全 文 ：生物技术通报
· 综述与专论 · 年增刊
基因工程小分子抗体的研究进展
朱振洪 余勤 万海同
浙江中医药大学生物工程学院 , 杭州
摘 要 随着分子生物学的发展 ,基因工程小分子抗体越来越受到人们 关注 , 该抗体具有分子量小 、结构简
单、 穿透性强 、免疫源性低 、低成本生产的优点 ,并且可与毒素 、放射性核素 、酶、 细胞 因子等结合用 于肿瘤的诊断和
治疗 , 临床应用前景十分广阔。 对基因工程小分子抗体近几年的发展与应用作一综述。
关键词 基因工程 小分子 抗体 肿瘤
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自单克隆抗体技术问世至今 , 单抗已被广泛地
应用于疾病的诊断及治疗中。 但是目前应用的大部
份都是采用杂交瘤细胞分泌的鼠源性单克隆抗体 ,
鼠源性单抗应用于人体中最主要问题是易引起人抗
鼠抗体反应(H A M A ) 。 解决这一问题最理想的途径
就是研制人源化的基因工程抗体 , 即运用 D N A 重组
技术对免疫球蛋白(简称 19 )分子进行人源化改造 。
基因工程抗体按分子结构又可以分为嵌合抗体 、重
构抗体 、单链抗体及单域抗体等 。 其中单链抗体 、单
区抗体等 , 因其大小只有完整 IgG 分子的 F 6 一 F Z ,
故称之为小分子抗体 。 就目前国内外基因工程小分
子抗体的研究进展作一综述 。
1 各种基因工程小分子抗体及其特点
1.1 单链抗体(Single ehain antibody , s e F v )
单链抗体是指在重链 v 区 cD N A S ’端与轻链 V
区 CD N A S ’端之间用一寡聚核甘酸连接 , 在大肠杆
菌中表达成一单链多肤 , 并在细菌体内折叠成只由
重链和轻链可变区构成的一种新型的抗体 , 大小仅
为完整 IgG 的 F 6( 约 28 kD ) , 用于治疗时就可进人
一般抗体不能达到的部位 , 如 G 蛋 白偶联受体、酶
活性部位和病毒表面的腔囊等 。 另外单链抗体的独
特组成是其多肤接头 , 多肤接头可设计为具有特殊
功能的位点 , 如金属赘合 、连接毒素或药物等 , 用于
影像和临床治疗川 。
1
.
2 F a b 片段
Fab 片段主要由 V H 、 C H I 和完整的轻链组成 ,
大小为全抗体的 1/3 (约 55kD ) 。 基因工程构建方
法通常是保留鼠源性的 C DR 区 , 其余换成人源化 ,
通过大肠杆菌以分泌表达的方式表达 L 链和 Fd
链 , 二者能在细菌的外周质腔中折叠成具有一定构
象的 Fah , 该 Fab 具有抗体的活性 。 因为其不含有
Fc 段 、分子量小 、结合力高 、抗原性低 , 故在肿瘤治
疗上有其优越性 。 目前已有多个 Fab 片段药物获得
FD A 批准上市(表 l)[’了。
作者简介:朱振洪(19 7 1一 ) , 男 , 硕士 , 工程师 , 研究方向:基因工程制药 , 电子信箱:zh e汕on gz hu @ yah o .co m .cn
生物杖术通报 刀勿介‘人no lo gy 200 8 年增刊
1.3 单域抗体 (Single dom ain antibody )
天然抗体和上述用基因工程原理生产的抗体 ,
其抗原结合部位都是由重链和轻链的 c DR 联合构
成的。 近年来研究发现单独的 V H 区也具有与抗
原结合的能力 , 且保持了完整抗体的特异性 , 称其单
域抗体 。 单域抗体大小只有完整 IgG 分子的 1/ 12 ,
更比较容易穿人细胞 , 到达完整抗体不能接近的部
位。 在将来 , 这种单域抗体可作为具有抗原特异性
的基本单位 , 用来构建有效应功能和结合亲合性的
抗体 。 但该抗体不稳定 、可溶性差是其应用的最大
限制条件 。
1
.
