以来,短短的几年内就被
广泛应用到生物学的各个领域, 涉及的范围包括
DNA、mRNA和病毒荷载量的定量、核酸多态性分析
等多个领域。它也为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒
开辟了新的途径。该技术不仅实现了对 PRRSV进
行较准确的定量,而且也为 PRRSV与多种疾病混合
感染的诊断提供了一种新的方法。随着 RQ
PCR
技术与生物芯片技术、肽核酸技术,荧光探针定量技
术等先进技术的整合, RQ
PCR应用前景将越来越
广阔。
参 考 文 献
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