4 双链抗体 (D iabod y )
由于单价抗体片段 (如 Sc Fv 、 F ab ) 与靶抗原作
用后保留时间短且解离速度快 , 所以在实际应用中
有必要设计多价抗体分子 , 这种多价分子可显示出
与抗原更加强的亲和力和慢的解离速度。 Fa b 和
Sc Fv 片段能够通过化学的或基因工程 Ln ike :构成
二聚体 、三聚体或四聚体。 例如:Fab 就被用化学
Li nk er 连成二价或三价的多聚体 , 实验表明其与抗
原的保持性有所提高〔’〕。
在各种不同的策略中 , 最成功的设计当属通过
缩短单链抗体片段 (SeFv)间的 Linke:长度(o 一 5 氨
基酸残基 ) , 可 以使 V H 与 V L 之间形成配对 , 自我
装配成二价双链抗体(DiabodieS , 约55kD ) 。 这种抗
体比单链抗体在抗原识别和结合方面性能更好 , 在
免疫诊断和免疫治疗方面前景广阔 , 所发临床结果
也是鼓舞人心的(表 2) 图 。
1
.
5 双特异性杭体(Bispeeif e an tibody , B s A b )
双特异性抗体指具有 2 个抗原结合部位 , 一个
结合靶细胞上的特异性抗原 , 另一个结合淋巴细胞
或吞噬细胞等效应物 , 从而导致效应细胞靶向杀灭
肿瘤细胞的抗体片段 。 两条抗原结合臂可分别来自
Fv段 、 F a b 段 、 S e F v 或 dSFv等。 B s A b 一般都是双价
的 ,但也有四价或六价的。 由于该种抗体具有两种
不同抗原的结合能力 , 所以在肿瘤诊断和治疗中的
应用 日益受到重视 。 如 H on em an n等[’J 构建的双特
异抗体 bs cw ue 一 1 x C D 3 在 n 例实验中有 9 例诱导了
原发骨髓瘤细胞由选择性 T 细胞介导的细胞死亡 。
目前已有一种专门治疗 B 细胞瘤的的双特异 ScFv
(作用于 Ep 一C A M 和 CD3 抗原 )已经进人 I期临床
研究 。
2 小分子抗体的药代动力学与生物分布
采用放射性核素标记的单抗 , 不但作为一个非
常重要的肿瘤影像和治疗药物 , 而且还能提供一个
理想的药代动力学评估 。 系统的体内实验表明:分
子量的大小是抗体药代动力学和生物分布的一个重
要参数。 完整的 IgG 分子(约 150kD )与肿瘤表面分
子特异结合后 , 其渗透实体瘤的速度很慢 ,最终的分
布也并不统一 , 并且血清水平中药物的含量高 , 所以
存在相关的毒副作用 。 相反 , 小分子的 sc Fv 片段
(约28kD )却以极快的速度被清除掉 , 且由于其单
价特性而与肿瘤分子的保持性较差 。 较理想的抗体
是中等分子大小的多价分子 (如双链抗体 , Di ab ed y ,
5 5 k D
)
, 该抗体能保持快的组织穿透性 、高的靶向亲
和性和快的血清清除性 。
最近通过 123 1标记的生物分布研究证实 , 双链
抗体(Di ob ad y)具有与很好的肿瘤结合特性 , 又由于
其分子量小 ,能被肾快速地滤过 。 大的双价分子 , 如
M inibodies(SeFv一C H 3 三聚体)能在肿瘤组织中存在
很高的丰度 , 有可能成为理想的肿瘤治疗药物〔’〕。
对于一些代谢较快的小分子抗体 , 可以通过其
他策略来改善其药代动力学 , 如通过 PEG 化的修饰
或血清白蛋 白( H SA )的融合等。 P E G 修饰后 的
Sc Fv 已被证明不但能提高血清半衰期和稳定性 , 而
且还可以增加小分子抗体的抗肿瘤活性和降低免疫
原性 。 例如:将人的抗体 v 区 (约 1 一 1 5 k D ) 与
PEG 相连后 , 大小鼠体内能将其半衰期从 20 m in 延
长至 39 h 。 另外将血清白蛋白与小分子抗体融合后
也能减缓其被代谢清除的速度 , 增强稳定性 。
表 1 抗体及其片段的分子t 与血清半衰期(’】
M in ib od y D iab od V d om ain
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r./2(h) 110 5 6 2 0.05
3 小分子抗体与其他分子连接成融合物
基因工程小分子抗体构建形式灵活多样 , 不仅
能通过减少抗体中的鼠源成分降低免疫原性 , 而且
可以将抗体的部分片段与其它功能性分子 (如毒
年增刊 朱振洪等:基因工程小分子抗体的研究进展
素 、酶 、肤 、蛋白、脂质体、放射性核素等)连接 , 使抗
体除了与抗原结合外 , 还能发挥其他效应分子的生
物学作用 。
3
.
1 与毒素的连接
将抗体片段与细菌或植物毒素连接 , 使其具有
特异性的识别肿瘤细胞的功能 , 并利用毒素来杀伤
肿瘤细胞 。 如 Di Pao lo 等曾将人源化的抗 E p一C A M
的单链抗体 4DSM OC B 与绿脓假单胞外毒素 A
(ETA )融合 , 发现其优先定位在 EpCA M 阳性的肿
瘤细胞 ,并能抑制多种肿瘤在裸鼠体内的生长 , 显示
了良好的应用前景 。 B m el 等也制备了抗 E RFR 的
42 5 (sc Fv) 一E T A 融合蛋白 , 发现其能显著抑制人胰
腺癌细胞在裸鼠体内的生长与转移 。 其进一步的应
用还需要提高抗体片段本身稳定性 、和延缓清除速
度 。
3. 2 与细胞因子连接川
近年来的研究表明 , 将抗体片段与 IL一2 、 I L 一 12
或 GM 一c s F 等免疫刺激因子结合成融合蛋白后 , 能
刺激 T细胞增殖 , 能促使自然杀伤细胞产生溶瘤细
胞作用 。 如 SeFV 一 I n t e rl e u k i n 1 2 ( I L 一 1 2 ) 融合蛋白就
被发现在肺癌模型 中其治疗效果优于单独的 IL 一2 。
但随后发现这种融合蛋白低产量 、不 良的免疫反应
及血管渗漏综合症等 , 极在地限制了其在临床上的
应用 。 血管渗漏综合症(V LS )是由于系统地服用免
疫毒素和细胞因子而引起的副反应 。
3
·
3 与放射性核素的连接困
Sc Fv 偶联放射性核素用于诊断显影有很多报
道 , 如 B egent等用 1231标记的抗 CE A 的抗体 SeFv
应用于病人体内 , 肿瘤部位的显影非常清楚 。 目前
已有一个用于结肠癌显影 的鼠源抗 CEA 的单抗
Fab 与射性核素(T。) 连接药物被 FD A 批准上市 , 另
有多个正在临床前试验之中。
3
.
3 与超抗原的连接
近来小分子抗体与超抗原的连接成为一个热
点 , 如 T 细胞超抗原 SEA 或 B 细胞超抗原 PpL 。 已
有一个 Fab 一 S E A 融合蛋白被 FD A 批准上市 , 另外有
多个正进行 临床试验 , 如针对大肠癌 CZI 5 Fab -
SEA 、结肠癌的 C242 Fab 一SE A , 以及针对肾癌和胰腺
癌的ST4 Fab 一s E A 等川 。
3
.
4 与脂类物质的连接
抗体片段与脂类物质的融合药物 , 可靶向性作
用于树突状细胞 。 又由于抗体片段分子量小 , 能穿
过血脑屏障 ,有效地传送药物至脑 。 例如:抗体 VH
片段 (如 CTL 相关抗原 4 , C T L A 4 ) 能有效地传送融
合抗原至树突状细胞来作为免疫疫苗刺激 。
3
.
5 与酶的连接
另外一个令人兴奋的是小分子抗体与酶连接的
药物 。 抗体片段 (如 , 人源的 ScFv )与酶(如 , b 一半乳
糖昔酶或梭肤酶)进行融合 , 该药物能催化药物前
体的活性 。 体内研究表明 , 该偶联物有很好的生物
分布轮廓 , 并能诱导移植肿瘤的消退 。 抗体的人源
化和酶的非免疫性是该药物免疫原性问题的关键 ,
也是导致临床应用效果好坏的重要因素。
总之 ,具有生物功能的抗体融合分子已成为癌
症有希望的治疗和诊断药物 , 这些融合的蛋白代表
了一群新的免疫治疗分子 , 由于其分子量小 , 组织穿
性强 , 所以相对于常规抗体而言扩大了定位于肿瘤
靶点的范围。
4 小分子抗体的表达
为临床试验大量生产出稳定的 、高亲和力的抗
体片段一直是一个瓶颈 , 很多表达系统如:大肠 、酵
母 、植物 、昆虫和哺乳动物细胞 , 甚至克隆的转基因
动物都被用来进行评估与比较 。 实验比较结果证实
大肠杆菌最适于表达小分子无糖基化的 Fab 、 Sc Fv 、
双链抗体和 V 区片段 。
大多数实验报道大肠杆菌中表达水平 ScF V 高
于 Fab , 在发酵罐中表达水平可达 1酬L , 人的单域抗
体片段(V L 或者说 V H )在毕赤酵母中的摇瓶表达
量可高达 0.5岁L 。 不过为提高生产得率常要采取
一些策略 , 如 c一 M yc 、组氨酸等被加人表达产物未端
便于对表达产物进行亲和纯化;另外使用热诱导表
达系统可 以更加简便而且低成本地扩大生产规模;
Pro te in A 亲和柱在纯化 FC 融合分子上有极大的帮
助 , 而 Pro te in L 亲和柱主要针对 V k一 do m al n 的表达 。
总之哺乳动物细胞和植物细胞适合于表达大分子的
全抗体 , 而细菌和酵母系统在表达小分子抗体片段
方面有优势[s] 。
5 小分子抗体的应用
小分子抗体在临床诊断 、放射自显影 、肿瘤的导
向治疗 、抗感染治疗方面具有广泛的前景 。 另外在
生物杖 术通推 B 勿te ch n口勿盯 2008 年增刊
器官移植 、中毒性疾病和变态反应性疾病方面也有
很大的用途 。
5
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1 在疾病诊疗方面的应用
以标记抗体注人人体内显示肿瘤部位抗原与抗
体结合的放射聚集称放射免疫显像 , 显像效果受抗
体亲和力 、特异性 、半衰期和组织穿透力等因素影
响 。 用鼠源单抗会引起人抗鼠抗体反应 , 从而而导
致显像失败 。 而小分子抗体由于分子量小 、组织穿
透力强 、能很快清除等特点 , 使显像本底低 , 更加适
合放射免疫显像 。
5
.
2 在肿瘤导向治疗中的应用
将小分子抗体与毒性蛋 白(如绿脓杆菌外毒
素、蓖麻毒素及白喉毒素等) , 或是细胞因子 (如白
介素 、肿瘤坏死因子 、干扰素等)融合形成的重组毒
素或免疫毒素可将细胞杀伤效应引导到肿瘤部位 ,
对肿瘤细胞进行直接杀伤或调动机体免疫系统杀伤
肿瘤细胞 。
5
.
3 抗感染作用
对于如 sA R s 、 AI D s 等难以获得相应疫苗或疫
苗效果不理想的病毒感染 , 目前仍缺乏有效的治疗
方法 , 而基因工程抗体却显示出十分广阔应用前景 。
如在治疗 AI DS 方面 , 利用抗体工程技术已成功地
制备出 HI V 病毒整合菌的单链抗体 Sc AbZ 一 1 9 , 对
H w 病毒感染的早期和晚期具有有效的抑制作用 ,
并可望成为 AI D S 基因治疗的有效手段 。
目前已有 18 个单抗药物投人市场 , 超过 10 个
多药物正处于临床试验阶段 。 基因工程抗体已成为
生物技术药物主要的发展方向 , 预计到 2008 年底基
因工程药物占整个生物技术药物市场份额的 30 % ,
达 美金 。 而小份子抗体药物由于能通过基因工程
改造 ,使其人源化程度高、抗原特异性合能力强 、成
本低 、易于与其他分子融合 , 所以在疾病诊断和治疗
上有着广泛的用途 。
表 2 抗体片段在临床前和临床中的应用一览表[’,9. ’”〕
抗体片段/形式 商品名
Fab /嵌合
Fab /羊
Fab /羊
Fab /鼠
Fab /人源化
Fab /P EG 修饰的人源化
Fal〕/ P E C 修饰的人源化
Fal〕/ 人源化
SeFv/人源化
Reopro (Abeixim ab )
CroFab
DigiFab
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适应症
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心血管病
响尾蛇咬伤
Digoxin 过量
结肠癌造影
M aeular degenera tion
inLF恤
JisoxCEA吼哪VG
HerZ/Neu&Cl为4 ( gF e R I )
开发阶段
F D A 批准
FD A 批准
FD A 批准
FD A 批准
FD A 批准
FD A 批准
m 期临床
n 期临床
Comvlement CS 11/ 111期临床
(SeFv)4 融合 Stre Pt avidin TAG 一2 pan eard in om a an tig en I期临床
Sc Fv 融合 b一头抱菌素酶
SeFv 融合 PEG
Di山ody (V H 一V L ) 2
双特异 SeFv(V H 一 V L 一 V H 一 V L )
双特异 SeFv(V H 一 V L 一V H 一 V L )
双特异 SeFv(v H 一 v L 一v H 一 v L )
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临床前
临床前
临床前
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I期临床
临床前
克恩氏病
癌症(抗血管生成治疗)
乳腺癌
冠状动脉分流
为胃肠道恶性肿瘤的
放射免疫治疗探查靶点
黑色素瘤
乳腺癌
卵巢癌和乳腺癌
黑色素瘤(M A P 抗原 )
B 细胞瘤
结肠癌
(下转第70 页)
生物杖 术通报 B to te ch no le舒 B “le 血 2008年增刊
米器件 , 如分子动力装置 、分子开关 、分子导线等 , 将
其应用到医学中 , 研制出智能给药系统 、超灵敏血液
自动检测系统等具有智能化的医学器件 。 成熟的纳
米医药学将在保护人类健康方面发挥巨大作用 。 l 2
参 考 文 献
Dunean , R . P h a
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2 《洲科 , 2 7 3 : 4 8 5 一 4 8 8
l 3
2 R o y al s o e ie t y & R o y a l A e a d e m y o f E n 邵n ee ri n g . N an ose ien ee an d
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总之 , 小分子抗体由于具有结构简单 、分子小 、
穿透性强 、免疫源性低的优点 , 而且还可 以与毒素 、
放射性核素等结合 , 所以在肿瘤的诊断和治疗上具
有独特优势 。 另一个重要特点是小分子抗体能利用
分子生物学手段进行人源化改造 , 并利用大肠杆菌
或酵母系统进行高水平表达 , 操作简便 , 有利于大规
模生产 , 能降低生产成本 。 但是小分子抗体自身也
有一些不足之处 , 如半衰期短 、与靶抗原结合力差
等 , 对于这方面的研究正在深人进行中 , 如人们发现
将 PEG 与小分子抗体连接可大大提高半衰期 , 利用
基因工程技术提高小分子抗体的结合力等 。 相信不
久的将来 , 基因工程小分子抗体会越来越多地应用
于临床 。
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